沈丹玉，竇立耿，劉毅華，湯富彬，趙振東，畢良武*

1(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所，生物質(zhì)化學(xué)利用國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家林業(yè)和草原局林產(chǎn)化學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京，210042)2(南京林業(yè)大學(xué),江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心， 江蘇 南京，210042)3(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 杭州，311400)4(連云港市南云臺(tái)林場(chǎng)管理處， 江蘇 連云港，222062)

核桃(JuglansregiaL.)，胡桃科植物，含有豐富的蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、維生素E、維生素B族以及鎂、鉀、鐵等多種礦質(zhì)元素，具有“長(zhǎng)壽果”的美譽(yù)，與扁桃、腰果、榛子并稱為世界“四大干果”[1-2]。同時(shí)，核桃仁尤其是核桃仁上包裹的內(nèi)種皮富含酚類、黃酮類物質(zhì)等抗氧化成分[3-4]。大量流行病學(xué)研究顯示，經(jīng)常食用核桃可以有效降低多種疾病的發(fā)生率，核桃中富含酚類物質(zhì)是重要原因[5]。酚類物質(zhì)具有抗氧化、抗炎、抗癌、提高免疫力等生物活性[6-7]。酚酸是酚類物質(zhì)中的一類，約占植物源食品中酚類化合物的三分之一，多為苯甲酸和肉桂酸的羥基化衍生物，還有少量縮合酚酸[8]。研究表明酚酸與采后運(yùn)輸、貯藏、誘導(dǎo)抗性及果實(shí)色澤和風(fēng)味等品質(zhì)指標(biāo)密切相關(guān)[9]。酚酸的種類和含量因地理環(huán)境、氣候條件、栽培措施、提取方法等的不同有所差異[10-13]。

酚酸存在形式復(fù)雜，有可溶性游離態(tài)、可溶性酯化態(tài)和不溶性結(jié)合態(tài)3種不同的存在形式[14]。其中，可溶性酯化態(tài)和不溶性結(jié)合態(tài)酚酸大多通過(guò)酯鍵或醚鍵與多肽、蛋白質(zhì)、纖維素和糖等其他大分子物質(zhì)相結(jié)合，需經(jīng)水解釋放出來(lái)才能被測(cè)定[15]。不同植物中酚酸的種類和含量均有所不同。目前已有核桃中酚酸含量的報(bào)道，但研究多集中于可溶性游離型酚酸[16]。不同形態(tài)的酚酸在多種水果、谷物麩皮和核桃仁等中得到鑒定[8,17-19]，但對(duì)核桃內(nèi)種皮中酚酸關(guān)注較少，尤其對(duì)于酯化態(tài)酚酸和結(jié)合態(tài)酚酸鮮見相關(guān)報(bào)道[20]?？扇苄杂坞x態(tài)酚酸在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中均被證明有較強(qiáng)的抗氧化活性[7,21]，另有研究表明可溶性酯化態(tài)和不溶性結(jié)合態(tài)酚酸可以與細(xì)胞壁相結(jié)合，作用于消化道，經(jīng)酶解并釋放出生物活性物質(zhì)，可以預(yù)防結(jié)腸癌等慢性疾病[22]。因此，全面分析核桃內(nèi)種皮中酚酸的形態(tài)分布具有重要意義。

酚類化合物常用的萃取溶劑為甲醇、乙醇、丙酮和乙酸乙酯等，其中甲醇或乙醇水溶液被認(rèn)為是提取核桃仁多酚的有效溶劑。由于氧原子電負(fù)性比氫原子大，電子云偏向氧，所以H表現(xiàn)出酸性。比較三者酸性強(qiáng)弱就是比較對(duì)H原子的束縛能力，也就是電子云偏向。比較三者結(jié)構(gòu)，乙醇比甲醇多1個(gè)甲基，由于甲基的給電子效應(yīng)，分散了原本偏向O原子的電子云密度，所以對(duì)H原子的束縛能力減弱，酸性降低。同理可得甲醇酸性比水低。水適合提取極性化合物，而甲醇、乙醇適合提取極性較小的化合物，不同比例的甲醇水溶液和乙醇水溶液是否也適用于從核桃內(nèi)種皮中提取多酚，是我們要研究的問題。

酚酸化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，具有相似的物理化學(xué)性質(zhì)，色譜保留時(shí)間相近，紫外可見及熒光光譜相似[14]。本研究利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)核桃內(nèi)種皮中的可溶性游離態(tài)、可溶性酯化態(tài)和不溶性結(jié)合態(tài)3種形態(tài)的羥基苯甲酸類、羥基肉桂酸類和縮合酚酸三類14種酚酸含量進(jìn)行分析，以期為核桃和其他堅(jiān)果內(nèi)種皮中的酚酸類化合物的生物活性研究提供數(shù)據(jù)支持與理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器、材料與試劑

