徐玉紅 張慧雅 王運(yùn)根 陳君霞 周艷敏

卵巢癌是人類第七大常見癌癥，死亡率居婦科惡性腫瘤首位。據(jù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計，2018年全球185個國家中，卵巢癌新發(fā)病例超過290 000例，死亡病例超過180 000例[1]。盡管手術(shù)和化療可以延長卵巢癌患者的生存期，但5年生存率仍然很低,不足30%[2]。作為卵巢癌預(yù)后不良的重要因素，腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲的具體機(jī)制尚未完全明確[3]。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是潛在的可用于癌癥篩查和診斷的新型腫瘤標(biāo)志物[4]。lncRNA中ST7-AS1是近幾年新發(fā)現(xiàn)的重要癌癥因子，在胃癌、宮頸癌中表達(dá)異常[5-6]。目前，關(guān)于ST7-AS1在卵巢癌中的表達(dá)情況及具體作用機(jī)制研究相關(guān)報道不多。且經(jīng)starBase3.0軟件分析預(yù)測miR-580-3p為ST7-AS作用靶點(diǎn)?；诖耍狙芯刻接慡T7-AS1在上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC）組織中的表達(dá)情況，并分析其對卵巢癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響及其與miR-580-3p的調(diào)控關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 組織標(biāo)本和細(xì)胞株 收集2019年6月至2021年6月紹興市人民醫(yī)院30例卵巢癌患者手術(shù)切除并經(jīng)病理學(xué)檢查確診的EOC組織標(biāo)本，同時取配對的癌旁正常組織（距病灶邊緣＜3 cm）。EOC患者年齡41～84歲，中位年齡58.5歲；病理分期Ⅰ期11例，Ⅲ期15例，Ⅳ期4例。所有患者術(shù)前均未進(jìn)行新輔助化療或中醫(yī)藥治療，組織標(biāo)本采集后立即置于液氮中凍存。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者知情同意并簽署知情同意書。人卵巢癌A2780細(xì)胞株購自上海icell生物技術(shù)公司。

1.1.2 主要試劑和儀器 胰酶，100 U/ml青、鏈霉素雙抗，F(xiàn)BS購自美國Gibco公司。1640培養(yǎng)基購自上海icell生物技術(shù)公司。TRIzol試劑、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國invitrogen公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司。CCK-8試劑盒購自美國MedChemExpress公司。Transwell小室、Matrigel基質(zhì)膠購自美國Corning公司。引物序列、小干擾 RNA（siRNA）、miR-580-3p 模擬物（miR-580-3p mimic）及陰性對照（NC mimic），ST7-AS1 野生型和突變型雙熒光素酶報告載體均由上海吉瑪制藥公司設(shè)計合成。雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測試劑盒購自美國Promega公司。熒光實時定量PCR儀購自德國Roche公司，倒置熒光顯微鏡購自日本Olympus公司，酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 EOC組織與癌旁正常組織ST7-AS1、miR-580-3p表達(dá)水平檢測 采用熒光實時定量PCR法。利用TRIzol試劑提取組織標(biāo)本中的RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將1 μg的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按熒光定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行qPCR。ST7-AS1的引物序列上游 5'-ACCCTACTCTGCCTCCCTTAT-3'，下游 5'-TAGCATCTGCCACCCAAATC-3'；miR-580-3p 的引物序列 5'-GCTGCGTTGAGAATGATGAATC-3'，下游 5'-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3'，GADPH 的引物序列上游 5'-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3'，下 游5'-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3'。以 GADPH 為內(nèi)參基因，采用 2-ΔΔCt法計算 ST7-AS1 和 miR-580-3p 的相對表達(dá)水平。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 采用siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)，設(shè)計合成si-ST7-AS1轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，敲除卵巢癌A2780細(xì)胞中ST7-AS1，設(shè)計合成陰性對照si-NC轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。具體如下：卵巢癌A2780細(xì)胞株在含10%FBS，1%雙抗和1%谷氨酰胺的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中，每1～2 d換液。將生長狀態(tài)良好的處于對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)60%～70%時，根據(jù)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別轉(zhuǎn)染si-ST7-AS1（si-ST7-AS1組）和陰性對照 si-NC（si-NC組）。轉(zhuǎn)染后48 h，采用熒光實時定量PCR法檢測兩組細(xì)胞ST7-AS1表達(dá)水平驗證轉(zhuǎn)染效果。

1.2.3 細(xì)胞增殖能力檢測 采用CCK-8法。將si-ST7-AS1組和si-NC組細(xì)胞重懸調(diào)整密度為1×104/ml，取100 μl/孔鋪于96孔培養(yǎng)板，于接種培養(yǎng)第6、24、48、72 h每孔加入10 μl的CCK-8溶液，將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1 h，在酶標(biāo)儀上450 nm處測定各孔吸光度（OD）。

