熊澤語(yǔ)，謝晨，陳百科，李慧，金素萊曼，包海蓉,2,3*

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)2(上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海，201306) 3(農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(上海)，上海，201306)

魚(yú)糜制品作為現(xiàn)今深受人群青睞的食品，營(yíng)養(yǎng)豐富，味美價(jià)廉，種類(lèi)繁多，還可長(zhǎng)期保存，適合全年齡段消費(fèi)者食用。當(dāng)下常見(jiàn)的魚(yú)糜類(lèi)產(chǎn)品是先通過(guò)將生魚(yú)采肉、斬拌、鹽擂后形成初始魚(yú)糜凝膠，再經(jīng)過(guò)各自加工方式形成不同種類(lèi)的魚(yú)糜制品。在傳統(tǒng)魚(yú)糜生產(chǎn)工藝中，漂洗是不可缺少的工序之一。但漂洗同時(shí)也會(huì)使蛋白、脂肪等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)流失，造成產(chǎn)品得率的下降，漂洗廢水排放也會(huì)造成環(huán)境的污染。因此，制作未漂洗魚(yú)糜不僅可省略漂洗工序，還能減少?gòu)U水對(duì)環(huán)境的污染，同時(shí)減少魚(yú)糜營(yíng)養(yǎng)成分損失，提髙魚(yú)糜得率。

大黃魚(yú)(Pseudosciaenacrocea)作為常見(jiàn)魚(yú)類(lèi)，因其鮮美的味道與細(xì)致的口感而廣受消費(fèi)者的喜愛(ài)，其肉營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，可為消費(fèi)者提供充足的蛋白質(zhì)與不飽和脂肪酸[1]。為了有效貯存魚(yú)糜及其制品，通常以冷凍保藏作為其貯存方式，延長(zhǎng)貨架期。但是，內(nèi)源性蛋白酶的作用導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開(kāi)，鍵位暴露，使得魚(yú)糜內(nèi)部肌原纖維蛋白易發(fā)生冷凍變性，加上未漂洗魚(yú)糜內(nèi)部含有更多的脂肪、水溶性蛋白等，使得脂肪氧化加速，其產(chǎn)生的醛、酮類(lèi)物質(zhì)則會(huì)與蛋白交聯(lián)進(jìn)而加重蛋白質(zhì)的變性。并且間接的影響魚(yú)糜的保水性、凝膠特性[2]。

為解決蛋白質(zhì)冷凍變性，國(guó)內(nèi)魚(yú)糜在冷凍保藏上常采用復(fù)合磷酸鹽以及4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)蔗糖+4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)山梨醇混合而成的商業(yè)抗凍劑來(lái)延緩蛋白變性，但諸多國(guó)家對(duì)于復(fù)合磷酸鹽的使用較為嚴(yán)格，并且過(guò)度的添加亦會(huì)影響人體對(duì)鈣離子的吸收；另一方面，商業(yè)抗凍劑的高熱量與高甜度也破壞了食材的口感、降低消費(fèi)者的購(gòu)買(mǎi)欲望[3]。因此，國(guó)內(nèi)外探究以動(dòng)植物的天然提取物作為抗凍劑，延緩魚(yú)糜冷凍過(guò)程中品質(zhì)的下降，高文宏等[4]研究了水溶性大豆多糖對(duì)冷凍魚(yú)糜蛋白變性起抑制作用；HUANG等[5]研究發(fā)現(xiàn)菊粉可以增強(qiáng)MTGase對(duì)肌球蛋白重鏈的交聯(lián)作用，從而抑制冷凍過(guò)程中蛋白質(zhì)氧化降解。

常用的天然抗凍劑有海藻糖、海藻膠、茶多酚、酵母提取物等[6]，而海藻糖類(lèi)可以有效地促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)氧化自由基的清除，延緩蛋白質(zhì)、脂肪等氧化變性，并且可以提升肌原纖維蛋白溶解度[7]，其也常因低熱量、低甜度等優(yōu)點(diǎn)作為代糖用于食品生產(chǎn)中。未漂洗魚(yú)糜在冷凍過(guò)程中更易發(fā)生蛋白質(zhì)變性，本研究將海藻糖、蔗糖、山梨醇以不同比例復(fù)配加入并與常規(guī)商業(yè)抗凍劑(4%蔗糖+4%山梨醇)對(duì)比，以期探究復(fù)配多糖對(duì)于大黃魚(yú)未漂洗魚(yú)糜Ca2+-ATPase活性、總巰基含量、pH、凝膠強(qiáng)度、持水性、二級(jí)結(jié)構(gòu)含量以及凝膠微觀結(jié)構(gòu)的變化，以期探究一種新型復(fù)配抗凍劑最佳比例，旨在將天然抗凍劑與商業(yè)抗凍劑相結(jié)合，降低其熱量與甜度，并在此基礎(chǔ)上提高其抗凍性能，延緩未漂洗魚(yú)糜品質(zhì)的降低。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冰鮮大黃魚(yú)：通框養(yǎng)殖，規(guī)格1 kg/尾，寧德蔡氏水產(chǎn)有限公司，連夜捕撈，次日冰臺(tái)送達(dá)使用。

