嚴(yán)凌斌,張祝蘭,陳洲琴,張 引,邱觀榮,連云陽(yáng)
(福建省微生物研究所 福建省新藥(微生物)篩選重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 福州 350007)
子囊霉素(Ascomycin,F(xiàn)K-520)是從鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到的一種二十三元大環(huán)內(nèi)酯類抗生素[1],是一種非常有價(jià)值的多功能藥物[2],具有多種生物活性,如免疫抑制[3]、抗瘧疾[4]、抗真菌、抗痙攣[5]、神經(jīng)再生與恢復(fù)[6]等,已被廣泛應(yīng)用于臨床上治療器官移植排斥反應(yīng)、自身免疫疾病及多種皮膚疾病[7]。除作為活性藥物成分外,子囊霉素也是合成其衍生物吡美莫司的起始成分,由于側(cè)鏈基團(tuán)的變化,該衍生物成為具有增強(qiáng)活性的子囊霉素的替代品,目前用于特應(yīng)性皮炎(輕中度)的一線治療,也可用于銀屑病、脂溢性皮炎和白癜風(fēng)等皮膚炎癥性疾病的治療[8]。
子囊霉素具有廣闊的應(yīng)用及市場(chǎng)前景,但由于其大環(huán)內(nèi)酯結(jié)構(gòu)復(fù)雜、化學(xué)合成困難、副產(chǎn)物多且產(chǎn)量較低,限制了其商業(yè)化生產(chǎn)。目前利用吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)進(jìn)行微生物發(fā)酵是國(guó)內(nèi)外工業(yè)生產(chǎn)子囊霉素的首選工藝。該工藝存在產(chǎn)量較低、成本較高等問(wèn)題,多年來(lái)研究人員一直致力于提高子囊霉素產(chǎn)量的研究工作,現(xiàn)已取得了較大的進(jìn)展[8-11]。作者采用響應(yīng)面法對(duì)子囊霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,經(jīng)Plackett-Burman設(shè)計(jì)(PBD)篩選對(duì)子囊霉素產(chǎn)量有顯著影響的關(guān)鍵變量,采用最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定響應(yīng)面分析中心點(diǎn),再進(jìn)一步利用中心組合設(shè)計(jì)(CCD)與響應(yīng)面分析獲得關(guān)鍵變量的最優(yōu)值,以期提高子囊霉素產(chǎn)量,為其放大生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)FIM-38-24[11],保藏于福建省微生物研究所。
子囊霉素標(biāo)準(zhǔn)品,上海齊奧化工科技;糊精,山東西王糖業(yè);黃豆粉,福建寶佳;酵母粉,安琪酵母;蛋白胨,福建仙游三和生物科技;玉米漿粉,上海緣肽生物技術(shù);BR級(jí)瓊脂粉,廣東環(huán)凱微生物科技;色譜純乙腈,德國(guó)默克;其它試劑均為分析純。
1360B型超凈工作臺(tái),北京亞泰科?。籑IR-253型微生物培養(yǎng)箱,日本三洋;ZHWY-2102型大型恒溫?fù)u床,上海智城分析儀器制造;Allegra X-15R型離心機(jī),美國(guó)BECKMAN;LC-20A型高效液相色譜儀,日本島津。
固體培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基均按文獻(xiàn)[11]方法配制,吸水鏈霉菌FIM-38-24的孢子培養(yǎng)、種子培養(yǎng)及發(fā)酵培養(yǎng)均按文獻(xiàn)[11]方法進(jìn)行。
采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定子囊霉素產(chǎn)量[11]。
1.3.1 PBD實(shí)驗(yàn)
當(dāng)不考慮因素間的交互作用時(shí),PBD是一種用于篩選關(guān)鍵變量的非常有效且快速的方法[12]。采用PBD實(shí)驗(yàn)篩選對(duì)子囊霉素產(chǎn)量有顯著影響的關(guān)鍵變量。以子囊霉素產(chǎn)量為響應(yīng)值,分別在高水平(1)及低水平(-1)下,對(duì)10個(gè)變量(7個(gè)培養(yǎng)基組分和3個(gè)發(fā)酵條件)的顯著性進(jìn)行評(píng)估。PBD實(shí)驗(yàn)各變量的水平與編碼見(jiàn)表1。
