胡蓓莉 張斌忠 錢新月 陳麗花 莫娟芬 王宙政 韓艷霞 張東凱 陳穎

非霍奇金淋巴瘤是一類原發(fā)于淋巴結(jié)和其他器官淋巴組織的造血系統(tǒng)惡性腫瘤，具有很強的異質(zhì)性。B細胞淋巴瘤發(fā)病率最高，占非霍奇金淋巴瘤的85%。甲狀腺激素受體相互作用因子13（thyroid hormone receptor interactor 13，TRIP13）是一種蛋白C端含AAA盒的腺嘌呤核苷三磷酸（AAA cassette adenosine triphosphate，AAA-ATP）酶，在細胞有絲分裂和減數(shù)分裂過程中發(fā)揮重要作用[1]。研究表明，TRIP13可通過蛋白質(zhì)去泛素化機制增加細胞的去泛素化，加速轉(zhuǎn)基因小鼠B細胞腫瘤的發(fā)展[2]。而靶向TRIP13的小分子抑制劑可能是一種有效的治療多發(fā)性骨髓瘤的藥物[3]?；诖耍狙芯渴占疊細胞淋巴瘤患者的新鮮病理組織標(biāo)本，檢測其TRIP13 mRNA表達水平，并分析其與患者臨床特征的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2018年9月1日至2020年11月30日在嘉興市第二醫(yī)院就診，進行淋巴結(jié)活檢或骨髓穿刺活檢的患者66例，患者多余的新鮮淋巴結(jié)活檢組織或新鮮骨髓活檢組織（受淋巴瘤侵犯）當(dāng)時已凍存，本次研究時取出檢測TRIP13 mRNA表達水平，并根據(jù)最終病理診斷結(jié)果，整理凍存組織標(biāo)本，將符合B細胞淋巴瘤診斷的患者分為惰性B細胞淋巴瘤組和侵襲性B細胞淋巴瘤組，符合炎性反應(yīng)性增生的歸為淋巴結(jié)炎組。參照2016年WHO對B細胞淋巴瘤的分型診斷標(biāo)準(zhǔn)，惰性B細胞淋巴瘤組包括3a級及以下的濾泡淋巴瘤、邊緣區(qū)淋巴瘤、淋巴漿細胞性淋巴瘤、慢性淋巴細胞白血病、小B細胞淋巴瘤、惰性套細胞淋巴瘤；侵襲性B細胞淋巴瘤組包括3b級濾泡淋巴瘤、彌漫大B細胞淋巴瘤、經(jīng)典型套細胞淋巴瘤、高級別B細胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤[4]。B細胞淋巴瘤患者均接受美國綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Nekwork，NCCN）指南各B細胞淋巴瘤亞型一線治療方案，療效評估采用Lugarno評估標(biāo)準(zhǔn)[4]。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，研究對象均簽署受試者知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑和儀器 RNA提取試劑Trizol購自美國Sigma公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT Master Mix購自日本Takara公司，熒光定量PCR試劑盒SYBR Fast qPCR Mix購自日本Takara公司。GAPDH和TRIP13兩種引物由上海生工科技生物公司合成。熒光定量PCR儀購自美國ABI公司，NanoDrop分光光度計購自美國Thermo Scientific公司；引物序列如下，GAPDH上游引物5'-GGAAGCTTGTCATCAATGGAAATC-3'，下游引物 5'-TGATGACCCTTTTGGCTCCC-3'；TRIP13 上游引物 5'-TGCAGCAAATCACTGGGTTCT-3'，下游引物 5'-GGTTC CAGGTGATGAGGTTGC-3'。

1.2.2 TRIP13 mRNA表達水平檢測 采用RT-PCR法。采用Trizol提取患者淋巴結(jié)或骨髓活檢組織RNA，提取的RNA用NanoDrop檢測濃度。按照Takara的反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書在冰上配制10 μl的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃。反應(yīng)結(jié)束后按照Takara的SYBR法PCR試劑盒在冰上配制20 μl反應(yīng)體系，檢測GAPDH和TRIP13兩個基因。輕輕混勻后上PCR儀，預(yù)變性，95 ℃ 30 s；PCR 反應(yīng)，40個循環(huán)數(shù)，95 ℃ 5 s，60 ℃30 s。反應(yīng)結(jié)束確認溶解曲線，2-ΔΔCt法分析實驗數(shù)據(jù)。