1.1.1 儀器

1290 Infinity-6460 QQQ液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國(guó)Agilent公司；FreeZone 6L真空冷凍干燥機(jī)，美國(guó)LABCONCO公司；CPA225D十萬(wàn)分位分析天平，德國(guó)Sartorius公司；SB-5200 DTD大功率超聲波水浴，寧波新芝生物科技公司；Biofuge Stratos高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Thermo公司。

1.1.2 試劑與材料

甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙腈、甲酸(均為色譜純)，德國(guó)Merck公司；超純水(電阻率18～25 MΩ·cm)，實(shí)驗(yàn)室超純水儀制備；14種酚酸標(biāo)準(zhǔn)品(表1，純度均大于98%)，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；核桃樣品，新疆葉城。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理

核桃去掉青皮和外殼后，用液氮急凍將內(nèi)種皮從核桃種仁表面分離出來(lái)，真空冷凍干燥12 h(含水量小于6%)，干燥后的核桃內(nèi)種皮用粉碎機(jī)磨成細(xì)粉，過(guò)40目篩，并貯存于-20 ℃冰箱中，備用。

1.2.2 不同形態(tài)酚酸的提取制備

在本課題組前期核桃仁方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)[23]。精確稱取0.5 g核桃內(nèi)種皮置于15 mL離心管里，加入10 mL溶劑，40 ℃超聲提取30 min，10 000 r/min離心5 min。再分別用5 mL溶劑重復(fù)2次進(jìn)行上述提取和離心操作。合并3次上清液，并蒸發(fā)掉有機(jī)溶劑。用6 mol/L HCl調(diào)節(jié)濃縮濾液pH值為2，用等體積乙酸乙酯萃取6次，合并乙酸乙酯相，將乙酸乙酯相真空濃縮(30 ℃)，去除有機(jī)溶劑后用甲醇定容至10 mL，即得到核桃內(nèi)種皮可溶性游離態(tài)酚酸。

將上述萃余水相加入10 mL 4 mol/L NaOH，30 ℃水浴2 h，用6 mol/L HCl調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH值為2，用等體積乙酸乙酯萃取6次，合并乙酸乙酯相，將乙酸乙酯相真空濃縮(30 ℃)，去除有機(jī)溶劑后用甲醇定容至10 mL，即得到核桃內(nèi)種皮可溶性酯化態(tài)酚酸。

離心后的殘?jiān)屑尤?0 mL 4 mol/L NaOH，30 ℃水浴2 h，用6 mol/L HCl調(diào)節(jié)反應(yīng)液體pH值，用等體積乙酸乙酯萃取6次，合并乙酸乙酯相，將乙酸乙酯相真空濃縮(30 ℃)，去除有機(jī)溶劑后用甲醇定容至10 mL，即得到核桃內(nèi)種皮不溶性結(jié)合態(tài)酚酸。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取酚酸標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇分別配成單標(biāo)溶液，用于儀器建立各個(gè)酚酸的離子對(duì)信息；把單標(biāo)配成質(zhì)量濃度為10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再將儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度范圍為0.01～1 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。所有標(biāo)準(zhǔn)溶液均置于-20 ℃避光貯存，恢復(fù)到室溫上機(jī)。

1.2.4 儀器工作條件

直接使用本課題組前期建立的儀器方法[23]。液相色譜條件：色譜柱為 Agilent Poroshell 120 EC-C18column (100 mm × 2.1 mm, 1.9 μm)，柱溫40 ℃；流動(dòng)相A為0.05%(體積分?jǐn)?shù))甲酸水溶液，流動(dòng)相B為甲醇-乙腈(體積比1∶4)，梯度洗脫程序?yàn)? min 85% A，1 min 80% A，12 min 50% A，15 min 40% A，17 min 5% A(均為體積分?jǐn)?shù))。流速0.3 mL/min，進(jìn)樣量5 μL。

質(zhì)譜條件：AJS電噴霧電離源(electrospray ionization，ESI)源，正負(fù)離子掃描模式(ESI+，ESI-)，動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(dynamic multiple reaction monitoring，DMRM)模式，霧化器壓力為45 psi，干燥氣體流速為11 L/min，離子源溫度為300 ℃，毛細(xì)管電壓為3 500 V。各物質(zhì)離子對(duì)優(yōu)化后參數(shù)及其保留時(shí)間如表1所示。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)處理重復(fù)3次，數(shù)據(jù)使用SPSS 17 Duncan進(jìn)行顯著性方差分析，P<0.05 表示具有顯著性差異，P<0.01表示具有極顯著差異；采用Origin 2017進(jìn)行繪圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 十四種酚酸的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析

