宋旸，王偉寧，姚靜，王?，?，羅淑年，王立琦,*

1(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱，150028)2(齊齊哈爾大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾，161006) 3(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 計(jì)算機(jī)與信息工程學(xué)院,黑龍江省電子商務(wù)與信息處理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱，150028)

膽堿是卵磷脂的主要成分，也是神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿生物合成的前體[1]。膽堿對(duì)人體具有極其重要的作用，它能夠促進(jìn)脂肪的分解，傳遞神經(jīng)信號(hào)。膽堿的缺乏會(huì)影響記憶力，并且容易導(dǎo)致肝功能障礙，甚至引發(fā)癌癥。此外，阿爾茨海默病和帕金森病等神經(jīng)退行性疾病也與膽堿的異常代謝有關(guān)[2]。雖然人體可以合成膽堿，但是飲食中也需要膽堿的攝入[3]。一些國(guó)家的兒科學(xué)會(huì)、食品和營(yíng)養(yǎng)委員會(huì)為嬰兒以及成人制定關(guān)于膽堿每日攝入量的標(biāo)準(zhǔn)[4]，因此食品中膽堿含量的檢測(cè)具有重要的意義。檢測(cè)食品中的膽堿含量通常采用氣相色譜法[5]、高效液相色譜法[6]、離子色譜[7]、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[8]、熒光檢測(cè)法[9]、比色法[10]等傳統(tǒng)檢測(cè)方法，但這些檢測(cè)方法普遍成本高、操作復(fù)雜、分析速度慢、難以快速實(shí)時(shí)檢測(cè)，因此研究新型便攜的食品中膽堿檢測(cè)技術(shù)是極其必要的。

利用光電化學(xué)分析原理，研制敏感化的光敏電極，能夠?qū)崿F(xiàn)食品中膽堿的快速實(shí)時(shí)檢測(cè)。膽堿氧化酶(choline oxidase，ChOx)是光電化學(xué)檢測(cè)膽堿的關(guān)鍵用酶，可以催化膽堿生成電子供體H2O2，在光激發(fā)下，電極上的光活性物質(zhì)會(huì)得到H2O2的電子，組成光致電化學(xué)循環(huán)系統(tǒng)，利用光電化學(xué)手段，探究光電化學(xué)信號(hào)對(duì)膽堿的響應(yīng)。由于游離態(tài)的酶分析精度、穩(wěn)定性和循環(huán)利用性較差[11]，所以ChOx作為生物敏感元件固定于光敏電極可有效提高其檢測(cè)的效率。固定化的酶需要保持其結(jié)構(gòu)、功能和生物活性，在光敏酶電極使用的過程中不易發(fā)生解吸，理想的酶電極同時(shí)具有重現(xiàn)性和貯藏穩(wěn)定性，酶的固定化方法直接影響著光敏酶電極的精度和穩(wěn)定性[12]，因此要選擇合適的光敏電極上酶的固定化方法。

用于電極上酶的固定化方法主要有吸附法[13]、包埋法[14]、共價(jià)結(jié)合法[15]、交聯(lián)法[16]以及親和法[17]等。ZHANG等[18]將乙酰輔酶A和輔酶A吸附固定于金電極上，基于陰極溶出伏安法進(jìn)行肉堿的靈敏測(cè)定。LIU等[19]利用Nafion將酪氨酸酶與堿性磷酸酶固定在生物炭納米顆粒修飾的玻碳電極上，用于雙酚A的檢測(cè)，具有較好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。RAHMAN等[20]采用共價(jià)結(jié)合法將ChOx固定于修飾電極上，用于膽堿的快速檢測(cè)。但是由于共價(jià)結(jié)合法的反應(yīng)條件比較強(qiáng)烈，會(huì)引起酶蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，降低了固定ChOx的比活力，因此需探究更適宜的光敏電極上ChOx固定化方法用于膽堿的快速檢測(cè)。

