李發(fā)盛，黃劭蘭，黃雪星，歐娜，周興，何達(dá)崇

1. 廣西科學(xué)院生物研究所（南寧 530003）；2. 南寧市文華學(xué)校（南寧 530007）；3. 廣西科學(xué)院（南寧 530003）

食藥用真菌通過工業(yè)深層發(fā)酵方法生產(chǎn)其菌絲體及代謝產(chǎn)物都可以在短期內(nèi)得到，利用這些發(fā)酵產(chǎn)物可以開發(fā)出新型營養(yǎng)飲料和營養(yǎng)保健食品，制備藥品保健美容化妝品、生產(chǎn)飼料蛋白等[1-2]。

發(fā)酵酒是指發(fā)酵后不需要經(jīng)過一系列的化學(xué)反應(yīng)，釀造的產(chǎn)物直接作為產(chǎn)品來飲用的酒類，其酒精度數(shù)偏低，多數(shù)用果類、粗糧類、乳制品類等為發(fā)酵材料，添加所需的酵母后直接發(fā)酵而成。隨著人們生活水平不斷提高，保健意識增強(qiáng)，酒類消費更加趨向于低酒精度、高保健效果的釀造酒，因此，兼具營養(yǎng)保健型的低酒精飲品具有很大發(fā)展空間[3]。

研究發(fā)現(xiàn)，與固體培養(yǎng)的子實體相比較，液體培養(yǎng)的菌絲體營養(yǎng)物質(zhì)成分類似，且深層發(fā)酵具有低成本、高產(chǎn)量、生長周期短的優(yōu)勢[3]。利用液體深層發(fā)酵培養(yǎng)的食藥用菌菌絲體進(jìn)行發(fā)酵酒的研制也有文獻(xiàn)報道[4-9]，但使用液體深層發(fā)酵全培養(yǎng)物（含菌絲體及全部培養(yǎng)液）進(jìn)行發(fā)酵酒的研制未見報道。

黑木耳（Auricularia auricular）是一種藥食同源的大型真菌，富含多種生物活性物質(zhì)，包括可溶性糖、蛋白質(zhì)、脂肪、礦質(zhì)元素、維生素和粗纖維等營養(yǎng)物質(zhì)以及黑色素、果膠、總酚和總黃酮等非營養(yǎng)物質(zhì)，具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗輻射、抗病毒、抗腫瘤等生理活性，可用于防治冠心病、動脈硬化等心腦血管疾病，還能化解結(jié)石，預(yù)防宮頸癌、直腸癌及其他消化系統(tǒng)癌癥[10-11]。

廣西所產(chǎn)黑木耳俗稱云耳，同樣兼具營養(yǎng)和保健功能，只因產(chǎn)地、生態(tài)種的不同，其所含營養(yǎng)物質(zhì)及各種生物活性物質(zhì)的種類和數(shù)量與其他地域的黑木耳會有區(qū)別。云耳百云6號是從野生云耳子實體分離并經(jīng)馴化獲得的生產(chǎn)性能較好的優(yōu)良菌株，其子實體嫩脆爽滑香，是迄今為止廣西區(qū)內(nèi)食藥用菌類獲得國家新品種認(rèn)證的唯一一個本土種質(zhì)資源，也填補了廣西食藥用菌栽培無本土種的空白。以云耳百云6號菌絲體深層發(fā)酵全液為原料，添加適量葡萄糖，經(jīng)過膠體磨破碎均質(zhì)后，加入酒精酵母發(fā)酵，稍調(diào)配可獲得一款口感好、富含營養(yǎng)和生物活性物質(zhì)的低酒精度飲品，為云耳深加工拓寬新途徑，也為其他食藥用菌的精深加工提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

百云6號，系經(jīng)過自然選育獲得的廣西本土優(yōu)良云耳菌株，并已通過國家新品種認(rèn)定，本所保藏。

Q303，糖化型根霉，從貴州輕工研究所引進(jìn)，本所保藏。

1308，酒精酵母，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，本所保藏。

1.2 供試培養(yǎng)基、試劑和儀器

百云6號斜面培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）：馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖 20 g，VB10.01 g，瓊脂粉15 g，自來水1 000 mL，pH自然。

百云6號菌絲體優(yōu)化液體培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）10%；麩皮3%；葡萄糖2%；紅糖1.5%；蛋白胨0.3%；酵母粉0.15%；磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.3%；硫酸鎂（MgSO4）0.15%；維生素B1（VB1）1 mg/100 mL；微鹽1 mL/100 mL；pH 6.5；花生油6滴/ 100 mL。

