黃朝 柯遠(yuǎn) 張娜瑤 晁倩文

漿水菜是我國陜西、甘肅、山西、河南等地的一種傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜，具有調(diào)理腸胃、提高食欲等諸多益生功效。漿水發(fā)酵過程包含著復(fù)雜的微生物群系，其中最主要的發(fā)酵菌群為乳酸菌。隨著對(duì)乳酸菌研究的不斷深入，許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)其具有調(diào)整胃腸道菌群平衡、提高食物消化率等功效，因此將其廣泛用于發(fā)酵食品的加工過程，以此提高食品的品質(zhì)及風(fēng)味。

雖然近年來我國科研人員對(duì)漿水這一傳統(tǒng)發(fā)酵食品的研究逐漸深入，但主要集中于對(duì)菌群情況的研究，針對(duì)漿水中乳酸菌開發(fā)新產(chǎn)品的報(bào)道并不多見。本研究以陜西西安周邊農(nóng)村為采樣地點(diǎn)，從傳統(tǒng)發(fā)酵漿水中分離篩選出乳酸菌，觀察并研究其形態(tài)、生長特性，進(jìn)行乳酸菌的分子生物學(xué)鑒定。通過對(duì)蕨麻的處理，選用合適的添加比例以及處理方式，從而研制出一款具有保健作用的蕨麻鷹嘴豆乳酸菌飲品。

一、材料與儀器

1.食品原料。市售的蕨麻和鷹嘴豆，白砂糖、三氯蔗糖、α-淀粉酶（購于某公司），以上原輔料均為食品級(jí)。乳酸菌菌株：發(fā)酵乳桿菌XIMC-9分離自陜西農(nóng)村的漿水菜，本實(shí)驗(yàn)室保存，于2021年5月24日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)為CGMCCNO.22525;MRS培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司。

2.設(shè)備。20L發(fā)酵罐、水浴鍋、pH計(jì)、離心機(jī)、超凈臺(tái)、豆?jié){機(jī)、調(diào)配罐、包裝機(jī)、分析天平、顯微鏡、移液槍、恒溫生化培養(yǎng)箱、PCR儀。

二、操作與方法

1.工藝原理。乳酸菌對(duì)蕨麻汁、鷹嘴豆豆?jié){進(jìn)行發(fā)酵，生產(chǎn)出風(fēng)味獨(dú)特、營養(yǎng)豐富、具有保健作用的蕨麻鷹嘴豆乳酸菌飲品。

2.工藝流程。原料檢驗(yàn)——蕨麻磨漿——酶解離心——添加鷹嘴豆豆?jié){——配料及標(biāo)準(zhǔn)化——滅菌——冷卻——接種——攪拌——保溫發(fā)酵——調(diào)味——灌裝——裝箱——冷藏——檢驗(yàn)——出廠。

3.操作要點(diǎn)。（1）漿水菜乳酸菌的分離與鑒定。①乳酸菌的分離。在無菌操作臺(tái)取新鮮漿水菜液體10mL，轉(zhuǎn)移至90mL的無菌生理鹽水中并混合均勻，依次進(jìn)行10倍的梯度稀釋到1×10-8，用移液槍吸取1×10-6、1×10-7、1×10-8這3個(gè)梯度的稀釋液各100μL于固體培養(yǎng)基MRS中，每個(gè)稀釋度平行3個(gè)平板。在恒溫生化培養(yǎng)箱中倒置平板，在37℃條件下恒溫培養(yǎng)48h，挑取表面具備乳酸桿菌特性的菌落，接種到MRS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng);重復(fù)上述步驟，然后進(jìn)行革蘭氏染色試驗(yàn)鏡檢，確定革蘭氏陽性菌株為純菌株后，再活化一代。利用這樣的方法培養(yǎng)2次，得到在液體培養(yǎng)基中較純的乳酸菌菌種。把最后得到的乳酸菌菌種放在MRS液體培養(yǎng)基中，放入4℃冰箱保存待用。

②乳酸菌的鑒定。對(duì)獲得的乳酸菌菌株進(jìn)行分子鑒定。使用引物序列27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測序由陜西省微生物研究所菌種資源研究中心完成。將基因序列在NCBI上通過BLAST進(jìn)行比較分析，利用CLUSTALX軟件和MEGA3.1軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，并構(gòu)建目標(biāo)菌株與參比菌株之間的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

（2）蕨麻的處理工藝及操作要點(diǎn)。①蕨麻汁澄清的工藝流程。挑選直徑為5-10mm且相對(duì)規(guī)則的蕨麻，清洗后浸泡12-14h。使用豆?jié){機(jī)破壁磨漿后用紗布過濾，再由α-淀粉酶催化分解淀粉，然后高速離心，即可獲得澄清的蕨麻汁。

②操作要點(diǎn)。把存在病蟲害的蕨麻去掉，用干凈的水淘洗蕨麻至清澈，熱水浸泡12-14h后備用。使用豆?jié){機(jī)破壁磨漿，得到蕨麻漿，用紗布過濾后，將蕨麻的皮渣等濾掉。取已經(jīng)過濾的蕨麻漿汁，在其中加入一定比例的α-淀粉酶，在水浴鍋中恒溫水浴，促進(jìn)淀粉酶得以水解，使淀粉變成支鏈淀粉。隨后利用離心機(jī)離心蕨麻液，得到澄清的蕨麻汁。酶解完成后，把蕨麻汁放入發(fā)酵罐中進(jìn)行高溫高壓滅菌，從而使得α-淀粉酶失活，失去酶解活性。

