嚴(yán)凌斌，張祝蘭，陳洲琴，張 引，邱觀榮，連云陽

(福建省微生物研究所 福建省新藥(微生物)篩選重點實驗室，福建 福州 350007)

子囊霉素(Ascomycin，F(xiàn)K-520)是從鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到的一種二十三元大環(huán)內(nèi)酯類抗生素[1]，是一種非常有價值的多功能藥物[2]，具有多種生物活性，如免疫抑制[3]、抗瘧疾[4]、抗真菌、抗痙攣[5]、神經(jīng)再生與恢復(fù)[6]等，已被廣泛應(yīng)用于臨床上治療器官移植排斥反應(yīng)、自身免疫疾病及多種皮膚疾病[7]。除作為活性藥物成分外，子囊霉素也是合成其衍生物吡美莫司的起始成分，由于側(cè)鏈基團的變化，該衍生物成為具有增強活性的子囊霉素的替代品，目前用于特應(yīng)性皮炎(輕中度)的一線治療，也可用于銀屑病、脂溢性皮炎和白癜風(fēng)等皮膚炎癥性疾病的治療[8]。

子囊霉素具有廣闊的應(yīng)用及市場前景，但由于其大環(huán)內(nèi)酯結(jié)構(gòu)復(fù)雜、化學(xué)合成困難、副產(chǎn)物多且產(chǎn)量較低，限制了其商業(yè)化生產(chǎn)。目前利用吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)進行微生物發(fā)酵是國內(nèi)外工業(yè)生產(chǎn)子囊霉素的首選工藝。該工藝存在產(chǎn)量較低、成本較高等問題，多年來研究人員一直致力于提高子囊霉素產(chǎn)量的研究工作，現(xiàn)已取得了較大的進展[8-11]。作者采用響應(yīng)面法對子囊霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進行優(yōu)化，經(jīng)Plackett-Burman設(shè)計(PBD)篩選對子囊霉素產(chǎn)量有顯著影響的關(guān)鍵變量，采用最陡爬坡實驗確定響應(yīng)面分析中心點，再進一步利用中心組合設(shè)計(CCD)與響應(yīng)面分析獲得關(guān)鍵變量的最優(yōu)值，以期提高子囊霉素產(chǎn)量，為其放大生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 實驗

1.1 菌種、試劑與儀器

吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)FIM-38-24[11]，保藏于福建省微生物研究所。

子囊霉素標(biāo)準(zhǔn)品，上海齊奧化工科技；糊精，山東西王糖業(yè)；黃豆粉，福建寶佳；酵母粉，安琪酵母；蛋白胨，福建仙游三和生物科技；玉米漿粉，上海緣肽生物技術(shù)；BR級瓊脂粉，廣東環(huán)凱微生物科技；色譜純乙腈，德國默克；其它試劑均為分析純。

1360B型超凈工作臺，北京亞泰科隆；MIR-253型微生物培養(yǎng)箱，日本三洋；ZHWY-2102型大型恒溫搖床，上海智城分析儀器制造；Allegra X-15R型離心機，美國BECKMAN；LC-20A型高效液相色譜儀，日本島津。

1.2 發(fā)酵方法

固體培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基均按文獻[11]方法配制，吸水鏈霉菌FIM-38-24的孢子培養(yǎng)、種子培養(yǎng)及發(fā)酵培養(yǎng)均按文獻[11]方法進行。

采用高效液相色譜法(HPLC)測定子囊霉素產(chǎn)量[11]。

1.3 發(fā)酵工藝優(yōu)化

1.3.1 PBD實驗

當(dāng)不考慮因素間的交互作用時，PBD是一種用于篩選關(guān)鍵變量的非常有效且快速的方法[12]。采用PBD實驗篩選對子囊霉素產(chǎn)量有顯著影響的關(guān)鍵變量。以子囊霉素產(chǎn)量為響應(yīng)值，分別在高水平(1)及低水平(-1)下，對10個變量(7個培養(yǎng)基組分和3個發(fā)酵條件)的顯著性進行評估。PBD實驗各變量的水平與編碼見表1。

表1 PBD實驗各變量的水平與編碼

1.3.2 最陡爬坡實驗

實驗操作條件的初始估計值通常與實際最優(yōu)值存在差距，采用最陡爬坡實驗確定響應(yīng)面分析中心點，使初始估計值快速接近實際最優(yōu)值。對于PBD實驗中的一階模型，響應(yīng)面輪廓是一系列平行線。最陡上升的方向是響應(yīng)值增長最迅速的方向，該方向是垂直于擬合的響應(yīng)面輪廓。最陡爬坡的路徑通常是穿過垂直于擬合曲面輪廓區(qū)域中心的直線，因此，爬坡路徑的步長與回歸系數(shù)成正比[13]。最陡爬坡實驗從PBD實驗中變量的低水平開始，沿著所計算的步長和方向移動。

1.3.3 CCD實驗

基于PBD實驗篩選的對子囊霉素產(chǎn)量有顯著影響的關(guān)鍵變量和最陡爬坡實驗確定的響應(yīng)面分析中心點，進一步采用CCD與響應(yīng)面分析相結(jié)合的方法優(yōu)化影響子囊霉素產(chǎn)量的關(guān)鍵變量并分析它們之間的交互作用。CCD實驗關(guān)鍵變量的水平與編碼見表2。

