王會(huì)品, 李欣, 孫世珺

中山市人民醫(yī)院 1分子診斷中心， 2耳鼻咽喉科(廣東中山 528400)

包蟲(chóng)病又名棘球蚴病，是細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)的幼蟲(chóng)感染人體所致，其成蟲(chóng)寄生于犬科肉食動(dòng)物小腸內(nèi)，屬人畜共患病，該病高發(fā)于西藏、新疆、青海和內(nèi)蒙古等西部農(nóng)牧區(qū)[1-2]。中山市對(duì)口支援新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第三師41團(tuán)援疆工作隊(duì)在喀什地區(qū)工作中發(fā)現(xiàn)包蟲(chóng)病感染率較高，而常用的血清學(xué)抗體檢測(cè)和影像學(xué)超聲檢查等方法存在不能早期診斷等不足，中山市人民醫(yī)院分子診斷中心組織專家進(jìn)行分子生物學(xué)方法的研究，為實(shí)現(xiàn)提高包蟲(chóng)病診斷方法的靈敏度和特異度，進(jìn)而早診斷早治療。本研究擬用熒光探針PCR法檢測(cè)喀什地區(qū)羊肝組織中的細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)線粒體cytochrome b基因，該基因全序列長(zhǎng)度相對(duì)較短，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單無(wú)內(nèi)含子，進(jìn)化速率適中，序列變異豐富，突變率顯著高于核DNA，非常合適用來(lái)進(jìn)行細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)DNA的分子檢測(cè)及基因分型研究[3-4]。2018年8月至2020年5月，本研究根據(jù)細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)線粒體基因序列，采用引物設(shè)計(jì)軟件(NCBI Primer Blast)設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)的2條引物及水解探針，用熒光PCR方法進(jìn)行檢測(cè)觀察結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 2019年6月在新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第三師41團(tuán)草湖鎮(zhèn)衛(wèi)生檢疫部門(mén)獲取羊肝組織20份，均有肉眼可見(jiàn)的結(jié)節(jié)，大小不一，所有組織經(jīng)顯微鏡檢確認(rèn)為包蟲(chóng)病蟲(chóng)囊后進(jìn)行DNA提取，該實(shí)驗(yàn)通過(guò)了中山市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)科研倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑及儀器 組織基因組DNA提取試劑盒(貨號(hào)：DP304，天根生化科技(北京有限公司))，探針?lè)晒舛縋CR試劑盒(貨號(hào)：AG11704，艾科瑞生物)，冷凍高速離心機(jī)(型號(hào)：1424R，珠海黑馬)，全自動(dòng)樣品快速研磨儀(型號(hào)：JXFSTPRP-24，上海凈信實(shí)業(yè))。

1.3 蟲(chóng)體鏡檢 所有樣本編號(hào)后及時(shí)置于-70℃凍存，冷鏈運(yùn)輸至中山市人民醫(yī)院分子診斷中心PCR實(shí)驗(yàn)室。制備標(biāo)本染色后進(jìn)行顯微鏡檢，確定結(jié)節(jié)組織中存在細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)。

1.4 引物設(shè)計(jì) 細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)相關(guān)基因序列及上下游引物見(jiàn)表1、2。

表1 細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)的相關(guān)基因序列

表2 上下游引物

因相關(guān)細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)(Echinococcus)具有多個(gè)不同的種，其相關(guān)基因略有突變導(dǎo)致的差異，因此引物及探針設(shè)計(jì)時(shí)需考慮簡(jiǎn)并堿基，見(jiàn)圖1。

圖1 不同Echinococcus物種靶標(biāo)區(qū)域基因序列對(duì)比

最終引物及探針序列如下：上游引物：TTGTGTTGTTTCGRCGTAATTTG，下游引物：AACCTACACATAAAATCAGCCACATAC，探針：5′-FAM-AAGYAGTGGYTTTGTGTTGTCT-MGB-3′(其中R代表：A、G；Y代表：C、T)。該引物、探針序列至少可以檢測(cè)以下Echinococcus相關(guān)變種：(1)Echinococcus ortleppi isolate G5；(2)Echinococcus canadensis isolate G10；(3)Echinococcus equinus mitochondrial DNA；(4)Echinococcus granulosus isolate SPA6；(5)Echinococcus granulosus clone ZA34。