本文基于二氧化錫納米粒子(SnO2nanoparticles，SnO2NPs)和聚硫堇(polythioine，PTh)修飾的氧化銦錫(indium tin oxide，ITO)光敏電極，采用殼聚糖包埋和戊二醛交聯(lián)相結(jié)合的方法固定ChOx，這種復(fù)合的固定化方法能夠使光敏電極達(dá)到更好的酶固定效果。試驗(yàn)表征了ITO/ SnO2NPs/PTh電極固定ChOx前后的形貌變化，考察了殼聚糖濃度、戊二醛濃度、固定時(shí)間對(duì)ChOx相對(duì)酶活力的影響，通過響應(yīng)面優(yōu)化出最佳的ChOx固定化條件，并研究了光敏電極固定化酶的重復(fù)利用性和貯存穩(wěn)定性，對(duì)于生物酶光敏電極能夠更好的應(yīng)用于食品中膽堿的光電化學(xué)檢測(cè)提供了一定的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

ChOx(10 units/mg)、過氧化物酶(250 units/mg)，美國(guó)Sigma公司；殼聚糖，上海麥克林生化科技有限公司；ABTS，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；戊二醛(分析純)，天津市大茂化學(xué)試劑廠；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉(分析純)，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HITACHI S-4300掃描式電子顯微鏡(scanning eletrn microscope，SEM)，日本日立公司；UV-5100紫外可見分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 光敏電極ChOx的固定

用移液槍將5 μL殼聚糖溶液轉(zhuǎn)移到自制的ITO/SnO2NPs/PTh電極表面，室溫干燥成膜。然后用pH 6.0的PBS洗滌，晾干。電極表面涂以5 μL戊二醛溶液，硬化30 min后，用pH 6.0的PBS洗滌電極干燥，并滴加5 μL ChOx溶液，室溫固定化反應(yīng)一段時(shí)間。用去離子水沖洗備用。

1.3.2 ChOx活性的測(cè)定

參考HEINZE等[21]的分光光度法測(cè)定ChOx活性并稍作修改，過氧化物酶偶聯(lián)系統(tǒng)氧化ABTS會(huì)導(dǎo)致414 nm處吸光度增加，1單位ChOx的活性對(duì)應(yīng)1 μmol/min ABTS的氧化。在試管中依次加入0.8 mL的PBS(50 mmol/L、pH 7.0)、0.1 mL的膽堿(0.5 mmol/L)、0.05 mL ABTS溶液(50 mmol/L)和1.3.1所制的ChOx固定化酶膜，然后加入0.05 mL的過氧化物酶溶液(25 U/mL)，所有溶液均采用50 mmol/L的PBS(pH 7.0)配制，混勻，25 ℃反應(yīng)5 min，測(cè)定樣品在414 nm處吸光度，空白對(duì)照組添加滅活固定化酶膜，其余不變。設(shè)定同組酶活力最高的相對(duì)酶活力為100%，以同組最高酶活力為參照，計(jì)算出的比值為ChOx相對(duì)酶活力。

1.3.3 ChOx固定化單因素試驗(yàn)

1.3.3.1 殼聚糖濃度對(duì)固定化ChOx相對(duì)酶活力的影響

在戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%、交聯(lián)時(shí)間為1 h時(shí)，考察殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%、0.6%、1%、1.4%、1.8%對(duì)ChOx相對(duì)酶活力的影響。

1.3.3.2 戊二醛濃度對(duì)固定化ChOx相對(duì)酶活力的影響

在殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%、交聯(lián)時(shí)間為1 h時(shí)，考察戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%、0.3%、0.55%、0.8%、1.05%對(duì)ChOx相對(duì)酶活力的影響。

1.3.3.3 固定時(shí)間對(duì)固定化ChOx相對(duì)酶活力的影響

在殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%、戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%，考察固定時(shí)間為0.2、0.6、1、1.4、1.8 h對(duì)ChOx相對(duì)酶活力的影響。