氯化鈉、氯化鉀、馬來(lái)酸、Tris固體、酒石酸鉀鈉、濃硫酸、ATP、5,5′-二硫雙(2-硝基苯甲酸)、三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)、硼酸、曲拉通(Tritonx-100)、鉬酸銨、牛血清白蛋白、硫酸亞鐵、95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶液、溴化鉀、無(wú)水硫酸銅等(分析純)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；PBS磷酸緩沖液、2.5%戊二醛，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

D-130電動(dòng)勻漿機(jī)，德國(guó)Wiggens有限公司；GL-20B 高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；TA.XT Plus質(zhì)構(gòu)儀，英國(guó)SMS公司；切碎機(jī)QSJ-B02R1，九陽(yáng)電器有限公司；UV1100型紫外分光光度計(jì)，廣州罡然機(jī)電設(shè)備有限公司；FI-TR傅里葉紅外分光光度計(jì)，賽默飛世爾；日立SU5000熱場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡，日立(中國(guó))有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 魚(yú)糜樣品的制備

未漂洗魚(yú)糜制備：將大黃魚(yú)隨機(jī)分成5組，分別去頭、去尾、去皮、去鱗、去內(nèi)臟；清洗,取肉于吸水紙上瀝干表面水分；取300 g碎魚(yú)肉于絞肉機(jī)中攪碎,以不添加抗凍劑作為空白對(duì)照組(CK)，保持總糖量8%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)不變?？紤]到海藻糖(trehalose, TR)的經(jīng)濟(jì)效益，以及預(yù)實(shí)驗(yàn)中得出單獨(dú)加入4%、6%、8%的TR并無(wú)太大差異，因此分別加入商業(yè)抗凍劑4%山梨醇(sorbitol，SUC)+4%蔗糖(sucrose，SBT)、2%TR+3%SUC+3%SBT、3%TR+2.5%SUC+2.5%SBT、4%TR+2%SUC+2%SBT、斬拌3 min制成魚(yú)糜。-60 ℃冰箱內(nèi)快速冷凍2.5 h，轉(zhuǎn)入-18 ℃冰箱冷凍保藏0、15、30、45、60、75、90 d，隨機(jī)抽樣進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測(cè)定。

1.2.2 肌原纖維蛋白的制備

參照KATOH等[8]的方法提取肌原纖維蛋白，整個(gè)過(guò)程利用冰浴將溫度維持在5 ℃以下。魚(yú)糜解凍后稱取樣品5 g，先加入提取緩沖液A、B各20 mL(其中，緩沖液A：40 mmol/L Tris-馬來(lái)酸，0.16 mol/L KCl，1%Triton，馬來(lái)酸調(diào)pH 至7.5；緩沖液B：40 mmol/L Tris-馬來(lái)酸，0.16 mol/L KCl，馬來(lái)酸調(diào)pH至 7.5)，10 000 r/min均質(zhì)2 min，5 000 r/min，4 ℃離心10 min，取沉淀加入40 mL 緩沖液B，重復(fù)上述步驟2次得粗蛋白；接著將粗蛋白充分溶于20 mL 0.1 mol/L KCl，同之前步驟均質(zhì)，離心。最后沉淀溶于40 mL 0.1 mol/L KCl重復(fù)上述操作，將蛋白溶液用雙層紗布過(guò)濾雜質(zhì)后離心，沉淀即為肌原纖維蛋白。蛋白濃度以雙縮脲法處理并用紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度，最后以0.6 mol/L KCl配制成所需濃度，置于4 ℃冰箱貯存待用。

