劉向紅，季乃云

(1.中國(guó)科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所，山東 煙臺(tái) 264003；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

木霉(Trichodermaspp.)在分類學(xué)上屬于子囊菌門，是世界性分布的絲狀真菌。該屬真菌能夠通過(guò)重寄生、產(chǎn)生抗性分子、競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)和空間、誘導(dǎo)植物抗性等作用機(jī)制抑制植物病原真菌，是重要的農(nóng)業(yè)生防真菌資源，受到廣泛關(guān)注[1-2]。木霉次生代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)多樣，涵蓋萜類、甾體類、聚酮類、生物堿類、肽類等多種類型[3]。近年來(lái)，作者所在課題組[4-10]開(kāi)展了海洋來(lái)源木霉次生代謝產(chǎn)物的系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)了一系列分子多樣性豐富、生物活性良好的天然產(chǎn)物分子。藻棲真菌桔綠木霉(Trichodermacitrinoviride)A-WH-20-3是從松節(jié)藻科海洋紅藻岡村凹頂藻(Laurenciaokamurai)中分離得到的一株內(nèi)生真菌。2020年，作者[9]曾對(duì)其次生代謝產(chǎn)物的化學(xué)成分進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)了2個(gè)新的環(huán)橙花烷倍半萜衍生物和一個(gè)新的苯基異香豆素衍生物，在此對(duì)其次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步研究。在批量發(fā)酵的基礎(chǔ)上，用有機(jī)溶劑提取獲得粗提物；利用硅膠柱層析、RP-18反相硅膠柱層析、Sephadex LH-20凝膠柱層析、制備薄層層析、高效液相色譜等手段從粗提物中分離獲得一個(gè)新化合物；利用一維/二維核磁共振、高分辨質(zhì)譜、紅外光譜等譜學(xué)技術(shù)對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定；并對(duì)其生物活性進(jìn)行測(cè)試。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

硅膠柱層析填料(100～200目、200～300目)、薄層層析(TLC)硅膠檢測(cè)板、制備薄層層析硅膠(GF254)，青島海洋化工廠；反相硅膠柱層析填料RP-18，YMC公司；凝膠柱層析填料Sephadex LH-20，GE公司。

高效液相色譜洗脫劑，色譜純；其余有機(jī)試劑均為分析純，上海國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司。

SGW-3型旋光儀；Nicolet iS50型紅外光譜儀；Bruker Avance Ⅲ 500型核磁共振儀(1HNMR為500 MHz,13CNMR為125 MHz)；Agilent G6230 TOF型質(zhì)譜儀、高效液相色譜儀(1260 infinity四元泵，1260 infinity二極管陣列檢測(cè)器，Eclipse SB-C18反相柱)，Agilent公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株發(fā)酵

桔綠木霉A-WH-20-3的菌株信息、發(fā)酵條件均參照文獻(xiàn)[9]。

1.2.2 發(fā)酵產(chǎn)物的分離

桔綠木霉A-WH-20-3發(fā)酵產(chǎn)物的初步分離參照文獻(xiàn)[9]。在批量發(fā)酵的基礎(chǔ)上，用有機(jī)溶劑提取獲得粗提物；組分Fr.5經(jīng)RP-18反相硅膠柱層析(洗脫劑甲醇-水，體積比為9∶11)、Sephadex LH-20凝膠柱層析(洗脫劑甲醇)、制備薄層層析(展開(kāi)劑二氯甲烷-甲醇，體積比為10∶1)及高效液相色譜[流動(dòng)相乙腈-水，體積比為(1～2)∶3，梯度洗脫]分離，得到一個(gè)新化合物(9.5 mg)。

1.2.3 新化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

運(yùn)用HR-ESI-MS、IR、HSQC、1HNMR、13CNMR、COSY、HMBC等譜學(xué)技術(shù)對(duì)新化合物的結(jié)構(gòu)和相對(duì)構(gòu)型進(jìn)行鑒定。

1.2.4 新化合物的生物活性測(cè)試

參照文獻(xiàn)[5,10]方法測(cè)試新化合物的抗弧菌活性及抑微藻活性。抗弧菌活性測(cè)試實(shí)驗(yàn)的供試弧菌為副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、鰻弧菌(V.anguillarum)、哈維氏弧菌(V.harveyi)和燦爛弧菌(V.splendidus)；抑微藻活性測(cè)試實(shí)驗(yàn)的供試微藻為東海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)、赤潮異灣藻(Heterosigmaakashiwo)、海洋卡盾藻(Chattonellamarina)和劇毒卡爾藻(Karlodiniumveneficum)。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

HR-ESI-MS譜給出的加鈉離子峰m/z為225.146 2[M+Na]+(計(jì)算值為C11H22O3Na,225.146 7)，提示其分子式為C11H22O3，不飽和度為1。

IR譜在νmax為3 386 cm-1、2 935 cm-1、2 883 cm-1、2 855 cm-1、1 617 cm-1、1 450 cm-1、1 384 cm-1、1 031 cm-1、965 cm-1處有吸收峰，其中3 386 cm-1處的吸收峰提示分子中可能存在羥基，1 617 cm-1處的吸收峰提示分子中可能存在雙鍵，965 cm-1處的吸收峰提示分子中存在反式雙鍵。