1.3.4 響應(yīng)面法優(yōu)化固定條件

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，以ChOx的酶活力為考察指標(biāo)，根據(jù)Box-Behnken原理設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)，因素和水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素水平表Table 1 Factors and levels of the response surface methodology

1.4 固定化酶的重復(fù)利用性

將固定化酶在相同條件下連續(xù)操作10次，測(cè)定ChOx相對(duì)酶活力。

1.5 固定化酶的貯存穩(wěn)定性

分別取固定化酶保存于0～4 ℃冰箱中，每隔4 d取出測(cè)定兩者的殘余酶活力。

1.6 數(shù)據(jù)處理

所有樣品進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，采用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算其平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差；實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示并使用Origin 9繪圖；通過Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)光敏電極固定化ChOx條件進(jìn)行優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 殼聚糖濃度對(duì)固定化酶活力的影響

如圖1所示，固定化ChOx相對(duì)酶活力隨殼聚糖濃度的增加而逐漸升高，在殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%時(shí)酶活力達(dá)到最大值，與其他濃度相對(duì)酶活力的差異是極顯著的(P<0.01)，隨著殼聚糖濃度的繼續(xù)增加而顯著降低。殼聚糖是無(wú)毒的，具有生物相容性，為酶提供天然的微環(huán)境，并且有利于電子在酶和電極之間穿梭，在電極的酶固定領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[22]。當(dāng)殼聚糖的濃度較低時(shí)，ChOx的包埋不緊密，酶會(huì)逐漸泄露，所以包埋效果較差，固定化酶活力較低。當(dāng)殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)>1%時(shí)，溶液黏度過大，酶液分布不均勻，降低了ChOx對(duì)膽堿的催化速率，所以固定化酶的活性降低，殼聚糖的最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)選擇為1%。

圖1 殼聚糖濃度對(duì)固定化酶活力的影響Fig.1 Effect of chitosan concentration on the immobilized enzyme activity 注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.1.2 戊二醛濃度對(duì)固定化酶活力的影響

如圖2所示，隨著戊二醛濃度的增加，固定化ChOx的相對(duì)酶活力呈先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%時(shí)，ChOx的相對(duì)酶活力達(dá)到最大值，與其他戊二醛濃度的相對(duì)酶活力具有極顯著差異(P<0.01)。戊二醛的濃度較低時(shí)，交聯(lián)度較低。包埋的不緊實(shí)，酶容易流失，所以酶的相對(duì)活力不高。當(dāng)戊二醛的質(zhì)量分?jǐn)?shù)>0.3%時(shí)，戊二醛中的醛基具有較大的范德華力，可以與殼聚糖以及酶中的—OH、—NH3等基團(tuán)共價(jià)結(jié)合形成共價(jià)鍵，占用了酶蛋白中的有效基團(tuán)，影響了酶與底物的有效結(jié)合，進(jìn)而降低了酶對(duì)底物的催化氧化效率，同時(shí)戊二醛也是一種變性劑，高濃度的戊二醛會(huì)使酶的活性部位發(fā)生改變，致使酶失活，所以ChOx的酶活力降低，這與HUANG等[23]研究結(jié)果相一致，戊二醛的最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)選擇為0.3%。

2.1.3 固定時(shí)間對(duì)固定化酶活力的影響

如圖3所示，隨著固定化反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，ChOx的相對(duì)酶活力呈逐漸升高的趨勢(shì)，在固定化時(shí)間超過1 h時(shí)，酶活力有所降低。酶的固定量會(huì)隨著固定化時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，酶活力也隨之升高。當(dāng)酶的固定時(shí)間為1 h時(shí)，酶的固定量趨于飽和，ChOx的相對(duì)酶活力達(dá)到最大值，與其他固定時(shí)間相對(duì)酶活力之間的差異是極顯著的(P<0.01)。隨著固定時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，過長(zhǎng)的固定時(shí)間會(huì)導(dǎo)致酶的交聯(lián)程度過高，增加了空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的緊密程度，阻礙了底物的擴(kuò)散，促使ChOx的相對(duì)酶活力略有降低，而且固定時(shí)間的延長(zhǎng)也會(huì)導(dǎo)致酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，酶活力也會(huì)隨之降低，這與PAN等[24]的研究結(jié)果相一致，因此選擇固定時(shí)間為1 h。

