孫 桐，葛雪松，張新勇，卓 靜

(宿遷市食品藥品檢驗(yàn)所， 江蘇 宿遷 223800)

美洛昔康(Meloxicam)，化學(xué)名4-羥基-2-甲基-N-(5-甲基-2-噻唑基)-2H-1，2-苯并噻嗪-3-羧酰胺1，1-二氧化物，是一種非類固醇解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥。由德國Boehringer Ingelheim公司于1996年首次在南非上市，具有鎮(zhèn)痛、抗炎、解熱作用，臨床適用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和疼痛性骨關(guān)節(jié)炎的對癥治療。根據(jù)美洛昔康原料藥的生產(chǎn)工藝[1]分析，4-羥基-2-甲基-2H-1，2-苯并噻嗪-3-羧酸乙酯-1，1-二氧化物(雜質(zhì)A)和2-氨基-5-甲基噻唑(雜質(zhì)B)是美洛昔康合成工藝中兩種重要的中間體，極有可能殘留在原料藥中，最終傳遞到成品中[2-5]。雜質(zhì)A，B均有一定的毒性，而在現(xiàn)行的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)中，僅僅使用供試品稀釋的自身對照法對雜質(zhì)進(jìn)行控制，具有很大的局限性。參照美國藥典USP43-NF38[6]和歐洲藥典EP10.0[7]，原料藥中均對雜質(zhì)A，B進(jìn)行了單獨(dú)的限度控制。為了大眾用藥安全，需嚴(yán)格控制原料藥質(zhì)量，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[8-16]，建立了LC-MS/MS法同時(shí)測定美洛昔康中雜質(zhì)A和雜質(zhì)B。雜質(zhì)A，B的結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 雜質(zhì)A，雜質(zhì)B結(jié)構(gòu)圖

1 儀器與試藥

1.1 儀 器

XEVO TQ-S micro三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用色譜儀，美國Waters；XP205電子天平(0.01 mg)，瑞士梅特勒，Milli-Q超純水機(jī)，美國Millipore。

1.2 試 藥

美洛昔康對照品(批號(hào)：100679-201903，含量100%)，中國食品藥品檢定研究院；美洛昔康雜質(zhì)A對照品(批號(hào)：0301-RC-0087，含量100%)，美國CATO；美洛昔康雜質(zhì)B對照品(批號(hào)：0223-RC-0093，含量95.7%)，美國CATO；美洛昔康原料藥(批號(hào)：20210318，20210319，20210320)，國內(nèi)某藥業(yè)有限公司，甲醇(色譜純)，德國Merk、甲酸(色譜純)，美國ACS，水為自制超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件

采用ACQUITY UPLC?HSS T3 C18(2.1 mm×100 mm， 1.8 μm)色譜柱，流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液-甲醇(45:55)，流速為0.3 mL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣盤溫度10 ℃，進(jìn)樣體積1 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源(ESI)，多反應(yīng)離子監(jiān)測模式(MRM)，正離子掃描，脫溶劑溫度：500 ℃，干燥氣流速：15 L/min，毛細(xì)管電壓：2.5 kV，質(zhì)譜監(jiān)測時(shí)間：0～5.9 min(系統(tǒng)適用性條件下監(jiān)測時(shí)間：0～8 min)，其他質(zhì)譜條件見表1，表1中加*的為定量離子。

表1 質(zhì)譜分析參數(shù)

2.2 溶液的配制

2.2.1 供試品溶液

精密稱取美洛昔康原料藥約50 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得美洛昔康的供試品溶液。

2.2.2 混合對照品溶液

分別精密稱取美洛昔康，雜質(zhì)A和雜質(zhì)B的對照品適量，用甲醇溶解并稀釋至每1 mL分別含美洛昔康，雜質(zhì)A和雜質(zhì)B約1 μg的溶液，作為單一對照品貯備液①，②，③；精密量取單一對照品貯備液①，②，③適量，用70%甲醇水稀釋至每1 mL含美洛昔康，雜質(zhì)A和雜質(zhì)B 均約為0.1 μg的系統(tǒng)適應(yīng)性溶液；精密量取單一對照品貯備液②，③適量，用70%甲醇稀釋至每1 mL含雜質(zhì)A和雜質(zhì)B均約為0.1 μg的混合對照品貯備液。

2.3 方法考察

2.3.1 專屬性實(shí)驗(yàn)

取單一對照品貯備液①，②，③各 0.1 μL，空白溶劑(70%甲醇水)，系統(tǒng)適應(yīng)性溶液，混合對照品貯備液和供試品溶液各 1 μL，分別注入液質(zhì)聯(lián)用儀，記錄質(zhì)譜圖和色譜圖，見圖2，3。結(jié)果顯示，各成分保留時(shí)間：雜質(zhì)B 0.72 min，雜質(zhì)A 5.13 min，美洛昔康6.18 min；空白溶劑對雜質(zhì)無干擾，各色譜峰之間無干擾。

