姚國榮 黃筱竑 黃惠蓮 汪筱謝 徐彬 朱逢佳 平金良 王燕燕 顧元忻 費玉琴

全球范圍內(nèi)，宮頸癌占惡性腫瘤的5%，在女性惡性腫瘤中其發(fā)病率位居第二，僅次于乳腺癌[1]。宮頸癌的演變歷經(jīng)宮頸上皮內(nèi)瘤變、早期宮頸癌、宮頸浸潤癌這一連續(xù)發(fā)展的過程。HPV持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生的重要危險因素。HPV有200余種亞型。大多數(shù)患者HPV感染經(jīng)1～2年便能自愈，但仍有小部分患者會出現(xiàn)HPV持續(xù)感染、宮頸上皮內(nèi)瘤變甚至發(fā)展為宮頸癌。根據(jù)HPV的致病強度可以將其分為高危型和低危型兩種[2]。在高危型HPV中以HPV16致病性最強，宮頸癌及癌前病變患者中至少50%以上能檢測到HPV16感染。HPV16感染引發(fā)宮頸癌的機制之一是HPV16 E6、E7基因表達(dá)的 E6、E7蛋白通過與宿主p53蛋白和成視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（retinoblastoma protein，pRb）結(jié)合，使p53和pRb蛋白失活，引起細(xì)胞周期失控而永生化，進(jìn)而導(dǎo)致宮頸上皮細(xì)胞惡性增生[3]?；诖耍狙芯客ㄟ^檢測購買的宮頸癌及癌旁正常宮頸黏膜組織芯片中HPV16 E7蛋白表達(dá)水平，探討其與患者預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 以購自上海芯超生物科技有限公司的宮頸癌及癌旁正常宮頸黏膜組織芯片（編號：HUteS154Su01）為研究材料。該芯片收集了117例2010至2011年間宮頸癌患者的癌組織樣本（其中配對的癌組織和癌旁正常宮頸黏膜組織樣本35例，單獨癌組織樣本82例）；患者年齡29～70歲，中位年齡46歲。該組織芯片納入的癌組織均經(jīng)病理學(xué)檢查證實為宮頸癌，患者病歷資料完整、無全子宮切除史、無自身免疫性病變，癌旁正常宮頸黏膜組織與癌組織邊緣距離≤1.5 cm。排除行新輔助放化療、全身系統(tǒng)明顯病變、近期伴陰道和宮頸手術(shù)治療史的患者?；颊呱嫫陔S訪從術(shù)后至2017年3月，隨訪持續(xù)時間86個月。

1.2 宮頸癌及癌旁正常宮頸黏膜組織常規(guī)病理檢查 采用HE染色。將組織芯片按常規(guī)HE染色方法染色，切片置于全景掃描顯微鏡下觀察染色情況。

1.3 宮頸癌及癌旁正常宮頸黏膜組織HPV16 E7蛋白、低分子量角蛋白（low molecular weight，35βH11）、細(xì)胞增殖相關(guān)抗原（cell proliferation antigen，Ki-67）、p53、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）、淋巴細(xì)胞瘤-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）表達(dá)水平檢測 采用免疫組化染色法。將組織芯片脫蠟。室溫下予以3%過氧化氫溶液浸泡15 min，采用蒸餾水沖洗，并予以PBS浸泡 3次。將切片進(jìn)行熱抗原修復(fù)，給予 PBS液沖洗 3次，并滴加 5%BSA以封閉，于室溫環(huán)境下孵育 20 min，并加入對應(yīng)的HPV16 E7抗體（1∶100稀釋，英國 Biorbyt公司）、35βH11 抗體（1∶100稀釋，美國 COVANCE 公司）、Ki-67抗體（1∶400稀釋，美國 CST公司）、p53抗體（1∶500稀釋，英國 Abcam 公司）、EGFR 抗體（1∶150稀釋，美國 CST公司）、P-gp抗體（1∶100稀釋，英國 Abcam 公司）、Bcl-2抗體（1∶200稀釋，英國Abcam公司），于 4℃ 冰箱中放置過夜。次日取出切片，于室溫環(huán)境下放置 0.5 h，予以 PBS液沖洗3次，并加入生物素以標(biāo)記二抗工作液，于37℃環(huán)境下孵育0.5 h。予以PBS沖洗3次，加入鏈霉親和素復(fù)合體，于 37℃ 環(huán)境中孵育20 min，并取PBS沖洗3次。再滴加DAB顯色劑，并予以蘇木素復(fù)染，常規(guī)75%乙醇溶液脫水、透明并封片，于顯微鏡下查看染色情況，并控制反應(yīng)時間，以終止反應(yīng)。取自來水沖洗，予以復(fù)染、脫水、透明并封片。