圖2 戊二醛濃度對(duì)固定化酶活力的影響Fig.2 Effect of glutaraldehyde concentration on the immobilized enzyme activity

圖3 固定時(shí)間對(duì)固定化酶活力的影響Fig.3 Effect of immobilized time on the immobilized enzyme activity

2.2 電極上ChOx固定化的響應(yīng)面分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)(A)、戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)(B)、固定時(shí)間(C)為自變量，以酶活力為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

利用Design Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次回歸方程的分析，可以得出，ChOx活力Y的二次回歸方程，并采用方差的方法分析(表3)可知。酶活力Y的標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為：Y=16.72-0.14A+0.050B+0.013C-0.70AB+0.12AC+0.00BC-2.65A2+0.43B2-5.30C2。

模型的決定系數(shù)與調(diào)整決定系數(shù)分別為0.994 5、0.987 4，說明此模型與試驗(yàn)之間擬合程度較高，證明用此模型優(yōu)化殼聚糖濃度、戊二醛濃度和固定時(shí)間對(duì)固定化ChOx活力的影響具有可行性。由殼聚糖濃度、戊二醛濃度、固定時(shí)間對(duì)響應(yīng)值的影響可以得出，回歸方程Y中的AB、A2、C2對(duì)固定化ChOx的酶活力都有極其顯著的影響，B2對(duì)固定化ChOx的酶活力有顯著的影響，而其他因素影響不是很明顯，表明各影響因素對(duì)于固定化ChOx活力的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。用中心標(biāo)準(zhǔn)化處理回歸方程，Y回歸方程一次項(xiàng)回歸系數(shù)的絕對(duì)值大小依次為A、B、C，因此，3個(gè)影響因素對(duì)酶活力影響順序?yàn)椋簹ぞ厶琴|(zhì)量分?jǐn)?shù)(A)>戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)(B)>固定時(shí)間(C)。

表2 響應(yīng)面的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Experimental design and results of response surface methodology

表3 酶活力試驗(yàn)結(jié)果的方差分析表Table 3 ANOVA for the experimental results of enzyme activity

對(duì)模型中的殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)(A)、戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)(B)、固定時(shí)間(C)其中的1個(gè)因素讓它在0水平不動(dòng)時(shí)，由此可知，另外2個(gè)影響因素相互交叉作用對(duì)酶活力Y的子模型，并根據(jù)子模型，分別繪制出3個(gè)3維響應(yīng)曲面圖，如圖4所示。

a-殼聚糖濃度和戊二醛濃度對(duì)酶活力的影響； b-殼聚糖濃度和固定時(shí)間對(duì)酶活力的影響； c-戊二醛濃度和固定時(shí)間對(duì)酶活力的影響圖4 固定化酶活力的響應(yīng)面圖Fig.4 The response surface of immobilized enzyme activity

圖4說明了各因素對(duì)固定化ChOx活力的影響。由圖4-a、圖4-c可以看出，殼聚糖濃度和固定時(shí)間之間以及戊二醛濃度和固定時(shí)間之間交互作用較強(qiáng)，而殼聚糖濃度和戊二醛濃度之間交互作用較弱。并且由圖4-a、圖4-b可以看出，與殼聚糖濃度和戊二醛濃度相比，固定時(shí)間對(duì)酶活力的影響相對(duì)較小。

通過所得到的模型，可預(yù)測(cè)ITO/SnO2NPs/PTh光敏電極固定ChOx的最佳工藝條件為：殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.55%、固定時(shí)間1 h。在此條件下，固定化ChOx的酶活力在理論上可達(dá)17.3 U。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)上述結(jié)果進(jìn)行近似驗(yàn)證試驗(yàn)，檢測(cè)真實(shí)值是否與試驗(yàn)結(jié)果相一致。在最佳工藝條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，測(cè)得固定化ChOx活力為17.2 U，與理論值相比，相對(duì)誤差在±1%以內(nèi)，而且重復(fù)性好，說明優(yōu)化結(jié)果是準(zhǔn)確可靠的。