14種酚酸在液相條件下有多處出峰時(shí)間發(fā)生重合，如原兒茶酸(1.210 min)和闊馬酸(1.223 min)、綠原酸(1.443 min)、丁香酸(1.447 min)和咖啡酸(1.476 min)、芥子酸(2.128 min)和阿魏酸(2.180 min)?；谫|(zhì)譜選擇優(yōu)化，這些酚酸的離子對(duì)不同，具有各自的離子通道(圖1)，即使出峰時(shí)間相同也不影響各自準(zhǔn)確定量。

2.2 可溶性游離態(tài)酚酸

如圖2所示，隨著甲醇或者乙醇比例(體積比)的提高，可溶性游離態(tài)香草酸、綠原酸沒食子酸和丁香酸提取率呈緩慢下降趨勢(shì)，其中50%甲醇對(duì)可溶性游離態(tài)綠原酸和沒食子酸提取率高于其他比例溶劑，甲醇組可溶性游離態(tài)綠原酸提取量為乙醇組的近2倍，50%甲醇達(dá)到提取峰值(30.67 μg/g)；50%乙醇對(duì)可溶性游離態(tài)香草酸和丁香酸提取率高于其他比例溶劑，且不同溶劑對(duì)可溶性游離態(tài)香草酸和綠原酸提取率差異顯著(P<0.05)，對(duì)可溶性游離態(tài)丁香酸提取效率差異極顯著(P<0.01)；而可溶性游離態(tài)原兒茶酸則相反，隨著甲醇或者乙醇比例的提高，其提取率升高，純乙醇提取率顯著高于含水乙醇和不同比例甲醇。

隨著甲醇或乙醇比例的提高，其余9種可溶性游離態(tài)酚酸均呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，在70%或80%達(dá)到峰值，其中80%甲醇對(duì)可溶性游離態(tài)單寧酸(22.32 μg/g)和肉桂酸提取率顯著高于其他比例溶劑(P<0.01)，70%乙醇對(duì)可溶性游離態(tài)對(duì)羥基苯甲酸提取率高于其他比例溶劑(P<0.05)；甲醇組對(duì)可溶性游離態(tài)肉桂酸的提取率顯著高于乙醇組(P<0.01)，對(duì)可溶性游離態(tài)芥子酸提取率略高于乙醇組，對(duì)可溶性對(duì)羥基苯甲酸提取率略低于乙醇組，而對(duì)于可溶性游離態(tài)咖啡酸、闊馬酸、鞣花酸和阿魏酸提取率與乙醇組無(wú)差異(P>0.05)，不同比例的甲醇組和乙醇組溶劑對(duì)于可溶性游離態(tài)鞣花酸的提取率接近，為402.27～471.90 μg/g。鞣花酸是沒食子酸的二聚衍生物，對(duì)如結(jié)腸癌、食管癌、肝癌、肺癌、舌及皮膚腫瘤有明顯的抑制作用[24]。由于鞣花酸含量占14種酚酸里的80%左右，所以不同比例溶劑對(duì)可溶性游離態(tài)酚酸總量的提取率表現(xiàn)為與可溶性游離態(tài)鞣花酸趨勢(shì)一致。

圖2 可溶性游離態(tài)酚酸的溶劑提取率比較Fig.2 Comparison of solvent extraction efficiency of soluble free phenolic acids

2.3 可溶性酯化態(tài)酚酸

如圖3所示，除了可溶性酯化態(tài)丁香酸和綠原酸外，其余12種可溶性酯化態(tài)酚酸的提取率隨著甲醇或乙醇比例的提高呈現(xiàn)出先升后降，其中甲醇組對(duì)可溶性酯化態(tài)對(duì)羥基苯甲酸、阿魏酸、闊馬酸、肉桂酸和咖啡酸均顯著高于乙醇組(P< 0.01)，80%甲醇達(dá)到提取峰值[(1.12±0.099) ～ (17.13±2.03)μg/g]；60%乙醇和70%乙醇分別對(duì)可溶性酯化態(tài)沒食子酸[(496.75±39.85) μg/g]和芥子酸[(7.22±0.68) μg/g]提取率達(dá)到峰值，極顯著高于其他組(P<0.01)；70%乙醇和80%乙醇分別對(duì)可溶性酯化態(tài)香草酸[(19.15±2.12) μg/g]、原兒茶酸[(49.85±5.16) μg/g]、和單寧酸[(163.00±17.08) μg/g]提取率達(dá)到峰值，顯著高于其他組(P<0.05)；可溶性酯化態(tài)丁香酸和綠原酸隨著甲醇比例提高先升后降，而隨著乙醇比例提高則顯著下降，70%甲醇和80%甲醇分別對(duì)可溶性酯化態(tài)丁香酸和綠原酸的提取率最高，為(37.02±3.91) μg/g和(273.58±30.06) μg/g。同一比例的甲醇水溶液或乙醇水溶液，對(duì)可溶性酯化態(tài)對(duì)香豆酸的提取率差異不顯著(P>0.05)。

