呂明珊，袁藝洋，邢軍，王亮，艾合買提江·艾海提，茹先古麗·買買提依明*

(1.新疆大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊 830046；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣州 510642)

新疆藥桑在植物分類學(xué)上屬?？?Moraceac)、桑屬(MorusL.)、黑桑種(MorusnigraL.)[1]，是新疆特有生長(zhǎng)環(huán)境下的桑種資源。藥桑葚富含多種氨基酸和固形物等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是新疆地區(qū)的民間藥材。藥桑性寒、無(wú)毒，具有保肝護(hù)肝，治療耳眼不靈，緩解風(fēng)濕性關(guān)節(jié)疼痛等藥用價(jià)值。藥桑葚中多酚類化合物[2-3]、還原糖含量、總黃酮[4]和維生素含量均高于其他桑葚。但藥桑葚屬于季節(jié)性果蔬，果肉軟嫩多汁，不易儲(chǔ)存及運(yùn)輸，常被加工成果酒、果醋、果醬、冰淇淋、糖漿等[5]。但藥桑葚酵素這種生物發(fā)酵制品卻很少見，與之相關(guān)的文獻(xiàn)也不多。

酵素是一種利用微生物進(jìn)行發(fā)酵得到的保健食品，其采用各種水果、蔬菜，經(jīng)過(guò)前處理后使用乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵，其產(chǎn)物富含各種有機(jī)酸[6]、維生素、多酚類化合物等。且果蔬汁經(jīng)過(guò)發(fā)酵后較好地豐富了其原本的口感，發(fā)酵時(shí)產(chǎn)生的發(fā)酵產(chǎn)物還能起到調(diào)節(jié)腸道菌群、促進(jìn)消化、抗炎、抗氧化等作用[7-8]。以藥桑葚為原材料制作酵素不但解決了藥桑葚不易儲(chǔ)存的問(wèn)題，而且能滿足消費(fèi)者們對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需求?，F(xiàn)報(bào)道的新疆藥桑葚發(fā)酵果汁的發(fā)酵工藝多為單菌發(fā)酵，但是近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)混菌發(fā)酵更能豐富酵素的營(yíng)養(yǎng)和口感，不同乳酸菌發(fā)酵時(shí)利用碳水化合物產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸和風(fēng)味物質(zhì)，使酵素的口感更佳[9]。

超氧化物歧化酶(SOD)是人體內(nèi)一種抗氧化酶，具有抗衰、抗疲勞的效果[10]，同時(shí)也是評(píng)判酵素營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)，從藥桑葚中提取出的酚類化合物被證實(shí)擁有較強(qiáng)的自由基清除能力[11]，故而以總酚質(zhì)量濃度和SOD活力為指標(biāo)優(yōu)化發(fā)酵工藝。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究藥桑葚酵素工藝優(yōu)化提高酵素內(nèi)SOD活力、總酚含量，得到最優(yōu)的藥桑葚酵素發(fā)酵工藝條件，并研究用最優(yōu)工藝條件制得的藥桑葚酵素樣品的SOD值、總酚含量及抗氧化能力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藥桑葚：新疆阿克蘇地區(qū)庫(kù)車市生產(chǎn)；乳酸菌：中國(guó)微生物菌種保藏中心；福林酚試劑(1 mol/L)：上海源葉生物科技有限公司；沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(HPLC≥98%)：天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司；MRS肉湯培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶：諾維信有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DHP-9052恒溫培養(yǎng)箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；WZS手持式糖度計(jì) 上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司；HH數(shù)顯恒溫水浴鍋、KX-101恒溫干燥箱、RH-QG全溫振蕩器/搖床 江蘇科析儀器有限公司；1004分析天平 上海越平科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-2G超凈工作臺(tái) 上海滬凈醫(yī)療器械有限公司；LS-150LD立式壓力蒸汽滅菌器 江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；UV752紫外可見分光光度計(jì) 上海佑科儀器儀表有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 藥桑葚酵素工藝流程

新鮮的藥桑葚→打漿→酶解→調(diào)固形物→滅酶→(菌種→活化→擴(kuò)大培養(yǎng))接種→發(fā)酵→終止發(fā)酵→罐裝→4 ℃儲(chǔ)藏。