1308斜面及液體培養(yǎng)基：12%甜酒汁，pH 6.0，斜面培養(yǎng)基加0.5%瓊脂粉。

主要試劑：試驗所涉及的藥品均為分析純。

主要儀器與設(shè)備：電子分析天平（上海佑科儀器儀表有限公司）；高壓滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；生化培養(yǎng)箱（廣東省醫(yī)療器械廠）；恒溫振蕩培養(yǎng)箱（常州丹瑞實驗儀器設(shè)備有限公司）；膠體磨（廊坊市朗通機(jī)械有限公司）；手持糖量計（昆山宏達(dá)光學(xué)儀器廠）。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

圖1 發(fā)酵酒工藝流程

1.3.2 培養(yǎng)基制備

PDA斜面培養(yǎng)基：土豆去皮，取200 g切成粒狀，加1 000 mL水，煮沸30 min，用4層紗布過濾，濾液中加入其他組分，溶解后，定量至1 000 mL，調(diào)pH至6.0～6.5，用18 mm×180 mm試管分裝，加塞，于0.11 MPa滅菌30 min，趁熱擺斜面。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮篩去細(xì)粉，取30 g粗皮，加20倍水，于80±2 ℃水浴浸提約4 h；土豆去皮，取100 g切成粒狀，加400 mL水，于80±2 ℃水浴浸提約4 h。兩者用4層紗布過濾，濾液混合，加入其他組分，溶解后，定量至1 000 mL，調(diào)pH至6.0～6.5，用500 mL三角瓶分裝，150 mL/瓶，加蓋8層紗布及牛皮紙，于0.11 MPa滅菌30 min。

甜酒汁培養(yǎng)基：糯米加水浸泡10～12 h，瀝干水分，隔水蒸至熟透，趁熱打散冷卻至32 ℃左右，加入0.5%的麩皮和培養(yǎng)成熟的Q303根霉種，拌勻，倒入潔凈的容器內(nèi)，厚度5～8 cm，中間打窩，加蓋，置于32 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)32 h左右。加入3倍糯米量的60 ℃水，打散團(tuán)塊，恒溫水浴鍋60 ℃糖化4 h，紗布抓濾得粗濾液，加入雞蛋清邊攪拌邊加熱至沸騰，用粗濾紙過濾得到清澈透明的甜酒汁，調(diào)整糖度13%、pH 6，分裝三角瓶，或加入0.5%瓊脂粉，按常規(guī)做成斜面培養(yǎng)基，于0.11 MPa滅菌30 min。

1.3.3 菌種培養(yǎng)

百云6號斜面種子培養(yǎng)：嚴(yán)格按照無菌操作要求，取1 mm2左右種塊轉(zhuǎn)接到新鮮的PDA斜面，于26 ℃培養(yǎng)10 d左右長滿斜面，再次轉(zhuǎn)接到PDA斜面培養(yǎng)基，于26 ℃培養(yǎng)至菌絲體蓋滿斜面，作為液體發(fā)酵種子待用。

酒精酵母1308的擴(kuò)大培養(yǎng)：嚴(yán)格按照無菌操作要求，用接種環(huán)取1環(huán)菌落于新鮮的甜酒汁斜面培養(yǎng)基進(jìn)行劃線接種，于28 ℃培養(yǎng)24 h。成熟后轉(zhuǎn)接到新鮮的500 mL三角瓶甜酒汁液體培養(yǎng)基中，于28 ℃靜置培養(yǎng)24 h左右待用。

1.3.4 百云6號菌絲液體搖床發(fā)酵

嚴(yán)格按照無菌操作要求，在超凈工作臺內(nèi)，用接種刀將斜面種子切成1 mm2左右小種塊，然后用接種鏟移接種塊（盡量不帶培養(yǎng)基）到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，每支斜面種子接3～5個三角瓶。接種完畢，于26 ℃、180 r/min條件下發(fā)酵9 d。

1.3.5 酒精發(fā)酵

百云6號菌絲體液體發(fā)酵結(jié)束，將所有三角瓶內(nèi)的正常培養(yǎng)物合并，按培養(yǎng)物總量的23%加入葡萄糖，經(jīng)膠體磨破碎均質(zhì)后，移入10 L玻璃缸內(nèi)，加入10%的1308液體種子，攪拌均勻后，加蓋密封于室溫下（30±5 ℃）發(fā)酵30 d，過濾即為發(fā)酵原酒。