1.5 DNA提取和PCR擴(kuò)增 從肝臟組織中選取可以部位樣品30～50 mg，使用天根組織DNA提取試劑盒(目錄號(hào)：DP304)按說(shuō)明進(jìn)行基因組提取。使用分光光度計(jì)進(jìn)行核酸定量，取100 ng/μL濃度進(jìn)行10倍濃度梯度稀釋備用。

1.5.1 提取步驟 (1)取動(dòng)物組織30～50 mg，加入500 μL生理鹽水，用勻漿機(jī)勻漿為細(xì)胞懸液，然后10 000 r/min離心1 min，倒盡上清液，加200 μL緩沖液GA，振蕩至徹底懸浮。(2)加入20 μL Proteinase K溶液，混勻。在56℃放置，直至組織溶解，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。(3)加入200 μL緩沖液GB，充分顛倒混勻，70℃放置10 min，溶液應(yīng)變清亮，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。(4)加入200 μL無(wú)水乙醇，充分振蕩混勻15 s，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。(5)將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12 000 r/min離心30 s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。(6)向吸附柱CB3中加入500 μL緩沖液GD，12 000 r/min離心30 s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。(7)向吸附柱CB3中加入600 μL漂洗液PW，12 000 r/min離心30 s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。(8)重復(fù)操作步驟(7)。(9)將吸附柱CB3放回收集管中，12 000 r/min離心2 min，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。(10)將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入1個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50～200 μL洗脫緩沖液TE，室溫放置2～5 min，12 000 r/min離心2 min，將溶液收集到離心管中。

1.5.2 PCR擴(kuò)增體系 采用25 μL PCR體系，其中：5× HS PCR buffer 5 μL；HS taq 0.5 μL(2.5 U/μL)；上下游引物各0.5 μL(10 μmol/L)；Probe：1 μL(10 μmol/L)；DNA(不同濃度)2.5 μL。PCR程序：95℃ 3 min；40個(gè)循環(huán)：95℃ 10 s、60℃ 30 s。

1.6 效能檢驗(yàn)

1.6.1 特異性測(cè)試 將提取的基因組DNA稀釋100倍，另外使用其他常見(jiàn)動(dòng)物(羊、牛、驢)基因組和羊肝內(nèi)常見(jiàn)的寄生蟲(chóng)(肝片吸蟲(chóng)、莫尼茨絳蟲(chóng))的基因組作為對(duì)照進(jìn)行q-PCR。

1.6.2 Echinococcus Taqman-qPCR相關(guān)擴(kuò)增效率及標(biāo)準(zhǔn)曲線 使用梯度稀釋的基因組DNA：10 ng、1 ng、100 pg、10 pg進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 設(shè)計(jì)的引物探針在40個(gè)循環(huán)內(nèi)能夠特異地檢測(cè)出Echinococcus，而對(duì)羊、牛、驢基因無(wú)特異性擴(kuò)增，肝片吸蟲(chóng)和莫尼茨絳蟲(chóng)基因也無(wú)特異性擴(kuò)增?？梢?jiàn)建立的簡(jiǎn)并引物q-PCR法特異性好。見(jiàn)圖2。

圖2 Echinococcus Taqman-qPCR 特異性檢測(cè)

2.2 Echinococcus Taqman-qPCR相關(guān)擴(kuò)增效率及標(biāo)準(zhǔn)曲線 梯度稀釋的基因組DNA：10 ng、1 ng、100 pg、10 pg進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)均能得到標(biāo)準(zhǔn)的S型曲線，見(jiàn)圖3。此PCR體系為R2=0.984；效率為92.6%。符合qPCR的相關(guān)要求，見(jiàn)圖4。

圖3 梯度稀釋的基因組DNA擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 梯度稀釋的基因組DNA擴(kuò)增曲線