1.3.1.1 菌種活化及培養(yǎng)

乳酸菌：MRS液體培養(yǎng)基，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，傳代2～3次備用。

1.3.1.2 藥桑葚酵素工藝要點(diǎn)

經(jīng)過(guò)之前的工作，確定了最佳的藥桑葚發(fā)酵菌種配方為鼠李糖乳桿菌∶副干酪乳桿菌為1∶3，本文將應(yīng)用這一配方進(jìn)行藥桑葚酵素的工藝條件優(yōu)化和抗氧化性評(píng)估。

選取紫色、成熟的藥桑葚，剔除病害果。使用破壁機(jī)打漿，將果汁放入1000 mL三角瓶中，酶添加量0.4%(果膠酶∶纖維素酶∶半纖維素酶為2∶1∶1)后放置在55 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)酶解3 h，調(diào)固形物，85 ℃滅酶30 min，冷卻至37 ℃接種，藥桑葚汁中菌密度為8.33×106CFU/mL，然后用膠塞封閉瓶口進(jìn)行厭氧發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間為16.4 h。

1.3.2 測(cè)定方法

1.3.2.1 總酚質(zhì)量濃度的測(cè)定

總酚質(zhì)量濃度的測(cè)定采用福林酚法[12]。采用0～0.02 mg/mL的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為：y=0.8686x+0.0053(x為沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度，mg/mL；y為吸光值)，R2=0.9987。根據(jù)線性回歸方程計(jì)算樣液的總酚質(zhì)量濃度。

1.3.2.2 SOD活力的檢測(cè)

利用SOD活力檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.2.3 羥自由基清除率的測(cè)定[13]

藥桑葚酵素用去離子水稀釋，配制成濃度為10，20，30，40，50 mg/mL的酵素稀釋液；每組取0.5 mL 9 mmol/mL FeSO4溶液，0.5 mL 9 mmol/mL水楊酸溶液加入已標(biāo)記的試管中，搖勻，分別加入1 mL不同濃度的酵素溶液，空白組加入1 mL去離子水，最后加入0.5 mL 9 mmol/mL H2O2溶液，搖勻后于37 ℃水浴避光加熱反應(yīng)15 min后取出，用去離子水代替H2O2溶液的本底作為參比在510 nm處測(cè)定吸光度值。

式中：W為羥自由基清除率；A0為空白組吸光度；A1為實(shí)驗(yàn)組吸光度；A2為參比吸光度。

1.3.2.4 DPPH自由基清除率的測(cè)定[14]

藥桑葚酵素用去離子水稀釋，配制成濃度為10，20，30，40，50 mg/mL的酵素稀釋液；每組取2 mL 0.2 mmol/mL DPPH溶液(由無(wú)水乙醇配制)加入標(biāo)記好的試管中，再分別加入2 mL不同濃度的酵素溶液，空白組加入等量去離子水；常溫下避光反應(yīng)30 min，以無(wú)水乙醇代替DPPH溶液的本底作為參比，測(cè)定其在517 nm下的吸光度值。

式中：W為DPPH自由基清除率；A0為空白組吸光度；A1為實(shí)驗(yàn)組吸光度；A2為參比吸光度。

1.3.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.3.1 發(fā)酵時(shí)間的選取

在發(fā)酵溫度37 ℃，總?cè)樗峋臃N量6×106CFU/mL，固形物添加量1.5 °Brix，總酶添加量0.4%，酶解時(shí)間3 h，測(cè)定發(fā)酵時(shí)間0，3，6，9，12，15，18，21 h時(shí)發(fā)酵液的SOD活力及總酚含量。

1.3.3.2 最佳發(fā)酵溫度的選取

其他條件同1.3.3.1，測(cè)定發(fā)酵時(shí)間15 h，發(fā)酵溫度27，32，37，42，47 ℃時(shí)5個(gè)樣品中發(fā)酵液的SOD活力及總酚含量。

1.3.3.3 最佳接種量的選取

其他條件同1.3.3.1，測(cè)定發(fā)酵時(shí)間15 h，總?cè)樗峋臃N量1×106，3×106，6×106，9×106，12×106，15×106CFU/mL時(shí)6個(gè)樣品中發(fā)酵液的SOD活力及總酚含量。