結(jié)合HSQC譜的分析，13CNMR數(shù)據(jù)(DMSO-d6中，表1)顯示11個(gè)碳信號(hào)，根據(jù)DEPT信號(hào)，分別歸屬于2個(gè)甲基、4個(gè)亞甲基(含1個(gè)連氧)、5個(gè)次甲基(含2個(gè)連氧、2個(gè)sp2)，其中低場(chǎng)處δC124.0和δC131.6的次甲基信號(hào)提示存在一個(gè)雙鍵基團(tuán)。1HNMR數(shù)據(jù)(DMSO-d6中，表1)顯示2個(gè)甲基雙峰，4個(gè)多重峰分別對(duì)應(yīng)1個(gè)氧化亞甲基和2個(gè)氧化次甲基，2個(gè)雙重峰和1個(gè)三重峰對(duì)應(yīng)3個(gè)活潑氫，2個(gè)多重峰對(duì)應(yīng)2個(gè)烯氫。通過(guò)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道的化合物(3S,5S,8E)-1,3,5-trihydroxy-8-decene的波譜數(shù)據(jù)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)新化合物多1個(gè)甲基(C-11)和1個(gè)次甲基(C-2)、少1個(gè)亞甲基。因此，初步推斷新化合物為1,3,5-trihydroxy-8-decene的甲基化衍生物。

表1 新化合物的13CNMR(125 MHz)和1HNMR(500 MHz)數(shù)據(jù)(DMSO-d6和CD3OD)

COSY譜(圖1)顯示，甲基(C-11)和次甲基(C-2)相關(guān)，提示它們直接相連。HMBC譜(圖1)顯示，甲基(C-11)與C-1、C-2、C-3相關(guān)，提示異丁基基團(tuán)的存在。COSY譜顯示，OH-1/H-1相關(guān)和OH-3/H-3相關(guān)，提示1,3-二羥基異丁基單元的存在，鑒于H-3/H-4/H-5/H-6/H-7相關(guān)，該結(jié)構(gòu)單元被延伸至C-7，并且OH-5/H-5相關(guān)提示C-5連接1個(gè)羥基基團(tuán)。剩余部分的連接性通過(guò)HMBC譜中H-6與C-8相關(guān)、H-7與C-8、C-9相關(guān)、H-10與C-8、C-9相關(guān)確證。此外，HMBC譜中OH-1與H-1、H-2相關(guān)，OH-3與H-2、H-3、H-4相關(guān)，OH-5與H-4、H-5、H-6相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)了新化合物為2-甲基癸-8-烯-1,3,5-三醇。

圖1 新化合物的關(guān)鍵COSY和HMBC相關(guān)

與文獻(xiàn)[11]比對(duì)發(fā)現(xiàn)，C-8(δC131.6)和C-9(δC124.0)的化學(xué)位移提示該雙鍵具有反式構(gòu)型，這與IR譜中965 cm-1處吸收峰歸屬一致。

13CNMR數(shù)據(jù)(DMSO-d6和CD3OD中，表1)中C-3和C-5的化學(xué)位移提示與它們相連的2個(gè)羥基基團(tuán)為反式(anti-diol)[12]。將1HNMR數(shù)據(jù)(CD3OD中，表1)與已知化合物heptantetrol的數(shù)據(jù)[13]進(jìn)行比對(duì)，確定手性中心C-2與C-3的相對(duì)構(gòu)型。因此，新化合物的相對(duì)構(gòu)型為2S*、3S*、5R*、8E，命名為(2S*,3S*,5R*,8E)-2-甲基癸-8-烯-1,3,5-三醇，其結(jié)構(gòu)式如圖2所示。

圖2 (2S*,3S*,5R*,8E)-2-甲基癸-8-烯-1,3,5-三醇的結(jié)構(gòu)式

2.2 生物活性測(cè)試

弧菌是海水養(yǎng)殖中重要的病原微生物，而海洋赤潮微藻引起的有害藻華也嚴(yán)重威脅著近海水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。因此，對(duì)新化合物(2S*,3S*,5R*,8E)-2-甲基癸-8-烯-1,3,5-三醇進(jìn)行了抗弧菌和抑微藻活性測(cè)試，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 (2S*,3S*,5R*,8E)-2-甲基癸-8-烯-1,3,5-三醇的抗弧菌和抑微藻活性

由表2可知，新化合物(2S*,3S*,5R*,8E)-2-甲基癸-8-烯-1,3,5-三醇在用量為50 μg/片時(shí)對(duì)哈維氏弧菌和燦爛弧菌均具有弱抗菌活性，抑菌圈直徑分別為6.0 mm和7.5 mm；在用量為100 μg·mL-1時(shí)對(duì)赤潮異灣藻具有較強(qiáng)的抑制作用，抑制率達(dá)到85%。

3 結(jié)論

從海洋紅藻岡村凹頂藻內(nèi)生的一株桔綠木霉A-WH-20-3的次生代謝產(chǎn)物中分離得到一個(gè)三醇類新化合物，運(yùn)用現(xiàn)代譜學(xué)鑒定技術(shù)，確定其為(2S*,3S*,5R*,8E)-2-甲基癸-8-烯-1,3,5-三醇。當(dāng)其用量為50 μg/片時(shí)對(duì)哈維氏弧菌和燦爛弧菌具有弱抗菌活性，抑菌圈直徑分別為6.0 mm和7.5 mm；當(dāng)其用量為100 μg·mL-1時(shí)對(duì)赤潮異灣藻具有較強(qiáng)的抑制作用，抑制率達(dá)到85%。