可溶性酯化態(tài)酚酸以鞣花酸、沒食子酸、綠原酸和單寧酸為主(占比總和90%)，綠原酸是一種重要的生物活性物質(zhì)，具有抗菌、抗病毒、增高白血球、保肝利膽、抗腫瘤、降血壓、降血脂、清除自由基和興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等作用[24]。單寧酸能抑制蛇毒蛋白的活性，對(duì)眼鏡蛇等毒素有很強(qiáng)的解毒作用，能治療腸道細(xì)菌傳染病，并可抑制突變，對(duì)防止UV誘發(fā)的皮膚癌和皮膚老化有效果[24]。14種可溶性酯化態(tài)酚酸的總量提取率為80%甲醇>70%甲醇>70%乙醇>80%乙醇>90%甲醇=60%乙醇>90%乙醇=100%甲醇>50%甲醇=100%乙醇，不同溶劑差異顯著(P<0.05)。

2.4 不溶性結(jié)合態(tài)酚酸

如圖4所示，甲醇和乙醇比例從50%提高到80%，不溶性結(jié)合態(tài)香草酸的提取率無(wú)顯著變化，比例提高到90%和100%時(shí)提取率顯著上升，乙醇組提取率為甲醇組的1.5倍；而其他13種不溶性結(jié)合態(tài)酚酸隨著甲醇和乙醇比例的提高，其提取率均表現(xiàn)為先升后降；甲醇組對(duì)不溶性結(jié)合態(tài)芥子酸和肉桂酸的提取率極顯著高于乙醇組(P<0.01)，而對(duì)于不溶性結(jié)合態(tài)香草酸、原兒茶酸、咖啡酸和丁香酸提取率顯著低于乙醇組(P<0.05)；甲醇組對(duì)不溶性結(jié)合態(tài)對(duì)羥基苯甲酸、阿魏酸和單寧酸的提取率顯著高于乙醇組(P<0.05)，80%甲醇達(dá)到提取率峰值，分別為(9.32±0.88) μg/g、(7.99±0.55) μg/g和(121.60±10.61) μg/g。

圖3 可溶性酯化態(tài)酚酸的溶劑提取率比較Fig.3 Comparison of solvent extraction efficiency of soluble esterified phenolic acids

圖4 不溶性結(jié)合態(tài)酚酸的溶劑提取率比較Fig.4 Comparison of solvent extraction efficiency of insoluble bound phenolic acids

不同比例的甲醇提取不溶性結(jié)合態(tài)沒食子酸差異不顯著[(381.80±40.12) ～ (618.37±60.17)μg/g]，而70%乙醇提取率最高[(1 070.26±99.36)μg/g]，且與其他比例乙醇的提取率差異極顯著(P<0.01)。沒食子酸具有抗炎、抗突變、抗氧化、抗自由基等多種生物學(xué)活性，同時(shí)具有抗腫瘤作用，可以抑制肥大細(xì)胞瘤的轉(zhuǎn)移[24]。不同比例的甲醇和乙醇對(duì)不溶性結(jié)合態(tài)對(duì)香豆酸、綠原酸、鞣花酸和闊馬酸的提取率差異不顯著(P>0.05)。不溶性結(jié)合態(tài)酚酸以沒食子酸和鞣花酸為主，占比均大于40%，故70%乙醇對(duì)14種不溶性結(jié)合態(tài)酚酸的提取率高于甲醇組和其他比例乙醇(P< 0.05)，為(2 320.34±187.53)μg/g。

3 結(jié)論

綜合以上，80%甲醇和70%乙醇適合提取核桃內(nèi)種皮中大部分可溶性游離態(tài)酚酸、可溶性酯化態(tài)酚酸和不溶性結(jié)合態(tài)酚酸。可溶性游離態(tài)香草酸、綠原酸、沒食子酸的提取率隨著甲醇或乙醇比例的提高而降低；60%甲醇可以獲得較高的不溶性結(jié)合態(tài)芥子酸；乙醇組溶液尤其是50%乙醇可以提取到更多的可溶性游離態(tài)丁香酸；60%乙醇能從核桃內(nèi)種皮提取到較多的可溶性酯化態(tài)沒食子酸；100%乙醇有利于提取可溶性游離態(tài)原兒茶酸和不溶性結(jié)合態(tài)香草酸。不同比例的甲醇和乙醇溶液對(duì)核桃內(nèi)種皮中不同形態(tài)酚酸的提取率比較，可以直接應(yīng)用于核桃內(nèi)種皮各種酚酸的提取、純化，不僅有利于核桃廢棄物的綜合開發(fā)利用，也完善了核桃內(nèi)種皮次生代謝產(chǎn)物研究。