表1 PBD實(shí)驗(yàn)各變量的水平與編碼
1.3.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)操作條件的初始估計(jì)值通常與實(shí)際最優(yōu)值存在差距,采用最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定響應(yīng)面分析中心點(diǎn),使初始估計(jì)值快速接近實(shí)際最優(yōu)值。對(duì)于PBD實(shí)驗(yàn)中的一階模型,響應(yīng)面輪廓是一系列平行線。最陡上升的方向是響應(yīng)值增長(zhǎng)最迅速的方向,該方向是垂直于擬合的響應(yīng)面輪廓。最陡爬坡的路徑通常是穿過(guò)垂直于擬合曲面輪廓區(qū)域中心的直線,因此,爬坡路徑的步長(zhǎng)與回歸系數(shù)成正比[13]。最陡爬坡實(shí)驗(yàn)從PBD實(shí)驗(yàn)中變量的低水平開(kāi)始,沿著所計(jì)算的步長(zhǎng)和方向移動(dòng)。
1.3.3 CCD實(shí)驗(yàn)
基于PBD實(shí)驗(yàn)篩選的對(duì)子囊霉素產(chǎn)量有顯著影響的關(guān)鍵變量和最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定的響應(yīng)面分析中心點(diǎn),進(jìn)一步采用CCD與響應(yīng)面分析相結(jié)合的方法優(yōu)化影響子囊霉素產(chǎn)量的關(guān)鍵變量并分析它們之間的交互作用。CCD實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵變量的水平與編碼見(jiàn)表2。
表2 CCD實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵變量的水平與編碼
CCD實(shí)驗(yàn)后,每組數(shù)據(jù)將被擬合到一個(gè)獨(dú)立的二階多項(xiàng)式模型[式(1)]中,計(jì)算二階多項(xiàng)式系數(shù)。通過(guò)Design Expert Version 8.0軟件分析CCD實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),通過(guò)方差分析(ANOVA)解決模型的統(tǒng)計(jì)學(xué)問(wèn)題。
(1)
i,j=1,2,…,k
i≠j
式中:Y為預(yù)測(cè)響應(yīng)值;β0為截距;Xi、Xj均為變量;βi為線性系數(shù);βii為二次系數(shù);βij為交互作用系數(shù)。
表3 PBD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果
將PBD實(shí)驗(yàn)結(jié)果擬合為一階多項(xiàng)式方程:Y=593.25+39.25A+31.25B+2.42C-6.92D-3.42E-2.92F-1.58G-1.75H+0.92I+29.25J,各變量的系數(shù)表示該變量對(duì)子囊霉素產(chǎn)量的影響程度。
PBD實(shí)驗(yàn)的方差分析見(jiàn)表4。
由表4可知,模型的P值為0.031 4,表明模型具有非常良好的顯著性;糊精(A)、黃豆粉(B)、發(fā)酵時(shí)間(J)對(duì)子囊霉素產(chǎn)量有顯著影響(P<0.05);決定系數(shù)R2為0.999 8,說(shuō)明模型具有指導(dǎo)后期設(shè)計(jì)的意義。因此,后續(xù)實(shí)驗(yàn)將選擇糊精、黃豆粉、發(fā)酵時(shí)間作為關(guān)鍵變量進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化,以獲得最大響應(yīng)值。
表4 PBD實(shí)驗(yàn)的方差分析
根據(jù)PBD實(shí)驗(yàn)擬合得到的一階多項(xiàng)式方程確定最陡爬坡實(shí)驗(yàn)的路徑和方向,并進(jìn)一步計(jì)算其步長(zhǎng),結(jié)果見(jiàn)表5。