1.2.3 Ca2+-ATPase活性測(cè)定

參考BENJAKUL等[9]的方法，量取3.5 mL 2 mg/mL蛋白質(zhì)溶液加入0.3 mL 0.5 mol/L Tris-Maleat(pH 7.0)和0.5 mL 0.1 mol/L CaCl2溶液，再加入0.25 mL 20 mmol/L ATP，25 ℃水浴10 min后加入2.5 mL (體積分?jǐn)?shù)) TCA，5 000 r/min，4 ℃，離心5 min。取上清液0.5 mL加入蒸餾水2.5 mL，振蕩搖勻后加入2 mL硫酸亞鐵-鉬酸銨溶液(取10 mL 10%鉬酸銨硫酸溶液加5 g硫酸亞鐵定容到100 mL)，25 ℃靜置1 min，在660 nm處測(cè)定吸光度，結(jié)果以1 mg肌原纖維蛋白1 min生成無(wú)機(jī)磷量(μmol)來(lái)表示。其中空白組中ATP和TCA調(diào)換添加順序。

1.2.4 魚(yú)糜總巰基含量測(cè)定

依據(jù)文獻(xiàn)[10]的方法，取1 mL 2 mg/mL的肌原纖維蛋白溶液加入 50 mmol/L的磷酸緩沖液9 mL，混勻后取4 mL混合液加入0.4 mL的Tris-HCl緩沖液(pH=8.0)，40 ℃水浴25 min，然后412 nm處測(cè)定吸光度。

1.2.5 魚(yú)糜pH的測(cè)定

測(cè)定方法依照 GB 5009.237—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品pH值的測(cè)定》[11]稍作修改(將10 g樣品降至5 g，100 mL蒸餾水減少至50 mL)，將5 g魚(yú)糜樣品充分溶于50 mL蒸餾水中，12 000 r/min均質(zhì)60 s后與4 ℃恒溫箱中靜置30 min，離心。上清液于濾紙上再次過(guò)濾，用pH計(jì)測(cè)定pH值，每組3個(gè)平行。

1.2.6 魚(yú)糜凝膠的制備

將-18 ℃冷凍魚(yú)糜取出放入3 ℃低溫培養(yǎng)箱中放置到中心溫度為-5 ℃左右的半解凍狀態(tài)，切成小塊，放入攪碎機(jī)中空攪2 min，后加入25 g/L食鹽混勻攪拌3 min，最后加冰水調(diào)節(jié)水分含量至80%后，將肉漿注入小型灌腸模具中，灌入直徑3.5 cm的塑料腸衣中封口，采用二段式加熱(40 ℃加熱60 min，90 ℃加熱30 min)，后將魚(yú)腸放入碎冰中冷卻30 min，放入4 ℃冰箱中保藏，統(tǒng)一在4 d內(nèi)陸續(xù)完成凝膠指標(biāo)測(cè)定。過(guò)程中，攪拌機(jī)放入碎冰中，全程保持?jǐn)嚢铚囟鹊陀? ℃。

1.2.7 魚(yú)糜凝膠強(qiáng)度的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[12]的方法稍作修改。冰箱中取出魚(yú)腸室溫放置0.5 h，將魚(yú)腸切成直徑3 cm，高3 cm的圓柱體，每組5個(gè)平行。測(cè)試條件：選用P/5S探頭。測(cè)試參數(shù)：測(cè)前、測(cè)中、測(cè)后速度均為1 mm/s，形變壓縮比50%，觸發(fā)力5.0 g。記錄破斷強(qiáng)度(g)和破斷距離(cm)，凝膠強(qiáng)度計(jì)算如公式(1)所示：

凝膠強(qiáng)度/(g·mm)=破斷強(qiáng)度×破斷距離

(1)

1.2.8 魚(yú)糜凝膠持水性測(cè)定

持水性(water holding capactity,WHC)測(cè)定：參考文獻(xiàn)[13]方法，將制備好的魚(yú)糜凝膠切成0.5 cm左右的薄片，稱重(m1)后用雙層濾紙包裹，離心機(jī)離心(4 ℃，3 000×g，10 min)，隨后濾紙中取出樣品稱重(m2)，持水性計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