1.3.6 配制

發(fā)酵原酒配不同比例純正蜂蜜進(jìn)行品評，得出最佳蜂蜜添加量。

1.4 成分檢測

委托廣西分析測試研究中心對發(fā)酵原酒進(jìn)行成分檢測。檢測方法如下：

酒精度：GB 5009.225—2016第二法；總糖（以葡萄糖計）、總酸：GB/T 15038—2006；總酯：GB/T 10345—2007中8；碳水化合物：GB 28050—2011；蛋白質(zhì)：GB 5009.5—2016第一法；總黃酮：SN/T 4592—2016；多糖：《配制白酒中枸杞多糖含量測定方法的研究》[12]；氨基酸：GB 5009.124—2016；色氨酸：GB/T 15400—2018；維生素A、維生素E：GB 5009.82—2016；維生素B1：GB 5009.84—2016；維生素B2：GB/T 5009.85—2016；鐵（Fe）、鋅（Zn）、鈣（Ca）：GB 5009.268—2016第二法；果膠（以半乳糖醛酸計）：NY/T 2016—2011；細(xì)菌總數(shù)：GB 4789.2—2016；大腸桿菌：GB 4789.3—2016第一法；沙門氏菌：GB 4789.4；金黃色葡萄球菌：GB 4789.10。

2 結(jié)果與分析

2.1 百云6號液體搖床發(fā)酵

以優(yōu)化的液體培養(yǎng)基搖床發(fā)酵9 d，培養(yǎng)物似漿糊狀結(jié)束培養(yǎng)，菌球小片段均勻密布整個培養(yǎng)物，菌絲體干重為1.73 g/100 g發(fā)酵物。靜置3 d未見分層，這與其中高質(zhì)量濃度多糖和果膠關(guān)系密切，其中果膠便具有穩(wěn)定、膠凝、乳化等特性[13]。

2.2 酒精發(fā)酵

合并搖床培養(yǎng)物加糖膠磨后，雖未經(jīng)消毒處理，但主發(fā)酵期72 h內(nèi)，可明顯觀察到發(fā)酵液處于翻滾狀態(tài)，液面無任何異常氣泡產(chǎn)生，也未聞到任何異常氣味，說明酒精發(fā)酵非常順暢。

2.3 百云6號菌絲體發(fā)酵原酒分析

2.3.1 感官指標(biāo)

色澤：黃褐色、均勻一致；狀態(tài)：鮮亮、透明、有光澤，無雜質(zhì)、無沉淀；香氣：具有菌絲體特有的淡淡清香和典型陳年黃酒氣味；滋味：口感醇正、自然，但甜味不足、酸味有些突出；酒體：色香味基本協(xié)調(diào)，味感稍有寡淡，柔和、醇厚性稍有欠缺。

2.3.2 理化指標(biāo)

菌絲體發(fā)酵原酒各項理化指標(biāo)的檢測結(jié)果見表1。云耳百云6號菌絲液體深層培養(yǎng)物發(fā)酵原酒（下文稱“云耳菌絲發(fā)酵原酒”）除含有正常發(fā)酵酒具有的酒精、糖、酸、酯外，還含有豐富的蛋白質(zhì)，達(dá)490 mg/100 mL，以及多糖、果膠、黃酮等生物活性物質(zhì)，其中多糖、果膠質(zhì)量濃度分別達(dá)到123.2和18.2 mg/100 mL；此外，還含有鈣、鐵、鋅礦物質(zhì)元素及B族維生素。說明，該發(fā)酵酒不但營養(yǎng)價值較高，并且具有一定的保健功能。

表1 云耳百云6號菌絲液體深層培養(yǎng)物發(fā)酵原酒理化成分分析結(jié)果

2.3.3 氨基酸質(zhì)量濃度

食物蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值的高低，主要取決于所含必需氨基酸的種類、數(shù)量及組成比例，云耳菌絲發(fā)酵原酒富含人體8種必需氨基酸，且組成比例較好，必需氨基酸種類齊全（表2），其EAA/TAA為32.13%，EAA/NEAA達(dá)52.69%，比較接近FAO/WHO標(biāo)準(zhǔn)的36%和60%要求[14]。