1.4 HPV16 E7蛋白表達(dá)水平判斷標(biāo)準(zhǔn) （1）染色強度：在低倍鏡（×100）下觀察整個組織視野，細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)淺黃色為弱陽性，計1分；棕黃色為陽性，計2分；棕褐色為強陽性，計3分。（2）染色陽性率：在低倍鏡（×100）下觀察整個組織視野，然后選取3個不同染色強度視野在高倍鏡（×400）下進(jìn)行判讀，計算呈棕黃色的陽性細(xì)胞數(shù)量，如果定位于細(xì)胞核，則在每個視野中隨機計數(shù)100個細(xì)胞，然后計數(shù)100個細(xì)胞中陽性細(xì)胞所占比例，3個視野取平均值；如果定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜，同樣選取3個不同染色強度視野，分別計算陽性率后取平均值。染色強度評分×染色陽性率≥2為HPV16 E7蛋白高表達(dá)，＜2為低表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料以頻數(shù)和構(gòu)成比表示，HPV16 E7蛋白高表達(dá)與低表達(dá)患者比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，HPV16 E7蛋白高表達(dá)與低表達(dá)患者生存曲線的比較采用log-rank檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌及癌旁正常宮頸黏膜組織病理檢查所見HE染色顯示，宮頸癌細(xì)胞核呈深藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈桃紅色。癌旁正常宮頸黏膜細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈淡粉色。免疫組化染色顯示，宮頸癌細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色或棕褐色。癌旁正常宮頸黏膜細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)無著色或呈灰白色。HPV16 E7蛋白表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核。見圖1（插頁）。

圖1 宮頸癌及癌旁正常宮頸黏膜組織病理檢查所見（HE染色和HPV16 E7蛋白染色，×200）

2.2 宮頸癌及癌旁正常宮頸黏膜組織HPV16 E7蛋白表達(dá)水平比較 比較染色強度評分發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織HPV16 E7蛋白表達(dá)水平高于癌旁正常宮頸黏膜組織（P＜0.05），見圖 2。

圖2 宮頸癌及癌旁正常宮頸黏膜組織HPV16 E7蛋白表達(dá)水平比較

2.3 宮頸癌組織HPV16 E7蛋白高表達(dá)與低表達(dá)患者臨床病理特征比較

2.3.1 宮頸癌細(xì)胞質(zhì)HPV16 E7蛋白高表達(dá)與低表達(dá)患者臨床病理特征比較 117例患者中宮頸癌細(xì)胞質(zhì)HPV16 E7蛋白高表達(dá)74例，低表達(dá)43例。與低表達(dá)患者相比，高表達(dá)患者35βH11陽性率升高、p53陽性率升高、EGFR陽性率升高、HPV 16感染率升高（均P＜0.05）；年齡、病理類型、臨床分期、病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ki-67、35βH11等指標(biāo)比較均無統(tǒng)計學(xué)差異（均 P＞0.05），見表 1。

表1 宮頸癌細(xì)胞質(zhì)HPV16 E7蛋白高表達(dá)與低表達(dá)患者臨床病理特征比較[例（%）]

2.3.2 宮頸癌細(xì)胞核HPV16 E7蛋白高表達(dá)與低表達(dá)患者臨床病理特征比較 117例患者中宮頸癌細(xì)胞核HPV16 E7蛋白高表達(dá)28例，低表達(dá)89例。與低表達(dá)患者相比，高表達(dá)患者臨床病理特征比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均 P＜0.05），見表 2。