1.3 觀察指標(biāo) （1）比較惰性B細胞淋巴瘤組、侵襲性B細胞淋巴瘤組、淋巴結(jié)炎組患者性別、年齡、標(biāo)本類型、TIRP13 mRNA表達水平；（2）分析TRIP13 mRNA表達水平對B細胞淋巴瘤的診斷效能；（3）以TRIP13 mRNA表達水平診斷B細胞淋巴瘤的最佳截斷值為分界點，將B細胞淋巴瘤患者分為TRIP13 mRNA低表達組及TRIP13 mRNA高表達組，比較兩組患者臨床特征。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。正態(tài)分布的計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗；非正態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，多組比較采用Kruskal-Wallis H檢驗，組間兩兩比較采用Wilcoxon秩和檢驗，兩組比較采用Mann-Whitney U檢驗。計數(shù)資料以頻數(shù)和構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗。采用ROC曲線分析TRIP13 mRNA表達水平對B細胞淋巴瘤的診斷效能。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組患者性別、年齡、標(biāo)本類型、TIRP13 mRNA表達水平比較 66例患者中惰性B細胞淋巴瘤組22例（其中小B細胞淋巴瘤6例，慢性淋巴細胞白血病11例，淋巴漿細胞淋巴瘤3例，邊緣區(qū)淋巴瘤2例），侵襲性B細胞淋巴瘤組20例（其中彌漫大B細胞淋巴瘤非特指型12例，高級別B細胞淋巴瘤3例，濾泡淋巴瘤3b級1例，經(jīng)典型套細胞淋巴瘤4例），淋巴結(jié)炎組24例。3組患者性別、標(biāo)本類型比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。淋巴結(jié)炎組患者年齡小于惰性B細胞淋巴瘤組（P＜0.05），TIRP13 mRNA表達水平低于惰性B細胞淋巴瘤組、侵襲性B細胞淋巴瘤組（均P＜0.05）。而惰性B細胞淋巴瘤組與侵襲性B細胞淋巴瘤組患者年齡、TIRP13 mRNA表達水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。見表1。

表1 3組患者性別、年齡、標(biāo)本類型、TIRP13mRNA表達水平比較

2.2 TRIP13 mRNA表達水平對B細胞淋巴瘤的診斷效能 以B細胞淋巴瘤與淋巴結(jié)炎為狀態(tài)變量作ROC曲線，AUC為0.709，最佳截斷值為0.215，靈敏度為0.721，特異度為 0.652，P＜0.05。見圖 1。

圖1 TRIP13 mRNA表達水平診斷B細胞淋巴瘤的ROC曲線

2.3 TRIP13 mRNA高表達組與低表達組B細胞淋巴瘤患者臨床特征比較 以TRIP13 mRNA表達水平≥0.215及＜0.215分組，將B細胞淋巴瘤患者分為TRIP13 mRNA高表達組30例與低表達組12例。兩組患者性別、年齡、標(biāo)本類型、Ki-67指數(shù)、腫瘤分期、B癥狀、東部腫瘤協(xié)作組（Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG）評分、有無結(jié)外侵犯、惰性與侵襲性B細胞淋巴瘤構(gòu)成、乳酸脫氫酶水平比較均無統(tǒng)計學(xué)差異（均P＞0.05），且染色體異常比例、淋巴細胞亞群水平比較也均無統(tǒng)計學(xué)差異（均P＞0.05）。與TRIP13 mRNA低表達組相比，高表達組患者IgH基因重排陽性率較高（P＜0.05），4個療程后獲得完全緩解率較低（P＜0.05），而6個療程后獲得完全緩解率無統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。見表2。

表2 TRIP13 mRNA高表達組與低表達組B細胞淋巴瘤患者臨床特征比較

續(xù)表2

3 討論

TRIP13是人體內(nèi)一個由432個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，定位于細胞內(nèi)的著絲粒，其編碼基因定位于5號染色體上5p15，是一種AAA-ATP酶，在有絲分裂和減數(shù)分裂過程中發(fā)揮重要作用[5]，是小鼠等哺乳動物有絲分裂的檢查點基因[6]。目前研究表明，TRIP13可通過影響有絲分裂檢查點復(fù)合物的功能，干擾有絲分裂正常完成，導(dǎo)致細胞染色體倍數(shù)異常、基因不穩(wěn)定、腫瘤細胞產(chǎn)生，從而促使癌癥的發(fā)展[7-8]。

TRIP13不但被發(fā)現(xiàn)在某些實體瘤中高表達[9-10]，其表達量與基因組不穩(wěn)定或腫瘤細胞惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)，并提示實體瘤較差的預(yù)后[11-15]；在惡性血液系統(tǒng)腫瘤中也被發(fā)現(xiàn)有一定的意義。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它能夠損傷有絲分裂的檢查點安全裝置從而與多發(fā)性骨髓瘤的不良預(yù)后相關(guān)[16]。周可樹等[17]發(fā)現(xiàn)TRIP13基因與慢性淋巴細胞白血病細胞的增殖及抗凋亡機制有關(guān)。在多發(fā)性骨髓瘤中，TRIP13的致病機制除了在有絲分裂中導(dǎo)致染色體分離過程的錯誤外，還與NF-κB通路激活相關(guān)；而以TRIP13為靶點的小分子抑制劑可促進多發(fā)性骨髓瘤細胞中受損的DNA修復(fù)和抑制NF-κB通路激活[3]。在B細胞淋巴瘤中，TRIP13還通過誘導(dǎo)蛋白質(zhì)去泛素化和抑制TP53通路促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[2]。