1.2.9 魚(yú)糜肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定

參考文獻(xiàn)[14]的方法，使用傅里葉變換紅外光譜測(cè)定未漂洗魚(yú)糜肌原纖維蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的變化，先將肌原纖維蛋白冷凍干燥去除水分。取5 mg 凍干樣品和100 mg 溴化鉀粉末充分混合后充分研磨，使用壓片機(jī)將粉末壓縮成薄片。保持全程干燥條件下，室溫環(huán)境中以光譜分辨率為4 cm-1進(jìn)行測(cè)試，掃描32次，波數(shù)范圍為 4 000～400 cm-1。使用 PeakFit 4.12對(duì)獲得的圖上的曲線進(jìn)行多次曲線擬合，然后以二階導(dǎo)數(shù)求出峰面積所占比。

1.2.10 魚(yú)糜凝膠微觀結(jié)構(gòu)

參考PETCHARAT等[15]的方法略作修改。將魚(yú)糜凝膠切為厚度不超過(guò)3 mm的片狀，并用體積分?jǐn)?shù)2.5%的戊二醛溶液于4 ℃培養(yǎng)箱中固定24 h，去除固定液，使用磷酸緩沖液(0.2 mol/L，pH 7.2)漂洗3次，15 min/次，后用蒸餾水反復(fù)沖洗，而后依次用體積分?jǐn)?shù)30%、50%、70%、80%、90%、95%的乙醇溶液梯度脫水，每次15 min，最后以100%乙醇溶液脫水2次，每次30 min，進(jìn)行冷凍干燥，而后噴金，掃描電鏡觀察。

1.3 數(shù)據(jù)處理

以Microsoft Excel軟件作圖，并用IBM SPSS Statistics 25.0進(jìn)行顯著性分析，差異顯著水平為P<0.05，不顯著水平為P>0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ca2+-ATPase活性測(cè)定

Ca2+-ATPase活性常用來(lái)評(píng)判蛋白質(zhì)的冷凍變性程度。研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+-ATPase活性下降可能是肌球蛋白中的活性巰基氧化成二硫鍵，蛋白分子發(fā)生交聯(lián)，使得肌球蛋白頭部與ATP的接觸減少導(dǎo)致[16]。由圖1可知，凍藏時(shí)間為90 d時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組Ca2+-ATPase活性顯著下降(P<0.05)，下降率分別為67.36%、53.13%、57.17%、54.43%、47.58%，與不添加組(CK)相對(duì)比，添加組均可一定程度上抑制Ca2+-ATPase活性下降。隨著TR含量的增加，對(duì)Ca2+-ATPase活性下降的抑制明顯，當(dāng)TR含量達(dá)到4%時(shí)，Ca2+-ATPase活性最高(P<0.05)，這可能是因?yàn)椋啾扔谏虡I(yè)抗凍劑，TR內(nèi)部有更多的羥基可以與水分子相互作用，從而減少冷凍期間冰晶的生長(zhǎng)，避免其破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，防止蛋白變性。

圖1 復(fù)配抗凍劑對(duì)冷凍未漂洗大黃魚(yú)魚(yú)糜Ca2+-ATPase 活性的影響Fig.1 Effect of compound antifreeze on Ca2+-ATPase activity of frozen and unrinsed large yellow croaker surimi 注：不同小寫(xiě)字母表示差異性顯著(P<0.05)(下同)

2.2 巰基含量的測(cè)定

總巰基作為反應(yīng)蛋白質(zhì)氧化程度的一大指標(biāo)，是活性巰基與非活性巰基含量的總和[17]。巰基在肌原纖維蛋白中是活性極強(qiáng)的基團(tuán)，蛋白質(zhì)冷凍變性時(shí)，其被氧化形成二硫鍵，而隨著外層蛋白質(zhì)的變性引起的結(jié)構(gòu)改變，內(nèi)部蛋白質(zhì)的非活性巰基暴露出來(lái)，繼續(xù)被氧化，進(jìn)一步導(dǎo)致巰基含量下降[18]。二硫鍵含量的增加又會(huì)進(jìn)一步影響蛋白質(zhì)其他特性的變化。如圖2所示，0～30 d蛋白質(zhì)巰基含量下降劇烈，而后巰基含量下降趨于平緩，這可能是因?yàn)殡S著蛋白質(zhì)冷凍變性，導(dǎo)致巰基含量下降，而隨著外部蛋白不斷變性，肽鏈打開(kāi)，導(dǎo)致內(nèi)部蛋白質(zhì)巰基暴露出來(lái)，而使總巰基含量的增加，造成后期總巰基含量的下降越發(fā)平緩。凍藏90 d后，各實(shí)驗(yàn)組巰基含量顯著下降(P<0.05)；與0 d相比分別下降了37.89%、27.30%、30.47%、27.11%、24.03%，并且4%TR+2%SUC+2%SBT的巰基含量顯著高于其他4組(P<0.05)，這與Ca2+-ATPase 活性相對(duì)應(yīng)，說(shuō)明總巰基含量的下降可以影響Ca2+-ATPase 活性的變化[19]。可見(jiàn)，添加復(fù)配多糖可以在不同程度上延緩巰基含量的下降，而隨著海藻糖占總百分比的升高，這種延緩效果越發(fā)顯著。

