王劍 周興瑋 何嫻

（西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院，瀘州 646000）

喉癌是頭頸部第二常見的惡性腫瘤，以鱗狀細胞癌為主。迄今為止，喉鱗狀細胞癌（laryngeal squamous cell carcinomas，LSCC）的發(fā)病機制尚未明確，治療效果也未得到明顯改善［1］。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一種長度大于200個核苷酸、但不具備編碼蛋白能力的基因轉錄產物。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關［2-3］。WU等［4］發(fā)現(xiàn)lncRNA H19在LSCC組織中表達上調，且表達水平與患者生存率呈負相關。上調lncRNA H19可通過miR-148a-3p、DNMT1和DNA甲基化促進LSCC的進展。X染色體失活特異轉錄本（X inactive specific transcript，XIST）是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的lncRNA，WANG等［5］發(fā)現(xiàn)，敲除XIST可通過miR-137/Notch-1通路抑制非小細胞肺癌的增殖。ZHANG等［6］發(fā)現(xiàn)，XIST可通過miR-497-5p/PDCD4通路促進肝癌細胞的增殖和遷移。由此可見，XIST對調控腫瘤細胞的生物學行為具有重要意義。XIST對LSCC有何影響，既往鮮有報道。miR-22/NLRP3通路對LSCC的發(fā)生和發(fā)展有重要作用［7］。本研究擬分析XIST對miR-22/NLRP3通路的靶向作用及對人LSCC細胞增殖的影響，旨在探討XIST在LSCC中的作用，為LSCC的治療提供潛在靶點。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 組織來源2017年6月至2018年9月西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院收治的LSCC患者34例，其中Ⅰ~Ⅱ期13例，Ⅲ~Ⅳ期21例，入院前均未接受放化療，行部分或全部喉切除術，術中獲得癌組織和癌旁組織樣本各34例。將組織儲存于-70℃下保存。

1.1.2 實驗細胞及動物來源人LSCC細胞系Hep-2細胞和HEK293T細胞購于武漢普諾賽生命科技有限公司，培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素溶液的RPMI1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)環(huán)境為37℃、5%CO2。熒光素酶檢測實驗用HEK293T細胞，其他實驗用Hep-2細胞。24只BALB/c雌性小鼠（6周齡）購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號為：SCXK（京）2006~2009，用于后續(xù)動物實驗。

1.1.3 實驗試劑含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素溶液的RPMI1640培養(yǎng)基（上海聯(lián)合賽爾生物工程有限公司）；Trizol試劑盒（上海名勁生物科技有限公司）；Lipofectamine2000（美國英杰生命技術有限公司）；CCK-8試劑盒（北京智杰方遠科技有限公司）；微孔板閱讀器（德國耶拿分析儀器股份公司）；一抗、二抗（美國Invitrogen公司）；pmirGlO雙熒光素酶miRNA靶向表達載體（美國Sigma公司）；miR-22 mimic、miR-22 inhibitor、陰性對照（miR-NC）均由上海伯易生物科技有限公司合成；RT-PCR引物序列由上海生工生物工程技術服務有限公司設計并提供。

1.2 方法

1.2.1 熒光定量PCR（RT-PCR）檢測Trizol試劑盒提取總RNA，逆轉錄后進行RT-PCR檢測。每個樣本最少重復3次，設置3個復孔。反應條件為：預變性95℃30 s；PCR反應95℃5 s，60℃30 s，共計40個循環(huán)。以2-ΔΔCt法計算RNA的相對表達量。

1.2.2 慢病毒與細胞轉染慢病毒顆粒由上海伯易生物科技有限公司合成，表達特異性短發(fā)夾狀RNA（shRNA）XIST或scrambled oligonucleotides。轉染48 h后用嘌呤霉素（3 μg/ml）處理細胞7 d，檢測綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）以評價轉染效率。構建pcDNA3.1-NLRP3質粒（編碼pcDNA3.1，但缺少NLRP3的3′UTR），將其轉染至Lipofectamine2000。

1.2.3 細胞增殖和平板細胞克隆形成實驗CCK-8試劑盒檢測細胞活性，將細胞以5×103個/ml的密度接種于96孔板培養(yǎng)24 h、48 h、72 h和96 h后，向每孔中添加10 μl CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。微孔板閱讀器490 nm波長處讀取吸光度。平板細胞克隆形成實驗中，細胞以300個/孔接種于6孔培養(yǎng)板，結晶紫染色后在低倍顯微鏡下計算每孔細胞數(shù)大于10個克隆數(shù)，最后計算克隆成功率，評估細胞增殖能力［8］。