1.3.3.4 最佳固形物添加量的選取

其他條件同1.3.3.1，測(cè)定發(fā)酵時(shí)間15 h，固形物添加量0，0.5，1，1.5，2，2.5，3 °Brix時(shí)7個(gè)樣品中發(fā)酵液的SOD活力及總酚含量。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化藥桑葚酵素工藝

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，使用Design Expert軟件，根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，選擇發(fā)酵時(shí)間(A)、發(fā)酵溫度(B)、接種量(C)、固形物添加量(D)為自變量，以發(fā)酵液的SOD活力、總酚含量為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面分析法，設(shè)計(jì)四因素三水平實(shí)驗(yàn)，因素水平見表1，對(duì)藥桑葚酵素發(fā)酵工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)均為3次以上實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0進(jìn)行分析,使用GraphPad Prism 8進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵液的影響

圖1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵液中SOD活力和總酚含量的影響Fig.1 Effect of fermentation time on SOD activity and total phenol content in fermentation broth

實(shí)驗(yàn)所用乳酸菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期所需時(shí)間為6 h，進(jìn)入穩(wěn)定期所需培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)為12 h，酵素中發(fā)酵產(chǎn)物隨著時(shí)間的增加不斷積累。由圖1可知，3～15 h，SOD活力迅速增長(zhǎng)，SOD活力在15 h時(shí)達(dá)到最大值313 U/g，18 h后SOD活力呈現(xiàn)緩慢降低的趨勢(shì)?？偡淤|(zhì)量濃度在12 h時(shí)達(dá)到最大值8.58 mg/g，隨著時(shí)間繼續(xù)增加，總酚質(zhì)量濃度下降至7.58 mg/g，所以選擇發(fā)酵時(shí)間15 h較為合理。

2.1.2 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵液的影響

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵液中SOD活力和總酚含量的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on SOD activity and total phenol content in fermentation broth

發(fā)酵溫度是影響SOD值和總酚質(zhì)量濃度的關(guān)鍵因素，由圖2可知，隨著溫度的升高，SOD活力在37 ℃時(shí)達(dá)到最高值311 U/g，隨著溫度繼續(xù)升高，SOD值持續(xù)下降?？偡淤|(zhì)量濃度在32～37 ℃持續(xù)升高直至37 ℃時(shí)達(dá)到最高值8.52 mg/g，37 ℃后呈下降趨勢(shì)。乳酸菌的適宜生長(zhǎng)溫度一般在30～37 ℃，兩者的下降可能是由于溫度過(guò)高影響菌體生長(zhǎng)，導(dǎo)致SOD活力和總酚合成能力下降，因此最佳發(fā)酵溫度為37 ℃。

2.1.3 接種量對(duì)發(fā)酵液的影響

圖3 接種量對(duì)發(fā)酵液中SOD活力和總酚含量的影響Fig.3 Effect of inoculation amount on SOD activity and total phenol content in fermentation broth

由圖3可知，當(dāng)乳酸菌接種量較低時(shí)，其生長(zhǎng)代謝速度緩慢，代謝產(chǎn)物的SOD活力和總酚含量都明顯較低，當(dāng)接種量達(dá)到6×106CFU/mL時(shí)，乳酸菌生長(zhǎng)代謝速度適中，SOD活力達(dá)到最大值311 U/g，總酚質(zhì)量濃度也達(dá)到最大值8.59 mg/g。當(dāng)接種量增至9×106CFU/mL時(shí)，相較接種量6×106CFU/mL無(wú)顯著差異。當(dāng)接種量達(dá)到1.2×107CFU/mL時(shí)，因?yàn)槿樗峋纳L(zhǎng)代謝速度過(guò)快，發(fā)酵過(guò)度，總酸含量過(guò)高，從而影響SOD活力。適當(dāng)增加乳酸菌含量，其代謝產(chǎn)物有機(jī)酸和固形物的存在有利于酚類物質(zhì)的溶出。同時(shí)，大分子酚類物質(zhì)降解成小分子酚類物質(zhì)也能夠增加總酚的質(zhì)量濃度[15]，故選擇接種量為6×106CFU/mL最佳。