圖2 復(fù)配抗凍劑對(duì)冷凍未漂洗大黃魚(yú)魚(yú)糜巰基含量的影響Fig.2 The effect of compound antifreeze on the sulfhydryl content of frozen and unrinsed large yellow croaker surimi

2.3 pH值的測(cè)定

pH是評(píng)價(jià)水產(chǎn)品變質(zhì)與否的重要指標(biāo)，而魚(yú)糜凍藏期間pH值變化與凍藏前添加抗凍劑與否有著密切聯(lián)系。由圖3可知，整個(gè)凍藏期間，各組pH下降幅度并不大，均呈現(xiàn)出前30 d先下降，而后緩慢回升或趨于平衡的趨勢(shì)；這是因?yàn)閮霾厍捌隰~(yú)糜內(nèi)部乳糖等降解產(chǎn)生乳酸，并且ATP分解產(chǎn)生磷酸使得pH先出現(xiàn)下降趨勢(shì)[20]。而到了凍藏后期，隨著蛋白質(zhì)冷凍變性而生成小分子氨基酸進(jìn)一步分解產(chǎn)生胺類(lèi)等揮發(fā)性物質(zhì)，造成pH轉(zhuǎn)而上升或趨于平緩，這與謝青青等[21]研究的魚(yú)糜制品凍融循環(huán)期間pH的變化趨勢(shì)相似。

其中空白組與2%TR+3%SUC+3%SBT在0～90 d時(shí)pH下降相對(duì)較大，從0 d的6.92下降到 6.77 與6.79而其他各處理組則分別為6.81、6.83、6.85，較小程度上延緩了pH值下降(P<0.05)，這是由于小分子糖的加入產(chǎn)生的抗凍效果，避免了大量的冰晶在胞內(nèi)生成而產(chǎn)生的細(xì)胞液濃縮、胞內(nèi)濃度升高，進(jìn)而導(dǎo)致pH的下降。特別是復(fù)配抗凍劑比例為4%TR+2%SUC+2%SBT時(shí)，pH下降的趨勢(shì)更為緩慢，90 d時(shí)下降程度最小，為7.24%，說(shuō)明其對(duì)于冰晶生成的抑制效果最好。

2.4 魚(yú)糜凝膠強(qiáng)度的測(cè)定

凝膠強(qiáng)度表示凝膠破斷力和凹陷距離的乘積，可以反映凝膠內(nèi)部結(jié)構(gòu)是否牢固；而凝膠強(qiáng)度的變化則可以反過(guò)來(lái)說(shuō)明魚(yú)糜凝膠內(nèi)部的肌原纖維蛋白品質(zhì)變化[22]。如圖4所示，隨著凍藏時(shí)間的增加，魚(yú)糜凝膠強(qiáng)度總體呈不斷下降趨勢(shì)，空白組凝膠強(qiáng)度從開(kāi)始的652.60 g·mm下降到90 d的157.35 g·mm，下降幅度最大，達(dá)到75.92%；而4%TR+2%SUC+2%SBT組從開(kāi)始的627.72 g·mm下降到90 d的 426.38 g·mm，下降程度最小，為30.07%，明顯優(yōu)于其他各組(P<0.05)，研究表示小分子多糖對(duì)冷凍過(guò)程中的冰晶產(chǎn)生、聚集起抑制作用，因此可以減少冰晶對(duì)細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的損壞，從而延緩魚(yú)糜凝膠強(qiáng)度的下降，而4%TR+2%SUC+2%SBT、蔗糖組合對(duì)蛋白質(zhì)冷凍保護(hù)作用最好，這與蘇趙等[23]研究的海藻糖對(duì)草魚(yú)魚(yú)糜冷凍期間延緩凝膠強(qiáng)度下降的結(jié)果相類(lèi)似。