1.2.4 Western blot檢測取對數(shù)生長期細胞加入蛋白裂解液，冰上裂解25 min，離心15 min后將上清液轉移至EP管。加入SDS緩沖液并煮沸5 min使蛋白變性。經SDS-PAGE后將蛋白轉移至PVDF膜，脫脂奶粉封閉1 h，孵育一抗，4℃過夜后棄去一抗，TBST洗膜3次。隨后室溫孵育二抗2 h，棄去二抗，TBST洗膜3次，每次5 min，最后在Bio-Rad ChemiDoc MP全能型成像系統(tǒng)上成像［9］。

1.2.5 熒光素酶報告分析將pmirGlO雙熒光素酶miRNA靶向表達載體插入帶有miR-22結合位點的XIST片段，產生pmirGLO-XIST-WT報告載體。另外構建表達miR-22突變位點的載體（pmirGLO-XISTMut）。用4 ng對照腎素熒光素酶載體、pRL-TK 200 ng螢火蟲熒光素酶質粒共轉染LSCC細胞，同時轉染miR-22 mimics或miR-NC和pmirGLO-XIST-WT或pmirGLO-XIST-Mut［10］。48 h后用雙熒光素酶報告分析系統(tǒng)（美國Invitrogen公司）定量熒光素酶活性。

1.2.6 動物實驗24只SPF級雌性小鼠隨機分為3組，每組各8只，均置于恒溫恒濕的無菌室中適應性喂養(yǎng)3 d后，在小鼠肩胛背區(qū)皮下注射100μl PBS（內含100萬個Hep-2細胞）。每周用游標卡尺測量腫瘤大小，腫瘤體積=長度×寬度2×0.5［11］。當腫瘤達到約0.5~0.6 cm3時，在3組小鼠的瘤內分別注射100 μl XIST siRNA慢病毒或100 μl GFP，每周注射1次，注射3周。治療后1周處死小鼠，獲取腫瘤組織。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS23.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。采用獨立樣本t檢驗或單因素測量方差分析（兩兩比較用LSD-t法），P<0.05說明組間比較差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 人LSCC組織中XIST和miR-22的表達RTPCR檢測結果顯示，與癌旁組織相比，LSCC組織中XIST表達水平較高，而miR-22表達水平較低（P<0.05）。腫瘤分期越高，XIST表達水平越高，而miR-22表達水平越低（P<0.05，圖1）。

圖1 癌旁組織（normal組）和LSCC組織中XIST和miR-22表達Fig.1 Expressions of XIST and miR-22 in paracancerous tissues（normal group）and LSCC tissues

2.2 XIST對Hep-2 LSCC細胞的影響用XIST特異性shRNA（shXIST1和shXIST2）和scrambled oligo?nucleotides（對照）轉染Hep-2細胞，隨后用RT-PCR予以證實（圖2）。CCK-8實驗結果顯示，下調XIST表達可抑制Hep-2細胞增殖，在細胞培養(yǎng)第5天時差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。平板細胞克隆形成實驗結果同樣證實下調XIST的抗腫瘤增殖活性（P<0.05）。見圖3。

圖2 轉染scrambled oligonucleotides、shXIST1和shXIST2后XIST的表達水平Fig.2 Expression level of XIST after respectively transfec?tion scrambled oligonucleotides，shXIST1 and shXIST2

圖3 分 別 轉 染scrambled oligonucleotides、shXIST1和shXIST2后對Hep-2細胞增殖的影響Fig.3 Influence for Hep-2 cell proliferation after respec?tively transfection scrambled oligonucleotides，shXIST1 and shXIST2

2.3 XIST對miR-22/NLRP3的靶向調節(jié)作用采用starBase平臺（http：//starbase.sysu.edu.cn/）預測miR-22與XIST的結合位點（圖4A）。將XIST序列中miR-22的野生型（pmirGLO-XIST-WT）和突變型（pmirGLO-XIST-Mut）結合位點克隆至報告載體，熒光素酶分析結果證實miR-22與XIST相互作用。miR-22過表達可顯著抑制pmirGLO-XIST-WT活性（P<0.05），但對pmirGLO-XIST-Mut活性無影響（P>0.05，圖4B）。抑制XIST后，miR-22表達水平顯著上調（P<0.05，圖4C）。