表2 云耳百云6號菌絲液體深層培養(yǎng)物發(fā)酵原酒氨基酸組成分析結(jié)果 單位：mg/100 mL

2.3.4 微生物指標(biāo)

云耳菌絲發(fā)酵原酒中細(xì)菌菌落總數(shù)5 CFU/mL；大腸菌群＜0.03 MPN/mL，沙門氏菌、金黃色葡萄球菌均未檢出。檢測結(jié)果符合食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) GB 2758—2012《發(fā)酵酒及其配制酒》中微生物的限量要求。

2.4 配制

基于發(fā)酵原酒存在的一些缺點，特以廣西本土生產(chǎn)的純正蜂蜜進(jìn)行調(diào)配和品評，結(jié)果如表3所示。云耳菌絲發(fā)酵原酒以添加5%的純正蜂蜜為最佳方案。經(jīng)配入5%純正蜂蜜后，不但使酒體更加豐滿協(xié)調(diào)、入口更加綿柔、適口性更好、酒香清香蜜香俱佳，為該發(fā)酵酒賦予了更多的營養(yǎng)保健成分，不失為一款優(yōu)良的發(fā)酵酒。

表3 云耳百云6號菌絲液體深層培養(yǎng)物發(fā)酵原酒添加純正蜂蜜后酒體評價結(jié)果

3 結(jié)論和討論

以優(yōu)化的液體培養(yǎng)基進(jìn)行百云6號菌絲深層發(fā)酵，獲得漿糊狀、均勻一致、不分層、布滿菌絲小片段的培養(yǎng)物，經(jīng)加糖膠磨，添加酒精酵母發(fā)酵過濾后，獲得酒精度為10.3%vol的發(fā)酵原酒，經(jīng)檢測各項指標(biāo)均符合國家標(biāo)準(zhǔn)。其總糖、總酸、總酯質(zhì)量濃度分別為146，620和69 mg/100 mL，還含有豐富的營養(yǎng)和生物活性物質(zhì)，其中碳水化合物、蛋白質(zhì)、總氨基酸、多糖、果膠質(zhì)量濃度分別為890，490，305，123.2和18.2 mg/100 mL；酒體黃褐色、澄清透明，有光澤，無沉淀物和懸浮物，具有菌絲特有清香及陳黃酒酒香，無不良雜味，但口感味道稍寡淡。配入5%純正蜂蜜后，不但使酒體更加豐滿協(xié)調(diào)、入口更加綿柔、適口性更好、酒香清香蜜香俱佳，更為該發(fā)酵酒賦予了更多的營養(yǎng)保健成分。研究認(rèn)為，菌多糖、果膠、黃酮都是具有生理活性的物質(zhì)[15-17]；蜂蜜的營養(yǎng)成分非常復(fù)雜，主要成分是糖類，還有氨基酸、維生素、有機(jī)酸、生物酶等，具有保護(hù)胃腸道、抑菌消炎、抗氧化、保護(hù)心血管等作用[17-18]。

食藥用真菌在深層培養(yǎng)過程中會產(chǎn)生多糖、多肽、黃酮、生物堿、萜類化合物、甾醇、苷類、酚類、酶、核酸、氨基酸、維生素、具抗生素作用的多種化合物及植物激素等多種生理活性物質(zhì)，這些物質(zhì)分別具有對心血管、肝臟、神經(jīng)系統(tǒng)、腎、性等人體器官的防病治病作用以及抗癌、消炎、抗衰老、抗菌、抗?jié)兊裙π19-21]。以百云6號深層發(fā)酵培養(yǎng)物為原料，調(diào)配后，未經(jīng)消毒處理，開放式接種酒精酵母能夠順暢進(jìn)行酒精發(fā)酵，這應(yīng)與其中所含多糖、果膠、黃酮等活性物質(zhì)具有抗菌作用有直接關(guān)系。鄧慶華等[22]考察了黑木耳多糖對霉菌、細(xì)菌的抑制活性，結(jié)果顯示黑木耳多糖對細(xì)菌的抑制作用更為明顯。

綜上所述，以云耳百云6號菌絲液體深層培養(yǎng)物為原料，完全可以釀造出一款色、香、體、味俱佳，營養(yǎng)保健具有的優(yōu)良發(fā)酵酒。發(fā)酵酒的研制，最大限度的保留了云耳菌絲液體深層發(fā)酵物的營養(yǎng)及活性成分，并且省卻了菌絲體提取工序，簡化了工藝程序。