1.2.4 細(xì)胞遷移能力檢測 采用Transwell遷移實驗。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后消化離心，用無血清1640培養(yǎng)液將細(xì)胞重懸調(diào)整密度為 1×105/ml，Transwell上室加入200 μl/孔的細(xì)胞懸液，培養(yǎng)板下室每孔加入 500 μl/孔的完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后取出小室，甲醇固定和0.1%結(jié)晶紫溶液染色各30 min，PBS清洗。棉簽擦拭上室中未穿過基底膜的卵巢癌細(xì)胞。100倍顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取5個視野拍照，對穿過基底膜的卵巢癌細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，取平均值。

1.2.5 細(xì)胞侵襲能力檢測 采用Transwell侵襲實驗。將Matrigel基質(zhì)膠與1640空培養(yǎng)液按1:8比例稀釋后輕輕混勻，以100 μl/孔加入到Transwell小室的上室中，將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中6 h以充分凝固。后續(xù)同Transwell遷移實驗。

1.2.6 雙熒光素酶報告試驗 將構(gòu)建好的ST7-AS1野生型（WT-ST7-AS1）和突變型（MUT-ST7-AS1）雙熒光素酶報告載體分別與miR-580-3p mimic或NC mimic共轉(zhuǎn)染卵巢癌A2780細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后，收集并裂解細(xì)胞，離心收集上清液，根據(jù)試劑盒說明書檢測熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EOC組織與癌旁正常組織ST7-AS1表達(dá)水平比較 ST7-AS1在EOC組織中的表達(dá)水平（2.23±1.34）高于癌旁正常組織（1.23±0.70），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖 1。

圖1 EOC組織與癌旁正常組織ST7-AS1表達(dá)水平比較

2.2 si-ST7-AS1組與si-NC組卵巢癌細(xì)胞ST7-AS1表達(dá)水平及增殖、遷移、侵襲能力比較 與si-NC組相比，si-ST7-AS1組卵巢癌細(xì)胞ST7-AS1表達(dá)水平明顯降低[（0.41±0.07）比（1.01±0.15）]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），即轉(zhuǎn)染成功，見圖 2a。下調(diào) ST7-AS1表達(dá)后，si-ST7-AS1組細(xì)胞 24、48、72 h細(xì)胞增殖能力分別為 0.58±0.01、0.80±0.04、0.91±0.05，低于 si-NC 組0.63±0.04、0.88±0.03、1.18±0.09，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖2b。Transwell遷移實驗表明，與si-NC 組（715.20±28.43）相比，si-ST7-AS1組（359.20±22.88）穿過基底膜的細(xì)胞數(shù)減少（P＜0.01），見圖 2c。Transwell侵襲實驗表明，與 si-NC 組（736.40±32.59）相比，si-ST7-AS1組（320.40±29.35）穿過基底膜的細(xì)胞數(shù)減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖2d。

圖2 si-ST7-AS1組與si-NC組卵巢癌細(xì)胞ST7-AS1表達(dá)水平及增殖、遷移、侵襲能力比較[a：ST7-AS1表達(dá)水平比較；b：增殖能力比較；c：遷移能力比較（×100）；d：侵襲能力比較（×100）]

2.3 ST7-AS1靶向調(diào)控miR-580-3p驗證結(jié)果 通過starBase3.0軟件分析預(yù)測顯示，ST7-AS1序列中含有與miR-580-3p互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)，見圖3a。與NC mimic組細(xì)胞（0.98±0.07）相比，miR-580-3p mimic組細(xì)胞（0.61±0.09）野生型WT-ST7-AS1的熒光素酶相對活性顯著下降（P＜0.01），而兩組的突變型MUT-ST7-AS1的熒光素酶相對活性沒有明顯變化[（0.96±0.07）比（0.95±0.08），P ＞0.05]，見圖 3b。與癌旁正常組織（1.17±0.71）相比，miR-580-3p在卵巢癌組織（0.71±0.39）中的表達(dá)水平下降（P＜0.01），見圖 3c。si-ST7-AS1組細(xì)胞miR-580-3p的表達(dá)水平為(4.69±1.39)，較si-NC 組（1.08±0.47）升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖 3d。

圖3 ST7-AS1靶向調(diào)控 miR-580-3p驗證結(jié)果（a：軟件預(yù)測結(jié)果；b：WT-ST7-AS1、MUT-ST7-AS1熒光素酶活性比較；c、d：分別為組織細(xì)胞miR-580-3p表達(dá)水平比較）