表2 宮頸癌細(xì)胞核HPV16E7蛋白高表達(dá)與低表達(dá)患者臨床病理特征比較[例（%）]

2.4 宮頸癌組織HPV16 E7蛋白高表達(dá)與低表達(dá)患者預(yù)后情況比較 細(xì)胞質(zhì)HPV16 E7蛋白高表達(dá)和低表達(dá)患者平均生存時間分別為68.76、75.16個月，低表達(dá)患者5年生存率高于高表達(dá)患者（81.4%比66.2%），但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；低表達(dá)患者5年無復(fù)發(fā)生存率高于高表達(dá)患者（79.1% 比 60.8%，P＜0.05）。細(xì)胞核HPV16 E7蛋白高表達(dá)和低表達(dá)患者5年生存率、5年無復(fù)發(fā)生存率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（70.8%比75.0%、68.5% 比 64.3%，均P＞0.05），見圖3。

圖3 宮頸癌組織HPV16 E7蛋白高表達(dá)與低表達(dá)患者預(yù)后情況比較（a、c：分別為細(xì)胞質(zhì)、核HPV16 E7蛋白高表達(dá)與低表達(dá)患者總生存曲線比較；b、d：分別為細(xì)胞質(zhì)、核HPV16 E7蛋白高表達(dá)與低表達(dá)患者無復(fù)發(fā)生存曲線比較）

3 討論

HPV與多種癌癥如宮頸癌、口腔癌、肺癌等的發(fā)生密切相關(guān)，而預(yù)防性HPV疫苗對HPV感染所引起的腫瘤沒有治療作用[3]。高危型HPV持續(xù)感染是宮頸癌的重要致病因素，宮頸鱗癌組織標(biāo)本經(jīng)提取DNA進(jìn)行HPV分型及定量檢測，證實超過99%的宮頸癌組織存在HPV的感染[4]。

高危型HPV持續(xù)感染引起宮頸細(xì)胞學(xué)異型性改變甚至宮頸癌的發(fā)生，其中HPV16、HPV18型最常見，而E6、E7編碼蛋白是宮頸細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵[5]。有研究報道了E6蛋白通過直接抑制細(xì)胞周期蛋白表達(dá)發(fā)揮致癌作用，并且E6可負(fù)性調(diào)控Fas傳導(dǎo)通路，抑制細(xì)胞凋亡，從而使細(xì)胞進(jìn)入S期合成DNA[6]。E7蛋白是HPV主要的致癌因子，E7結(jié)構(gòu)中包含兩個氨基酸保守結(jié)構(gòu)域CR1和CR2，其中CR1與pRb蛋白相關(guān)因子p600相互作用，導(dǎo)致細(xì)胞無限增殖。CR2與腫瘤抑制因子Rb結(jié)合并使其失活，活化轉(zhuǎn)錄因子E2F，激活S期DNA復(fù)制相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄[7]。另外，E7還可抑制細(xì)胞周期蛋白抑制因子，影響細(xì)胞的G1期正常進(jìn)行，使染色體異常復(fù)制，細(xì)胞過度增殖導(dǎo)致癌變。此外，除了調(diào)節(jié)p53和Rb之外，也有其他機制參與了E6和E7蛋白促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的過程。E7蛋白可以加速claspin翻轉(zhuǎn)，引起DNA損傷修復(fù)異常[8]；其他如p21、p27等可以參與E7介導(dǎo)的上皮細(xì)胞分化過程[9-10]；E7蛋白還可以與其他“口袋蛋白”（如p107、p130）等相互作用，通過影響E2F4和E2F5調(diào)節(jié)細(xì)胞周期[11]。此外，E7蛋白還可以參與調(diào)節(jié)EGFR/PI3K/Akt信號通路，控制細(xì)胞周期、生存、代謝和基因組穩(wěn)定性等[12]。

本研究探討宮頸癌組織HPV16 E7蛋白表達(dá)水平與臨床宮頸癌患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示HPV16 E7蛋白與患者無復(fù)發(fā)生存期密切相關(guān)。宮頸癌組織HPV16 E7蛋白高表達(dá)提示宮頸癌不良預(yù)后。