2.1.4 固形物添加量對(duì)發(fā)酵液的影響

圖4 固形物添加量對(duì)發(fā)酵液中SOD活力和總酚含量的影響Fig.4 Effect of solids additive amount on SOD activity and total phenol content in fermentation broth

由圖4可知，SOD活力隨著固形物添加量的增高呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，但總體變化趨勢(shì)不明顯。隨著固形物添加量增大至1.5 °Brix，SOD活力達(dá)到最大值316 U/g?？偡淤|(zhì)量濃度隨著固形物添加量的增高在1.5 °Brix時(shí)達(dá)到最大值8.58 mg/g，隨著固形物添加量的繼續(xù)增高，總酚質(zhì)量濃度迅速下降，故選擇1.5 °Brix固形物添加量較為合適。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化藥桑葚酵素發(fā)酵工藝

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方差分析及結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，選取發(fā)酵時(shí)間(A)、發(fā)酵溫度(B)、乳酸菌接種量(C)和固形物添加量(D)作為響應(yīng)面優(yōu)化的考察因素，以產(chǎn)品的SOD活力和總酚質(zhì)量濃度為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)四因素三水平實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The experimental results of response surface

續(xù) 表

采用 Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行多元回歸擬合，得出SOD活力(Y1)和總酚質(zhì)量濃度(Y2)對(duì)發(fā)酵時(shí)間(A)、發(fā)酵溫度(B)、接種量(C)、固形物添加量(D)的二次多項(xiàng)回歸方程為分別為：

Y1=317.75+23.81A+11.17B+15.65C+9.36D-5.49AB-1.21AC-2.39AD+1.33BC+1.29BD+3.81CD-20.59A2-24.49B2-12.66C2-9.18D2。

(1)

Y2=8.90+0.34A-0.11B+0.22C+0.19D-0.022AB-7.500E-003AC-2.500E-003AD-0.067BC-5.000E-003BD-0.020CD-0.51A2-0.46B2-0.093C2-0.097D2。

(2)

式(1)、式(2)中：Y1為SOD活力，Y2為總酚質(zhì)量濃度，A為發(fā)酵時(shí)間，B為發(fā)酵溫度，C為接種量，D為固形物添加量。

SOD的方差分析和顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 SOD活力回歸模型方差分析及顯著性檢驗(yàn)

續(xù) 表

表4 總酚質(zhì)量濃度回歸模型方差分析及顯著性檢驗(yàn)Table 4 Analysis of variance and significance test of regression model of total phenol concentration

由表3和表4可知，兩個(gè)回歸方程模型極顯著(P<0.0001)，失擬項(xiàng)檢驗(yàn)結(jié)果不顯著。相關(guān)系數(shù)R2(SOD活力)是0.9914，R2(總酚質(zhì)量濃度)是0.9706，表明SOD活力和總酚質(zhì)量濃度的實(shí)測(cè)值和預(yù)測(cè)值之間擬合度較好，所以此模型擬合效果好，可用來(lái)分析預(yù)測(cè)乳酸菌發(fā)酵藥桑葚酵素的工藝參數(shù)。

各因素對(duì)SOD活力的影響為 A(發(fā)酵時(shí)間)>C(接種量)>B(發(fā)酵溫度)>D(固形物添加量)，各因素對(duì)總酚質(zhì)量濃度的影響為A(發(fā)酵時(shí)間)>C(接種量)>D(固形物添加量)>B(發(fā)酵溫度)。