圖2 美洛昔康及各雜質(zhì)的質(zhì)譜圖

2.3.2 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2.2”項(xiàng)下的混合對照品貯備液，用70%甲醇水稀釋成含雜質(zhì)A 1.03，2.06，4.12，10.32，20.64，51.50，100.30 ng/mL；雜質(zhì)B 0.98，1.96，3.92，9.80，19.60，49.0，98.0 ng/mL的混合對照品溶液。取上述混合對照品溶液，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，溶液濃度X(ng/mL)，進(jìn)行線性回歸。雜質(zhì)A，B的線性方程如下：

這一年圖科回歸，總經(jīng)理葉鵬又選來了一個(gè)瘦高靈活，能里能外的外援拉米扎納。這兩人特點(diǎn)互補(bǔ)性格開朗，每場都能給對手帶來強(qiáng)大的壓力，人稱“黃金雙槍”。

Y=393.858X-200.006(r=0.9992)，雜質(zhì)A在1.03～100.3 ng/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好

Y=1087.44X-402.125(r=0.9996)，雜質(zhì)B在0.98～ 98.0 ng/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 定量限和檢出限

取“2.2.2”項(xiàng)下的混合對照品貯備液，用70%甲醇水，逐級(jí)稀釋，稀釋到雜質(zhì)A，B峰的信噪比(S/N)約為10的時(shí)候，溶液濃度作為定量限；信噪比(S/N)約為3的時(shí)候，溶液濃度作為檢出限。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：雜質(zhì)A的檢出限0.31 ng/mL，定量限0.83 ng/mL；雜質(zhì)B的檢出限0.15 ng/mL，定量限0.51 ng/mL。

2.3.4 精密度試驗(yàn)

取線性考察下混合對照品溶液(雜質(zhì)A 10.32 ng/mL，雜質(zhì)B 9.80 ng/mL)，連續(xù)進(jìn)樣6次，以峰面積計(jì)算各雜質(zhì)的RSD，雜質(zhì)A的RSD=2.6%(n=6)；雜質(zhì)B的RSD=1.8%(n=6)，結(jié)果表明方法的精密度良好。

圖3 空白溶劑(A)， 系統(tǒng)適應(yīng)性溶液(B)， 混合對照品(C)及供試品(D)的色譜圖

2.3.5 中間精密度試驗(yàn)

由另一位實(shí)驗(yàn)人員在同一臺(tái)液質(zhì)聯(lián)用儀上做精密度試驗(yàn)，結(jié)合兩者的結(jié)果計(jì)算RSD，雜質(zhì)A的RSD=3.7%(n=12)；雜質(zhì)B的RSD=2.9%(n=12)。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn)

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

配置混合對照品溶液(雜質(zhì)A，B濃度均約為100 ng/mL)，在室溫(20 ℃)情況下放置0，2，4，6，8后進(jìn)樣分析，以峰面積計(jì)算。結(jié)果顯示：雜質(zhì)A的RSD=3.1%(n=5)，雜質(zhì)B的RSD=1.9%(n=5)，說明雜質(zhì)A，B在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.8 耐用性試驗(yàn)

取美洛昔康原料藥按“2.2.1”項(xiàng)下的方法平行配置2份供試品溶液，分別在色譜柱溫度(33 ℃和37 ℃)，流動(dòng)相比例[0.1%甲酸水溶液:甲醇(43:57)，0.1%甲酸水溶液：甲醇(47:53)]，流動(dòng)相流速(0.29，0.31 mL/min)下進(jìn)樣分析，計(jì)算各雜質(zhì)含量，與原有色譜條件下的含量進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，當(dāng)色譜條件在溫度，流速，流動(dòng)相比例細(xì)微變化的情況下，各雜質(zhì)含量的RSD<10%，說明該方法的耐用性良好。

2.3.9 加樣回收率

精密稱取雜質(zhì)A，B對照品適量，用70%甲醇水稀釋至每1 mL含雜質(zhì)A 0.207 μL，雜質(zhì)B 1.016 μL的混合對照品溶液；精密稱取美洛昔康原料藥(批號(hào)：20210318)約50 mg，共9份，分成三組，分別置50 mL量瓶中，再取上述混合對照品4 mL (3份)，5 mL(3份)，6 mL(3份)置已加入美洛昔康的量瓶中，用70%甲醇水溶解并稀釋至刻度，搖勻，進(jìn)樣分析，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 雜質(zhì)A，B加樣回收率結(jié)果(n=9)

續(xù)表2

2.4 樣品含量測定

取美洛昔康原料藥(20210318，20210319，20210320)，按照“2.2.1”項(xiàng)下的方法配置供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的液質(zhì)聯(lián)用條件進(jìn)樣，計(jì)算雜質(zhì)含量，結(jié)果見表3。