表5 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果
由表5可知,隨著糊精、黃豆粉含量的增加和發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),子囊霉素產(chǎn)量沿著路徑1到5逐漸升高,在路徑5時(shí)達(dá)到最高(719 mg·L-1),而后沿著路徑5到7逐漸降低。這意味著關(guān)鍵變量的最優(yōu)值接近路徑5實(shí)驗(yàn)值,即糊精75 g·L-1、黃豆粉28 g·L-1、發(fā)酵時(shí)間136 h。
采用CCD設(shè)計(jì)20組實(shí)驗(yàn)對(duì)影響子囊霉素產(chǎn)量的關(guān)鍵變量及其交互作用進(jìn)行分析,結(jié)果見(jiàn)表6。
表6 CCD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果
CCD實(shí)驗(yàn)的方差分析見(jiàn)表7。
由表7可知,模型P值小于0.000 1,說(shuō)明模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可信;模型F值為55.387 57,說(shuō)明模型顯著性良好;模型擬合系數(shù)R2為0.980 3,說(shuō)明模型擬合度較好,可用于分析預(yù)測(cè)子囊霉素的最優(yōu)產(chǎn)量。本實(shí)驗(yàn)的信噪比為19.736(大于4為可取)。
利用三維響應(yīng)面圖和二維等高線圖可以闡明響應(yīng)值與各影響因素相互作用的關(guān)系。在所有圖中,2個(gè)變量在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)線性變化,另一個(gè)變量在中心點(diǎn)處保持不變。在二維等高線圖中,等高線的形狀可用于判斷不同變量間交互作用的顯著性,越偏向橢圓代表交互作用越顯著,越偏向圓形代表交互作用越不顯著[13]。根據(jù)糊精、黃豆粉和發(fā)酵時(shí)間交互作用的響應(yīng)面圖及等高線圖(圖1)并結(jié)合方差分析(表7),發(fā)現(xiàn)糊精與黃豆粉的交互作用、糊精與發(fā)酵時(shí)間的交互作用對(duì)子囊霉素產(chǎn)量的影響均具有顯著性。
(a)糊精與黃豆粉的交互作用 (b)糊精與發(fā)酵時(shí)間的交互作用 (c)黃豆粉與發(fā)酵時(shí)間的交互作用
表7 CCD實(shí)驗(yàn)的方差分析
利用Design Expert 8.0軟件對(duì)統(tǒng)計(jì)模型進(jìn)行分析,并對(duì)回歸方程求導(dǎo),得到影響子囊霉素產(chǎn)量關(guān)鍵因素的理論最優(yōu)值為:糊精75.98 g·L-1、黃豆粉27.79 g·L-1、發(fā)酵時(shí)間138.45 h,在此條件下進(jìn)行3組驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),將結(jié)果與預(yù)測(cè)最優(yōu)值進(jìn)行比較來(lái)確定模型是否有效。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到的子囊霉素平均產(chǎn)量為743 mg·L-1,與預(yù)測(cè)值739.136 mg·L-1基本吻合,表明該模型合理可靠。為便于操作,確定糊精75 g·L-1、黃豆粉28 g·L-1、發(fā)酵時(shí)間138 h,在此優(yōu)化條件下子囊霉素產(chǎn)量較優(yōu)化前提高了46.8%。
通過(guò)PBD實(shí)驗(yàn),確定糊精、黃豆粉和發(fā)酵時(shí)間是影響子囊霉素產(chǎn)量的關(guān)鍵變量,通過(guò)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定響應(yīng)面分析中心點(diǎn),進(jìn)一步采用CCD實(shí)驗(yàn)與響應(yīng)面分析相結(jié)合的方法確定糊精、黃豆粉和發(fā)酵時(shí)間的最優(yōu)值分別為75 g·L-1、28 g·L-1、138 h,在此優(yōu)化條件下子囊霉素產(chǎn)量可達(dá)743 mg·L-1,較優(yōu)化前提高了46.8%。