2.4 光敏電極表征

圖5為ITO/SnO2NPs/PTh光敏電極固定化ChOx前后的掃描電鏡對(duì)比圖。圖5-a中PTh在SnO2NPs表面呈塊狀均勻分布，形成1層藍(lán)色PTh膜；圖5-b中ITO/SnO2NPs/PTh光敏電極固定化ChOx后，有層狀結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)沉積于納米材料修飾的電極表面，表明酶已固定在PTh膜之上，因此ChOx被成功固定在光敏電極的表面。

a-ITO/SnO2 NPs/PTh；b-ITO/ SnO2 NPs/PTh/ChOx圖5 ITO/SnO2 NPs/PTh和ITO/ SnO2 NPs/PTh/ChOx 光敏電極掃描電鏡圖Fig.5 SEM of ITO/SnO2 NPs和ITO/ SnO2 NPs/ChOx photosensitive electrode

2.5 固定化酶的重復(fù)利用性

固定于ITO/SnO2NPs/PTh光敏電極的ChOx的重復(fù)利用性如圖6所示，固定化的ChOx活性隨著使用次數(shù)的增多而略有下降，這是由于重復(fù)的操作會(huì)使酶的包埋強(qiáng)度降低，致使酶有所流失，從而降低了ChOx活性。在重復(fù)利用6次后，固定化ChOx可保持最高酶活力的90%，經(jīng)過10次利用以后，固定化ChOx可酶活力仍然保持在83%以上，表明ITO/SnO2NPs/PTh光敏電極上固定ChOx具有良好的重復(fù)利用性。與共價(jià)交聯(lián)法固定ChOx相比，酶活力的損失較小，重復(fù)利用多次后仍保證較高的酶活力[20]。

圖6 固定化Chox的重復(fù)利用性Fig.6 Reuse of the immobilized ChOx

2.6 固定化酶的貯存穩(wěn)定性

固定于ITO/SnO2NPs/PTh光敏電極的ChOx的貯存穩(wěn)定性結(jié)果如圖7所示，隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng)，固定化ChOx的酶活力略有降低，但總體下降幅度不大，20 d后ChOx的酶活力還能保持到86%，表明ITO/SnO2NPs/PTh光敏電極上固定ChOx具有良好的貯存穩(wěn)定性。與吸附法固定ChOx相比，反應(yīng)更加溫和，載體不易脫落，具有更好的重復(fù)利用性[25]。

圖7 固定化Chox的貯存穩(wěn)定性Fig.7 Storage stability of the immobilized ChOx

3 結(jié)論

為了實(shí)現(xiàn)新型光敏電極對(duì)食品中膽堿的快速檢測(cè)，根據(jù)ChOx對(duì)膽堿的特異性催化作用，探究光敏電極上ChOx的固定化方法。采用殼聚糖包埋與戊二醛交聯(lián)相結(jié)合的方法固定ChOx，以ChOx固定化酶活力的顯著影響因素殼聚糖濃度、戊二醛濃度、固定時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)以及響應(yīng)面分析，確定ChOx的最佳固定化條件為殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%，戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.55%、固定時(shí)間1 h，在此條件下固定化Chox的酶活力為17.2 U，與理論值接近；SEM證明了ChOx成功固定于ITO/ SnO2NPs/PTh光敏電極的表面；光敏電極上固定化ChOx重復(fù)利用10次以后酶活力仍能保持83%，貯存20 d后酶活力仍能保持86%，具有良好的重復(fù)利用性和貯存穩(wěn)定性，固定ChOx的光敏電極將應(yīng)用于后續(xù)食品中膽堿的光電化學(xué)檢測(cè)之中。