2.3 敏感度分析 因提取的為動(dòng)物肝臟組織而非純包蟲(chóng)基因組DNA，從以上數(shù)據(jù)來(lái)看，1～10 pg疑似感染包蟲(chóng)組織DNA含量可穩(wěn)定檢出。

2.4 準(zhǔn)確性驗(yàn)證 對(duì)20例感染包蟲(chóng)的羊肝組織進(jìn)行檢測(cè)，均獲得標(biāo)準(zhǔn)的S型曲線。

3 討論

在不同的地理環(huán)境和氣候條件下，細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)有不同的亞型，對(duì)人群疾病傳播動(dòng)力學(xué)、致病性和抗原抗體反應(yīng)等各不相同。因此，對(duì)細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)蟲(chóng)株的準(zhǔn)確鑒定，可指導(dǎo)抗包蟲(chóng)病藥物的選擇，包蟲(chóng)病的疫苗研制以及為進(jìn)一步完善包蟲(chóng)病控制策略等提供科學(xué)的理論依據(jù)。以往主要是從形態(tài)學(xué)和生物學(xué)等特征對(duì)包蟲(chóng)病進(jìn)行區(qū)分，隨著寄生蟲(chóng)分子遺傳學(xué)的發(fā)展，現(xiàn)已從研究表型發(fā)展到研究細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)的基因，最新的研究甚至關(guān)注到機(jī)體感染細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)后對(duì)基因表達(dá)調(diào)控的影響，比如通過(guò)深入測(cè)序和miRNA微陣列技術(shù)，發(fā)現(xiàn)宿主細(xì)胞或組織中的miRNA在寄生蟲(chóng)感染過(guò)程中被調(diào)控，并在宿主對(duì)病原體的反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。Jin等[5]研究發(fā)現(xiàn)，感染細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)會(huì)打亂小鼠肝臟中40%與miRNA合成相關(guān)的基因，例如ago1、ago4、tarbp2和xrn2等基因。

檢測(cè)感染細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)的傳統(tǒng)經(jīng)典方法主要有兩種，一種是直接觀察法，又包括剖檢法、檳榔堿瀉下法和蟲(chóng)卵漂浮檢查法。但是這些傳統(tǒng)方法不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，靈敏度不高易漏檢，且生物危害性較大。還有一種是間接檢測(cè)法，主要是針對(duì)感染后宿主的免疫反應(yīng)，主要應(yīng)用ELISA法檢測(cè)抗體，也僅僅能表明曾經(jīng)受過(guò)細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)的感染，對(duì)當(dāng)前的感染狀態(tài)無(wú)法確定。相比以上方法而言，分子生物學(xué)方法有敏感度高，特異度強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，一定程度上還以可區(qū)分細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)的亞型，實(shí)現(xiàn)了全部操作自動(dòng)化，方法簡(jiǎn)單易行，需要的擴(kuò)增產(chǎn)物量少、敏感度高、重復(fù)性好、信息量大，適用于大規(guī)模群體遺傳學(xué)研究及流行病學(xué)調(diào)查，因此得到越來(lái)越多的應(yīng)用[6-9]。目前包蟲(chóng)病的檢測(cè)主要是用B超檢測(cè)，大部分患者都是由影像學(xué)回聲信號(hào)的改變來(lái)確診，不能做到早期診斷，無(wú)法進(jìn)行早期治療，而且影像學(xué)方法還存在靈敏度和特異度都不高的問(wèn)題。