圖4 XIST對miR-22的調控Fig.4 Regulation of miR-22 by XIST

根據(jù)targetscan（www.targetscan.org）和starBase（starbase.sysu.edu.cn）平臺發(fā)現(xiàn)NLRP3是miR-22的潛在靶點（圖5A）。構建3′UTR質粒作為載體，在構建miR-22模型后，轉染野生型和突變型NLRP3到載體3′UTR質粒，并檢測其熒光素酶活性。3′UTRNC為含突變型NLRP3的質粒載體，3′UTR-MU為含野生型的NLRP3的質粒載體。在熒光素酶報告試驗中，miR-22過表達降低了3′UTR熒光素酶活性（P<0.05），但不影響3′UTR-NC和3′UTR-MU熒光素酶活性（P>0.05，圖5B）。miRNA靶向表達載體插入帶有miR-22結合位點的XIST片段后，與陰性對照及miRNA-22抑制組相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，圖5C），提示miRNA-22 mimics構建成功。Western blot檢測結果顯示，下調XIST表達或miR-22過表達可導致NLRP3表達上調（P<0.05，圖5D、E）。當Hep-2細胞XIST表達下調時，下調miR-22（轉染miR-22 inhibitor）可恢復NLRP3的表達（與轉染shXIST相比，P<0.05），而shXIST和miR-22 inhibitor共轉染后NLRP3的表達水平低于單獨轉染miR-22 inhibitor（P<0.05，圖5F）。上述結果說明XIST通過靶向miR-22調節(jié)NLRP3的表達。

圖5 XIST對miR-22/NLRP3的靶向調節(jié)Fig.5 Targeted regulation of miR-22/NLRP3 by XIST

2.4 XIST通過NLRP3對腫瘤增殖活性的影響XIST的致癌活性由NLRP3介導，平板細胞克隆形成實驗檢測Hep-2細胞增殖活性。轉染包含編碼序列但缺少NLRP3 3′UTR的質?？擅黠@減弱下調XIST所致的抗腫瘤增殖活性（P<0.05），見圖6。

圖6 XIST通過NLRP3對腫瘤增殖活性的影響Fig.6 Effects of XIST on tumor proliferative activity through NLRP3

2.5 XIST對腫瘤增殖影響的體內研究shXIST慢病毒干預LSCC小鼠后，腫瘤體積和重量明顯縮小，Ki-67和NLRP3表達水平降低（P<0.05），見圖7。

圖7 XIST siRNA抑制Hep-2腫瘤生長的體內研究Fig.7 In vivo study of XIST siRNA inhibition of Hep-2 tumor growth

3 討論

近年來，LSCC的發(fā)病率有逐漸升高之勢，且死亡率居高不下。盡管近年來治療方法和診斷技術有了很大發(fā)展，但患者的五年生存率仍然較低，特別是晚期或有轉移患者［12］，因此亟需更深入地探索LSCC的發(fā)病機制。LncRNA是近年來腫瘤研究的熱點，靶向lncRNA或許能為LSCC的診治帶來曙光。

本研究發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，LSCC組織中XIST表達水平明顯升高，且XIST表達水平與臨床分期關系密切。分期越高XIST表達水平越高，說明XIST在LSCC中有重要意義。既往研究發(fā)現(xiàn)，XIST在肝癌、乳腺癌、肺癌和卵巢癌等中有異常表達［5，13-15］。因此可以推測，XIST對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有重要作用。miR-22對調控腫瘤細胞生物學行為有重要意義，有研究顯示miR-22可靶向轉化生長因子β受體1（TGFBR1）、BCL9L基因和NLRP3等，進而調控多種腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲［16-18］。通過調控miR-22可能是治療癌癥的有效手段。本研究顯示，XIST可靶向miR-22/NLRP3通路調控LSCC的增殖。

本研究通過轉染shRNA下調XIST的表達，發(fā)現(xiàn)下調XIST可明顯抑制LSCC細胞的增殖、遷移和分化。在膀胱癌的研究中，HU等［19］的發(fā)現(xiàn)與本研究類似。本研究采用熒光素酶報告分析技術驗證了XIST對miR-22的調控作用。既往研究表明，miR-22對腫瘤細胞有抑制作用［18］。HU等［19］發(fā)現(xiàn)，上調lncRNA RGMB-AS1可通過miR-22/NLRP3通路促進LSCC細胞增殖，且與LSCC患者不良預后有關。本研究發(fā)現(xiàn)miR-22通過結合位于NLRP3 3′UTR的miR-22種子互補位點，直接調控NLRP3表達。NLRP3是炎癥小體，與癌細胞增殖、分化、侵襲和凋亡等密切相關［20-21］。本研究進一步證實XIST通過調控miR-22/NLRP3通路促進LSCC細胞增殖，下調XIST后可抑制miR-22/NLRP3通路并抑制腫瘤增殖活性。在動物實驗中，用shXIST慢病毒干預LSCC小鼠后，腫瘤體積和重量明顯縮小，Ki-67和NLRP3表達水平降低。說明下調XIST表達對抑制LSCC生長有積極意義。

綜上所述，XIST過表達可通過調控miR-22/NLRP3通路促進LSCC增殖，靶向XIST可能為LSCC的治療帶來新的方向。本研究也存在一些局限性，例如本研究僅分析了不同分期LSCC與LSCC、miR-22的關系，未對其他病理特征進行分析，未來需要進一步探討LSCC與臨床特征及患者預后的關系。