本研究結(jié)果顯示，TRIP13 mRNA表達水平在侵襲性B細胞淋巴瘤組中最高，其次是惰性B細胞淋巴瘤組，最低的是淋巴結(jié)炎組，并且在侵襲性B細胞淋巴瘤組與淋巴結(jié)炎組之間、惰性B細胞淋巴瘤組與淋巴結(jié)炎組之間有統(tǒng)計學(xué)差異。在臨床特征比較中，本研究發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)炎組與侵襲性B細胞淋巴瘤組臨床特征比較無統(tǒng)計學(xué)差異，提示該兩組TIRP13 mRNA表達水平差異更為可靠。而在惰性B細胞淋巴瘤組與淋巴結(jié)炎組臨床特征比較中，年齡存在統(tǒng)計學(xué)差異，淋巴結(jié)炎患者年齡小于惰性B細胞淋巴瘤組，故本研究中無法排除年齡差異導(dǎo)致的TRIP13 mRNA水平差異。前期一些研究如多發(fā)性骨髓瘤[16]、慢性淋巴細胞白血病[17]腫瘤組織與正常對照組織中的表達水平差異，此結(jié)果能否推及B細胞淋巴瘤中尚有待進一步研究證實。

以TRIP13 mRNA表達水平為變量，B細胞淋巴瘤與淋巴結(jié)炎為狀態(tài)變量作ROC曲線，得到了一個有統(tǒng)計學(xué)意義的截斷值，具有較為理想的靈敏度和特異度。提示用實時定量PCR法測活檢組織中的TRIP13 mRNA表達水平為0.215可以作為區(qū)分B細胞淋巴瘤和淋巴結(jié)炎性改變的一個診斷參考指標(biāo)，具有鑒別診斷意義。在以往的研究中，TRIP13相關(guān)的研究集中在惰性B細胞腫瘤，如多發(fā)性骨髓瘤、慢性淋巴細胞白血病等疾病的研究，侵襲性淋巴瘤相關(guān)研究比較少。在本研究中，組織中TRIP13 mRNA拷貝數(shù)在惰性B細胞淋巴瘤組和侵襲性B細胞淋巴瘤組中并無統(tǒng)計學(xué)差異，提示TRIP13 mRNA在侵襲性B細胞淋巴瘤的發(fā)病過程中同樣也存在一定意義。

在以TRIP13 mRNA表達水平0.215為界點分為TRIP13 mRNA高表達組和低表達組兩組間的比較中，IgH基因重排陽性率有統(tǒng)計學(xué)差異，高表達組IgH重排陽性率更高。B細胞淋巴瘤的腫瘤細胞具有單克隆性Ig重排，而正常淋巴組織或良性病變中的B細胞呈多克隆起源，成為重要鑒別診斷參考指標(biāo)，在B細胞淋巴瘤發(fā)生、發(fā)展中具有一定意義。研究表明，Ann Arbor分期早期的B細胞淋巴瘤患者IgH基因克隆性重排陽性率低于晚期患者，這提示雖然兩組間直接Ann Arbor分期無差異，但骨髓IgH基因重排陽性率有差異，提示即使形態(tài)學(xué)上沒有骨髓受累的差異，可能在基因水平也存在差異[19]。本研究發(fā)現(xiàn)年齡、Ki-67指數(shù)、乳酸脫氫酶水平、腫瘤分期、結(jié)外侵犯、骨髓侵犯、白蛋白等生化指標(biāo)、血常規(guī)指標(biāo)、淋巴細胞亞群等各項指標(biāo)的比較均無統(tǒng)計學(xué)差異，兩組間侵襲性B細胞淋巴瘤與惰性B細胞淋巴瘤的構(gòu)成比無差異。與以往研究結(jié)果不同的是，本研究發(fā)現(xiàn)TRIP13 mRNA高表達組與低表達組染色體異常及染色體數(shù)目異常比例并無統(tǒng)計學(xué)差異，這與TRIP13在遺傳學(xué)上公認的作用機制不符。其可能原因，一是可能與染色體檢查用細胞培養(yǎng)G帶顯色法不夠敏感有關(guān)，二是也可能與此次研究納入的樣本量不夠大有關(guān)。遺傳相關(guān)性有待納入更大的樣本量，采用更精確的遺傳檢測方法如原位熒光雜交技術(shù)、二代測序等進一步研究。在治療反應(yīng)中，本研究發(fā)現(xiàn)TRIP13 mRNA低表達組接受4個療程治療后完全緩解率較高表達組高，說明TRIP13 mRNA表達水平對早期療效反應(yīng)可能存在一定預(yù)示作用。但由于本研究隨訪時間短，該指標(biāo)對于生存情況如2年及5年總生存、無進展生存等的意義需進一步隨訪探索。

綜上所述，B細胞淋巴瘤患者TRIP13 mRNA表達水平明顯升高，測定其水平有助于鑒別B細胞淋巴瘤組織和淋巴結(jié)炎組織，且其與臨床早期治療反應(yīng)有一定關(guān)系。