表2 CCD實驗關(guān)鍵變量的水平與編碼

CCD實驗后，每組數(shù)據(jù)將被擬合到一個獨立的二階多項式模型[式(1)]中，計算二階多項式系數(shù)。通過Design Expert Version 8.0軟件分析CCD實驗數(shù)據(jù)，通過方差分析(ANOVA)解決模型的統(tǒng)計學(xué)問題。

(1)

i,j=1,2,…,k

i≠j

式中：Y為預(yù)測響應(yīng)值；β0為截距；Xi、Xj均為變量；βi為線性系數(shù)；βii為二次系數(shù)；βij為交互作用系數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 PBD實驗結(jié)果(表3)

表3 PBD實驗設(shè)計與結(jié)果

將PBD實驗結(jié)果擬合為一階多項式方程:Y=593.25+39.25A+31.25B+2.42C-6.92D-3.42E-2.92F-1.58G-1.75H+0.92I+29.25J，各變量的系數(shù)表示該變量對子囊霉素產(chǎn)量的影響程度。

PBD實驗的方差分析見表4。

由表4可知，模型的P值為0.031 4，表明模型具有非常良好的顯著性；糊精(A)、黃豆粉(B)、發(fā)酵時間(J)對子囊霉素產(chǎn)量有顯著影響(P<0.05)；決定系數(shù)R2為0.999 8，說明模型具有指導(dǎo)后期設(shè)計的意義。因此，后續(xù)實驗將選擇糊精、黃豆粉、發(fā)酵時間作為關(guān)鍵變量進行進一步的優(yōu)化，以獲得最大響應(yīng)值。

表4 PBD實驗的方差分析

2.2 最陡爬坡實驗結(jié)果

根據(jù)PBD實驗擬合得到的一階多項式方程確定最陡爬坡實驗的路徑和方向，并進一步計算其步長，結(jié)果見表5。

表5 最陡爬坡實驗設(shè)計與結(jié)果

由表5可知，隨著糊精、黃豆粉含量的增加和發(fā)酵時間的延長，子囊霉素產(chǎn)量沿著路徑1到5逐漸升高，在路徑5時達到最高(719 mg·L-1)，而后沿著路徑5到7逐漸降低。這意味著關(guān)鍵變量的最優(yōu)值接近路徑5實驗值，即糊精75 g·L-1、黃豆粉28 g·L-1、發(fā)酵時間136 h。

2.3 CCD實驗結(jié)果

采用CCD設(shè)計20組實驗對影響子囊霉素產(chǎn)量的關(guān)鍵變量及其交互作用進行分析，結(jié)果見表6。

表6 CCD實驗設(shè)計與結(jié)果

CCD實驗的方差分析見表7。

由表7可知，模型P值小于0.000 1，說明模型具有統(tǒng)計學(xué)意義，實驗數(shù)據(jù)可信；模型F值為55.387 57，說明模型顯著性良好；模型擬合系數(shù)R2為0.980 3，說明模型擬合度較好，可用于分析預(yù)測子囊霉素的最優(yōu)產(chǎn)量。本實驗的信噪比為19.736(大于4為可取)。

2.4 響應(yīng)面交互作用分析

利用三維響應(yīng)面圖和二維等高線圖可以闡明響應(yīng)值與各影響因素相互作用的關(guān)系。在所有圖中，2個變量在實驗范圍內(nèi)線性變化，另一個變量在中心點處保持不變。在二維等高線圖中，等高線的形狀可用于判斷不同變量間交互作用的顯著性，越偏向橢圓代表交互作用越顯著，越偏向圓形代表交互作用越不顯著[13]。根據(jù)糊精、黃豆粉和發(fā)酵時間交互作用的響應(yīng)面圖及等高線圖(圖1)并結(jié)合方差分析(表7)，發(fā)現(xiàn)糊精與黃豆粉的交互作用、糊精與發(fā)酵時間的交互作用對子囊霉素產(chǎn)量的影響均具有顯著性。

(a)糊精與黃豆粉的交互作用 (b)糊精與發(fā)酵時間的交互作用 (c)黃豆粉與發(fā)酵時間的交互作用

表7 CCD實驗的方差分析

2.5 最優(yōu)發(fā)酵條件的確定

利用Design Expert 8.0軟件對統(tǒng)計模型進行分析，并對回歸方程求導(dǎo)，得到影響子囊霉素產(chǎn)量關(guān)鍵因素的理論最優(yōu)值為：糊精75.98 g·L-1、黃豆粉27.79 g·L-1、發(fā)酵時間138.45 h，在此條件下進行3組驗證實驗，將結(jié)果與預(yù)測最優(yōu)值進行比較來確定模型是否有效。驗證實驗得到的子囊霉素平均產(chǎn)量為743 mg·L-1，與預(yù)測值739.136 mg·L-1基本吻合，表明該模型合理可靠。為便于操作，確定糊精75 g·L-1、黃豆粉28 g·L-1、發(fā)酵時間138 h，在此優(yōu)化條件下子囊霉素產(chǎn)量較優(yōu)化前提高了46.8%。

3 結(jié)論

通過PBD實驗，確定糊精、黃豆粉和發(fā)酵時間是影響子囊霉素產(chǎn)量的關(guān)鍵變量，通過最陡爬坡實驗確定響應(yīng)面分析中心點，進一步采用CCD實驗與響應(yīng)面分析相結(jié)合的方法確定糊精、黃豆粉和發(fā)酵時間的最優(yōu)值分別為75 g·L-1、28 g·L-1、138 h，在此優(yōu)化條件下子囊霉素產(chǎn)量可達743 mg·L-1，較優(yōu)化前提高了46.8%。