表3 雜質(zhì)含量測定結(jié)果

3 討 論

3.1 系統(tǒng)適應(yīng)性要求

供試品溶液主成分美洛昔康含量過高，建議讓美洛昔康出峰在最后，通過控制質(zhì)譜監(jiān)測時(shí)間在美洛昔康出峰時(shí)間之前，僅記錄雜質(zhì)A，B的色譜圖，讓美洛昔康直接以廢液形式排出，以免污染質(zhì)譜檢測器。

3.2 流動(dòng)相的選擇

雜質(zhì)A和B在ES+模式下離子響應(yīng)強(qiáng)度是ES-模式下的數(shù)倍，流動(dòng)相中加入甲酸銨或乙酸銨抑制雜質(zhì)A和B的電離；相反，流動(dòng)相中引入甲酸，有助于提供H離子，增強(qiáng)待測離子的強(qiáng)度。所以本文著重考察了甲醇-甲酸水，乙腈-甲酸水兩種常見的流動(dòng)相體系。乙腈-甲醇水系統(tǒng)，基線噪音偏高，雜質(zhì)B有明顯拖尾，美洛昔康峰的保留時(shí)間在雜質(zhì)A和B之間，不適合。雜質(zhì)B對酸靈敏，在pH值2～4情況下，離子響應(yīng)強(qiáng)度明顯提高，0.1%的甲酸完全滿足實(shí)驗(yàn)要求。調(diào)整甲醇-甲酸水體系流動(dòng)相比例，高比例水相情況下，雜質(zhì)B峰型差，峰展寬偏大，有明顯拖尾；高比例有機(jī)相時(shí)，雜質(zhì)A與美洛昔康的分離效果變差，通過反復(fù)調(diào)整，最終確定流動(dòng)相比例為甲醇：0.1%甲酸水=55:45。

3.3 雜質(zhì)B同為降解產(chǎn)物的驗(yàn)證

由圖2可見，美洛昔康的子離子(m/z=115.0)與雜質(zhì)B的母離子(m/z=115.0)質(zhì)量數(shù)一致，推測雜質(zhì)B也是美洛昔康的降解產(chǎn)物。美洛昔康對酸堿穩(wěn)定，因此對美洛昔康原料藥分別進(jìn)行高溫，光照，過氧化氫溶液氧化的破壞性試驗(yàn)，然后進(jìn)樣分析雜質(zhì)B的含量，結(jié)果顯示，在高溫，光照下雜質(zhì)B含量有少量提高，氧化破壞下雜質(zhì)B含量提高了幾十倍，破壞性試驗(yàn)驗(yàn)證了雜質(zhì)B也是美洛昔康的降解產(chǎn)物。

3.4 雜質(zhì)A和B的限度

雜質(zhì)A和B未有完整的毒性毒理研究報(bào)告，通過資料文獻(xiàn)僅了解二者都是吸入有毒，雜質(zhì)B對皮膚，粘膜有刺激作用，對眼睛刺激強(qiáng)烈，但可以排除基因雜質(zhì)的可能性。參考化學(xué)藥物雜質(zhì)研究技術(shù)指導(dǎo)原則和ICH相關(guān)規(guī)定，同時(shí)結(jié)合美國藥典USP43-NF38和歐洲藥典EP10.0中美洛昔康原料藥有關(guān)物質(zhì)的質(zhì)量規(guī)定 ，建議將雜質(zhì)A和B的限度均定為0.1%。

4 結(jié) 語

隨著科技的進(jìn)步，藥品質(zhì)量也在逐步提高。藥品質(zhì)量的提高關(guān)鍵在有關(guān)物質(zhì)，對藥物有關(guān)物質(zhì)中各類雜質(zhì)的控制，顯著的影響著藥物的安全和質(zhì)量?，F(xiàn)如今，中國藥典中多數(shù)藥物還是采用主成分稀釋自身對照法，對單個(gè)和雜質(zhì)總量進(jìn)行控制，這么籠統(tǒng)的控制是不夠的，每個(gè)雜質(zhì)的毒性，危害性不盡相同，我們需要對不同的雜質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)分析，進(jìn)而做出單獨(dú)的限度控制。在雜質(zhì)分析領(lǐng)域，LC-MS/MS有著專屬性強(qiáng)，靈敏度高，精密度高，檢測迅速等諸多優(yōu)點(diǎn)，還避免了樣品復(fù)雜的前處理過程，已成為藥品中微量雜質(zhì)分析的首選技術(shù)。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果證明，該方法可以有效的對雜質(zhì)A和B進(jìn)行定性定量分析，為美洛昔康有關(guān)物質(zhì)的質(zhì)量提高提供參考。