3 討論

目前研究認(rèn)為，lncRNA可通過影響細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡、細(xì)胞周期等途徑參與腫瘤疾病發(fā)生、發(fā)展[7]。多種lncRNA在卵巢癌中發(fā)揮了致癌或抑癌的作用。Xu等[8]研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌組織中l(wèi)ncRNA EIBC表達(dá)上調(diào)，lncRNA EIBC的表達(dá)水平與腫瘤體積、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預(yù)后等密切相關(guān)，抑制lncRNA EIBC表達(dá)后卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力下降，且順鉑耐藥性被抑制。lncRNA GAS5表達(dá)水平在卵巢癌組織中降低，卵巢癌細(xì)胞中過表達(dá)lncRNA GAS5可明顯抑制癌細(xì)胞增殖及克隆形成，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，深入研究lncRNA GAS5的致病機(jī)制發(fā)現(xiàn)其在卵巢癌中可能通過細(xì)胞炎性壞死發(fā)揮作用[9]。目前，多項研究表明，lncRNA ST7-AS1在癌癥中表達(dá)失調(diào)，可作為潛在的新型的腫瘤標(biāo)志物。Zhang等[10]研究表明，ST7-AS1與乳腺癌免疫浸潤相關(guān)，是乳腺癌潛在的新型預(yù)測指標(biāo)。Qin等[11]研究發(fā)現(xiàn)111種與喉鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)的lncRNA，ST7-AS1表現(xiàn)出最高的表達(dá)異常。ST7-AS1在喉癌組織及細(xì)胞中表達(dá)升高,它可以與組蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶 1（coactivatorassociated arginine methyltransferase 1，CARM1）相互作用，通過ST7-AS1/CARM1/Sox-2信號軸在喉癌中發(fā)揮致癌作用。ST7-AS1在胃癌組織及細(xì)胞系中表達(dá)升高，胃癌細(xì)胞中敲除ST7-AS1后細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力減弱，細(xì)胞凋亡增加，組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）可與ST7-AS1相互作用，削弱ST7-AS1對癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力[6]。EOC是卵巢癌最常見的組織學(xué)類型，關(guān)于ST7-AS1在EOC中的表達(dá)情況及具體的致癌機(jī)制，相關(guān)報道較少。本研究發(fā)現(xiàn)，與癌旁正常組織相比，ST7-AS1在EOC組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，卵巢癌A2780細(xì)胞中抑制ST7-AS1表達(dá)后，癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力減弱，提示ST7-AS1在EOC中具有致癌作用，其可能通過增強(qiáng)癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為促進(jìn)EOC進(jìn)展。由于筆者單位能收集到的非EOC的組織樣本較少，本次研究未能檢測ST7-AS1在其他病理類型的卵巢癌中的表達(dá)情況，后續(xù)筆者將收集足夠的樣本進(jìn)行相關(guān)的研究。

作為內(nèi)源性非編碼小RNA，miRNA在卵巢癌中表達(dá)異常，將有可能作為卵巢癌診斷、預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)及潛在治療靶點(diǎn)[12]。研究表明，lncRNA可通過競爭性吸附miRNA抑制其表達(dá)，導(dǎo)致miRNA介導(dǎo)的靶基因表達(dá)失調(diào)而在卵巢癌進(jìn)展中發(fā)揮作用[13-14]。有研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNA circRAB3IP通過吸附miR-580-3p上調(diào)TWIST1促進(jìn)骨肉瘤進(jìn)展[15]。此外，lncRNA LHFPL3-AS1/miR-580-3p/STAT3軸通過激活JAK2/STAT3信號通路促進(jìn)黑色素瘤惡性轉(zhuǎn)移[16]。本研究通過starBase3.0軟件分析預(yù)測ST7-AS1與miR-580-3p存在結(jié)合位點(diǎn)，由此推測ST7-AS1可能通過吸附miR-580-3p參與卵巢癌進(jìn)展。本研究表明，miR-580-3p在EOC組織中表達(dá)下降，在卵巢癌A2780細(xì)胞系中ST7-AS1負(fù)性靶控miR-580-3p。通過本研究，筆者認(rèn)為ST7-AS1可能通過競爭性吸附miR-580-3p介導(dǎo)其下游靶基因表達(dá)失衡促進(jìn)卵巢癌進(jìn)展?；谠撏茰y，后續(xù)筆者將進(jìn)一步研究探討與miR-580-3p相關(guān)的靶基因以分析ST7-AS1在卵巢癌中的具體致癌機(jī)制。

綜上所述，LncRNA ST7-AS1在EOC組織中表達(dá)升高，抑制ST7-AS1表達(dá)可能通過競爭性吸附miR-580-3p致卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力減弱。ST7-AS1/miR-580-3p軸可能是EOC潛在的診斷及治療靶點(diǎn)，深入研究ST7-AS1對miR-580-3p的具體調(diào)控機(jī)制或可進(jìn)一步闡明卵巢癌的發(fā)病機(jī)制，為卵巢癌的靶向治療提供新的方向。