圖3 復(fù)配抗凍劑對(duì)冷凍未漂洗大黃魚(yú)魚(yú)糜pH值的影響Fig.3 Effect of compound antifreeze on the pH value of frozen and unrinsed large yellow croaker surimi

圖4 復(fù)配抗凍劑對(duì)冷凍未漂洗大黃魚(yú)魚(yú)糜凝膠強(qiáng)度的影響Fig.4 The effect of compound antifreeze on the gel strength of frozen and unrinsed large yellow croaker surimi

2.5 魚(yú)糜凝膠持水性的測(cè)定

持水性是評(píng)價(jià)魚(yú)糜品質(zhì)好壞的重要指標(biāo)，表示凝膠遭受外力時(shí)維持水分的能力。其直接反映了凝膠內(nèi)部蛋白質(zhì)結(jié)合水能力的強(qiáng)弱，凝膠內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜、緊致，說(shuō)明蛋白質(zhì)與水分子結(jié)合能力強(qiáng)，表現(xiàn)出來(lái)的持水性也較好；反之則說(shuō)明凝膠內(nèi)部結(jié)構(gòu)松散，持水性較差[24]。如圖5所示，凍藏期間，空白組持水力急劇下降(P<0.05)；與空白組相比，添加組持水力則下降的較為緩慢。在90 d時(shí)空白組持水性以及顯著低于其他4組(P<0.05)，較新鮮魚(yú)糜下降了2.64%，添加物4組持水力相比于新鮮魚(yú)糜分別下降了1.40%、1.61%、1.43%、1.39%，差異較小(P>0.05)；說(shuō)明加入不同比例的復(fù)配抗凍劑均能作用于蛋白質(zhì)，通過(guò)多糖與水分的結(jié)合從而減少因細(xì)胞在冷凍過(guò)程中而導(dǎo)致水分的流失。

圖5 復(fù)配抗凍劑對(duì)冷凍未漂洗大黃魚(yú)魚(yú)糜持水性的影響Fig.5 Effect of compound antifreeze on water holding capacity of frozen and unrinsed large yellow croaker surimi

2.6 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定

蛋白質(zhì)是通過(guò)小分子氨基酸形成的多條肽鏈再經(jīng)過(guò)不同方式的組合所構(gòu)成，而二級(jí)結(jié)構(gòu)作為蛋白質(zhì)最基本的空間構(gòu)象，是判斷蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定與否的重要指標(biāo)[25]。氫鍵是蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)成的主要作用力，大部分蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)通過(guò)氫鍵使氨基酸肽鏈上的羰基與酰胺基團(tuán)鏈接而成，分別形成4種不同構(gòu)象：α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲。其代表的波長(zhǎng)區(qū)域分別為：β-折疊1 600～1 640 cm-1、無(wú)規(guī)則卷曲1 640～1 650 cm-1、α-螺旋1 650～1 660 cm-1、β-轉(zhuǎn)角1 660～1 700 cm-1。而傅里葉-紅外變換光譜可以測(cè)定蛋白質(zhì)不同波長(zhǎng)下的基團(tuán)、構(gòu)象的來(lái)觀察凍藏過(guò)程中蛋白質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化，其中酰胺Ⅰ帶(1 600～1 700 cm-1)是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的主要范圍[26]。圖6為新鮮魚(yú)糜與90 d凍藏后各組二級(jí)結(jié)構(gòu)百分比含量的變化。由圖6可知，新鮮未漂洗魚(yú)糜的α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲含量分別是25.12%、34.61%、26.08%、14.19%，經(jīng)過(guò)冷凍保藏后，各組α-螺旋含量均有所降低，分別下降了39.41%、11.50%、10.35%、8.76%、4.66%，說(shuō)明了肌球蛋白展開(kāi)，疏水基團(tuán)暴露。而無(wú)規(guī)則卷曲含量則顯著上升，進(jìn)一步說(shuō)明了蛋白質(zhì)有序結(jié)構(gòu)的不斷展開(kāi)、無(wú)序結(jié)構(gòu)進(jìn)而增加；從而導(dǎo)致魚(yú)糜形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)變得不規(guī)則，這也符合凝膠強(qiáng)度隨凍藏時(shí)間延長(zhǎng)而降低的趨勢(shì)。5組實(shí)驗(yàn)組中，添加4%TR+2%SUC+2%SBT的抗凍劑時(shí)與新鮮魚(yú)糜的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量最為相近，且效果好于商業(yè)抗凍劑，說(shuō)明次比例可以更好穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)的完整。