③酶解試驗(yàn)。在前期試驗(yàn)中，通過運(yùn)用α-淀粉酶對(duì)蕨麻漿進(jìn)行酶解，進(jìn)而提升其澄清度，降低蕨麻汁的粘稠度，其中影響澄清度和粘稠度的主要因素包括酶的用量、處理時(shí)間及溫度等。

（3）鷹嘴豆的處理。把存在病蟲害的鷹嘴豆去掉，用干凈的水淘洗，熱水浸泡12-14h后備用。用豆?jié){機(jī)破壁磨漿，用紗布過濾后，得到鷹嘴豆豆?jié){。

（4）混合配料。配料主要包括蕨麻、鷹嘴豆，通過單因素水平試驗(yàn)，有效決定最佳配料比。

（5）滅菌要點(diǎn)。將蕨麻汁與鷹嘴豆豆?jié){、白砂糖按照相應(yīng)比例置于60℃熱水中攪拌溶解，在20L發(fā)酵罐中經(jīng)121℃、0.1Mpa保溫保壓滅菌10-20min，使其無菌。

（6）接種發(fā)酵。在無菌操作條件下，提前將發(fā)酵乳桿菌在MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)好備用，待物料進(jìn)入發(fā)酵罐中，再將菌種溶液加入發(fā)酵罐中。在37-43℃條件下保溫發(fā)酵24h，在發(fā)酵過程中不得開啟攪拌。

（7）調(diào)味、滅菌、包裝。將一定比例的白砂糖和三氯蔗糖溶于熱水中，在調(diào)配罐中進(jìn)行61-63℃巴氏消毒15min，隨后降溫至25℃，加入已經(jīng)發(fā)酵好的蕨麻鷹嘴豆乳酸菌發(fā)酵液，在調(diào)配罐中攪拌混勻后，將所得飲品在100℃條件下滅菌15-20min，隨后在無菌條件下利用包裝機(jī)進(jìn)行灌裝，得到蕨麻鷹嘴豆乳酸菌飲品。

三、結(jié)果與討論

1.乳酸菌的分離篩選。將陜西農(nóng)村地區(qū)的漿水菜樣品稀釋后，在37℃條件下培養(yǎng)48h，分離純化得到一株乳酸菌。由圖1可知，其為革蘭氏陽性菌，菌體呈長桿或短桿狀，符合乳酸菌的形態(tài)特征。

測序后利用BLAST將該菌的基因片段序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知序列進(jìn)行比對(duì)，獲得近源物種信息。利用CLUSTALX軟件和MEGA3.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，菌株XIMC-9與Lactobacillus fermentum（發(fā)酵乳桿菌）親緣性最近，結(jié)果如圖2所示。根據(jù)菌株的16SrDNA序列比對(duì)結(jié)果，確定漿水乳酸菌XIMC-9為發(fā)酵乳桿菌。

2.蕨麻漿的酶解澄清度單因素試驗(yàn)。首先，加酶量對(duì)蕨麻漿的澄清度和粘稠度有一定的影響，一般加酶量以0.1%為最佳。其次，酶解時(shí)間也對(duì)蕨麻漿的澄清度和粘稠度有一定的影響，由試驗(yàn)結(jié)果可知酶解最佳時(shí)間為3-4h，在水浴鍋中酶解溫度為60℃。

3.蕨麻汁和鷹嘴豆豆?jié){的比例試驗(yàn)。以活菌數(shù)為主要考核指標(biāo)，同時(shí)參考感官評(píng)定。單因素梯度分別為：蕨麻汁與鷹嘴豆豆?jié){的配比（質(zhì)量比）1：2（1）、1：3（2）、1：4（3）、1：5（4），發(fā)酵乳桿菌添加量為1%，發(fā)酵溫度為37℃，發(fā)酵時(shí)間為24h，結(jié)果如圖3所示。不同的蕨麻汁與鷹嘴豆豆?jié){的配比對(duì)乳酸菌活菌數(shù)有所影響，固定其它因素，可得出原料最佳配比為1：4，乳酸菌活菌數(shù)最高為5×108，且感官評(píng)分最高。

四、結(jié)論

目前國內(nèi)對(duì)蕨麻的開發(fā)利用較少，本次試驗(yàn)以蕨麻混合鷹嘴豆豆?jié){，添加陜西漿水菜分離的發(fā)酵乳桿菌XIMC-9進(jìn)行發(fā)酵后再滅菌包裝，生產(chǎn)出具有保健作用的蕨麻鷹嘴豆乳酸菌飲品，可以給蕨麻原料的開發(fā)利用提供一些參考價(jià)值。

作者簡介：黃朝（1993-），男，生物工程碩士研究生，西安國際醫(yī)學(xué)生物技術(shù)有限公司研發(fā)工程師，主要研究方向?yàn)槲⑸锱c食品工程。