2.2.2 響應(yīng)面分析各因素交互作用對(duì)發(fā)酵藥桑葚汁SOD活力和總酚質(zhì)量濃度的影響

a.發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)SOD活力的交互影響

b.發(fā)酵溫度和固形物添加量對(duì)SOD活力的交互影響

c.接種量和固形物添加量對(duì)SOD活力的交互影響

d.發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度對(duì)總酚含量的交互影響

由圖 5可知，發(fā)酵時(shí)間與發(fā)酵溫度、接種量與固形物添加量的交互作用對(duì)SOD活力影響的顯著性與表3中交互項(xiàng)P值的分析結(jié)果一致。此外，等高線的形狀亦可以判斷交互作用的強(qiáng)弱，由圖5中b可知，發(fā)酵溫度與固形物添加量的交互作用也顯現(xiàn)出顯著性良好的橢圓形，等高線的頂點(diǎn)就是響應(yīng)值SOD活力的最大值。a，b，c，d的響應(yīng)面圖像均開口朝下，表明兩個(gè)響應(yīng)值隨著各個(gè)因素值的增大而呈現(xiàn)出增大的趨勢(shì)，達(dá)到響應(yīng)值最大值后，響應(yīng)值即隨著因素值的增大而減小，此時(shí)，響應(yīng)面的頂點(diǎn)處為響應(yīng)值的最大值。

經(jīng)Design-Expert 8.0.6軟件分析得到的最佳優(yōu)化條件為發(fā)酵時(shí)間為16.37 h，發(fā)酵溫度36.23 ℃，乳酸菌接種量8.33×106CFU/mL，固形物添加量1.59 °Brix。采用這一結(jié)果并結(jié)合實(shí)際條件，發(fā)酵條件改為：發(fā)酵時(shí)間為16.4 h，發(fā)酵溫度36 ℃，乳酸菌接種量8.33×106CFU/mL，固形物添加量1.6 °Brix，得到的試驗(yàn)結(jié)果為SOD活力329 U/g，總酚含量9.11 mg/g。與理論預(yù)測(cè)值基本一致，建立的模型很好地提高了發(fā)酵產(chǎn)物的SOD活力，同時(shí)也保證了總酚的質(zhì)量濃度處于較高水平，模型較好地反映了發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間是對(duì)發(fā)酵結(jié)果影響最大的因素。

2.3 抗氧化性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 藥桑葚酵素對(duì)羥自由基的清除能力

圖6 藥桑葚酵素對(duì)·OH清除能力Fig.6 The scavenging ability of Morus nigra L. enzyme on ·OH

羥自由基具有較強(qiáng)的抗氧化能力是評(píng)判樣品抗氧化性的一個(gè)重要指標(biāo)。由圖6可知，藥桑葚酵素對(duì)羥自由基有很強(qiáng)的清除作用，并且隨著藥桑葚濃度增至40 mg/mL時(shí)羥自由基清除率達(dá)到最大值93.71%。結(jié)果表明，藥桑葚酵素具有羥自由基清除能力，且隨著藥桑葚濃度的增加清除率隨之增加。

2.3.2 藥桑葚酵素對(duì)DPPH自由基的清除能力

圖7 藥桑葚酵素對(duì)DPPH·清除能力Fig.7 The scavenging ability of Morus nigra L. enzyme on DPPH·

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的自由基，當(dāng)具有抗氧化性的物質(zhì)進(jìn)入DPPH溶液中時(shí)，其吸光值會(huì)發(fā)生改變。由圖7可知，藥桑葚酵素對(duì)DPPH自由基的清除率隨著酵素濃度的升高而升高，加入低濃度酵素樣品時(shí)即表現(xiàn)出很強(qiáng)的自由基清除能力(90.85%)，當(dāng)藥桑葚酵素濃度為30 mg/mL時(shí)清除率穩(wěn)定在97%左右，說(shuō)明藥桑葚酵素對(duì)DPPH自由基的清除能力很強(qiáng)。

3 結(jié)論

這項(xiàng)工作通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定了藥桑葚酵素混菌發(fā)酵響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的條件，并利用SOD活力、總酚質(zhì)量濃度雙響應(yīng)值聯(lián)合確定了藥桑葚酵素混菌發(fā)酵的最佳條件：發(fā)酵時(shí)間為16.4 h，發(fā)酵溫度36 ℃，乳酸菌接種量8.33×106CFU/mL，固形物添加量1.6 °Brix。得到的試驗(yàn)結(jié)果為SOD活力329 U/g，總酚含量9.11 mg/g。并對(duì)所得到的藥桑葚酵素進(jìn)行抗氧化性評(píng)估，DPPH自由基最大清除率達(dá)到97%，羥自由基清除率最大值為93.71%。藥桑葚酵素具有良好的抗氧化性，作為一種酵素飲品可以很好地滿足人們對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需求。