圖6 冷凍未漂洗大黃魚(yú)魚(yú)糜二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化Fig.6 Changes in the secondary structure of frozen and unrinsed large yellow croaker surimi

2.7 魚(yú)糜凝膠微觀結(jié)構(gòu)分析

使用掃描電子顯微鏡觀察凝膠微觀結(jié)構(gòu)，是判斷蛋白質(zhì)變性程度的常用方法。如圖7所示，新鮮魚(yú)糜凝膠結(jié)構(gòu)飽滿，凝膠網(wǎng)絡(luò)致密有序，形成了層次鮮明的凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

A-空白對(duì)照組(新鮮)；B-空白對(duì)照組(90 d)；C-商業(yè)抗凍劑； D-2%TR+3%SUC+3%SBT；E-3%TR+2.5%SUC+2.5%SBT； F-4%TR+2%SUC+2%SBT圖7 冷凍未漂洗大黃魚(yú)魚(yú)糜凝膠結(jié)構(gòu)的變化Fig.7 Changes in gel structure of frozen and unrinsed large yellow croaker surimi

經(jīng)過(guò)90 d的凍藏，各組蛋白凝膠均出現(xiàn)不同程度的變化，空白對(duì)照組在90 d時(shí)凝膠結(jié)構(gòu)變化較為明顯，凝膠孔洞增多、變大，表面粗糙并且突起顯著減少，說(shuō)明凝膠網(wǎng)絡(luò)三維結(jié)構(gòu)受到較大破壞(圖7-B)。而添加抗凍劑的4組凝膠也都有不同程度的破損，但相比于空白對(duì)照組明顯變化較小。商業(yè)抗凍劑組相較于空白組表面突起較多，蛋白纖維平滑，孔洞較大(圖7-C)；而 2%TR+3%SUC+3%SBT組相對(duì)于新鮮魚(yú)糜突起減少，凝膠結(jié)構(gòu)較為干癟組，出現(xiàn)較多的孔洞(圖7-D)。而3%TR+2.5%SUC+2.5%SBT與4%TR+2%SUC+2%SBT組的凝膠網(wǎng)絡(luò)相比于2%TR+3%SUC+3%SBT組結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜、緊致，結(jié)構(gòu)也更具有空間立體感，產(chǎn)生的孔洞也明顯減少，與商業(yè)抗凍劑組較為相近(圖7-E、圖7-F)。由此說(shuō)明海藻糖含量的增加可以減小凝膠網(wǎng)絡(luò)在凍藏過(guò)程中的變化，并且對(duì)蛋白質(zhì)的保護(hù)作用較好。

3 結(jié)論

魚(yú)糜在冷凍保藏過(guò)程中，蛋白質(zhì)的冷凍變性會(huì)對(duì)魚(yú)糜品質(zhì)、口感等特性產(chǎn)生較大損害；其直接造成肌原纖維蛋白含量的下降，這主要是由于肌球蛋白的結(jié)構(gòu)被破壞，從而對(duì)魚(yú)糜表觀上的特性，如凝膠強(qiáng)度、持水性等產(chǎn)生影響。此外，魚(yú)糜凍藏過(guò)程中產(chǎn)生的冰晶也會(huì)破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，對(duì)魚(yú)糜凝膠產(chǎn)生機(jī)械性的損害。

由此本試驗(yàn)研究了加入不同比例的海藻糖、山梨醇、蔗糖(保持總添加量與商業(yè)抗凍劑一致)對(duì)冷凍未漂洗大黃魚(yú)魚(yú)糜Ca2+-ATPase活性，總巰基含量、pH值、凝膠強(qiáng)度、凝膠持水性、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)以及凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明，3%TR+2.5%SUC+2.5%SBT、4%TR+2%SUC+2%SBT作為抗凍劑加入均可以在一定程度上抑制蛋白質(zhì)的冷凍變性，并間接延緩魚(yú)糜凝膠的劣化，而當(dāng)添加量為4%海藻糖+2%山梨醇+2%蔗糖時(shí)，對(duì)于蛋白質(zhì)各指標(biāo)的改善最為顯著。與商業(yè)抗凍劑相比具有更小的熱量與甜度，也能滿足廣大消費(fèi)者的要求，是商業(yè)抗凍劑的良好替代品，也為今后未漂洗魚(yú)糜冷凍保藏研究提供數(shù)據(jù)支持。