線粒體是細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化和合成ATP的主要場(chǎng)所，為細(xì)胞的活動(dòng)提供能量，因此是生物體細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器。線粒體DNA作為物種遺傳多樣性、遺傳分化與起源進(jìn)化研究的最經(jīng)典遺傳標(biāo)記，其基因組和相關(guān)編碼序列在細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)分子生物學(xué)物種基因遺傳變異的研究中被廣泛采用。線粒體DNA(mtDNA)具有基因排列緊湊、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、性質(zhì)穩(wěn)定、以母系方式遺傳等特點(diǎn)，因其核苷酸歧異度大、進(jìn)化速度快，使得線粒體DNA在種間、種內(nèi)、群體間具有廣泛的多態(tài)性，因此常被作為分子分型分類的標(biāo)記[10-13]。本研究基于線粒體cytochrome b基因，探究新疆喀什地區(qū)人和綿羊細(xì)粒棘球蚴流行株的基因型，因Echinococcus具有多個(gè)不同的種，其相關(guān)基因略有突變導(dǎo)致的差異，因此引物及探針設(shè)計(jì)時(shí)需考慮簡(jiǎn)并堿基，本研究應(yīng)用簡(jiǎn)并引物q-PCR法可以對(duì)多個(gè)亞型進(jìn)行分析，為該地區(qū)細(xì)粒棘球蚴病的防控提供參考依據(jù)。通過(guò)牛、羊和驢等牧區(qū)常見(jiàn)動(dòng)物進(jìn)行了PCR檢測(cè)，結(jié)果表明，除Echinococcus外均未擴(kuò)增出目的基因，說(shuō)明本方法設(shè)計(jì)的引物具有高度的種特異性，不會(huì)發(fā)生交叉反應(yīng)。而在測(cè)定本方法的靈敏度時(shí)，將目的基因按梯度稀釋(1～10 pg疑似感染包蟲(chóng)組織)，結(jié)果表明隨著DNA濃度的逐漸降低，目的條低至1 pg仍有典型的S型曲線，這就表明該方法具有較高的敏感度。

該方法至少還可以檢測(cè)以下幾種細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)的亞型：Echinococcus ortleppi isolate G5、Echinococcus canadensis isolate G10、Echinococcus equinus mitochondrial DNA、Echinococcus granulosus isolate SPA6和Echinococcus granulosus clone ZA34。新疆喀什地區(qū)牧場(chǎng)眾多，多次流行病調(diào)查結(jié)果顯示，無(wú)論是牧民或者牛羊犬等動(dòng)物，包蟲(chóng)病感染率均高于全國(guó)平均水平[14-15]。查閱近年來(lái)研究新疆喀什地區(qū)包蟲(chóng)病的文獻(xiàn)，僅有對(duì)其流行病學(xué)調(diào)查和防治方面的內(nèi)容，基因檢測(cè)方法尚屬空白。本研究首次對(duì)新疆喀什地區(qū)的細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)進(jìn)行了病原學(xué)鑒定，在確診細(xì)粒棘球蚴病的基礎(chǔ)上，通過(guò)分子生物學(xué)的基因分析，建立了一種靈敏度高、特異性好并且能同時(shí)檢測(cè)5種細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)亞型的q-PCR法，可以進(jìn)行包蟲(chóng)病的早期診斷，還可以促進(jìn)早期治療，敏感度和特異度較高，是具有較強(qiáng)的臨床應(yīng)用價(jià)值。

下一步擬應(yīng)用該方法對(duì)喀什地區(qū)的細(xì)粒棘球蚴病進(jìn)行調(diào)查研究，收集陽(yáng)性標(biāo)本后進(jìn)行全基因組測(cè)序，確定該地區(qū)細(xì)粒棘球蚴病的亞型種類以及比例，為精準(zhǔn)防治包蟲(chóng)病做好分子流行病學(xué)的基礎(chǔ)資料。另一方面，由于經(jīng)典的抗寄生蟲(chóng)藥(如氯喹、氯苯胍等)對(duì)一些包蟲(chóng)病的治療作用不斷減弱，耐藥風(fēng)險(xiǎn)的增加讓藥效在有些地區(qū)(如非洲)幾乎失去使用價(jià)值。這表明細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)在環(huán)境中不斷進(jìn)化，需要針對(duì)不同地區(qū)不同類型的細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)進(jìn)行分子流行病學(xué)調(diào)查研究，為下一步制作疫苗來(lái)防治包蟲(chóng)病提供分子生物學(xué)支撐[16]。有專家建議在細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)鑒定時(shí)，多采用mtDNA和核基因序列對(duì)比分析法，目的基因的選擇不要局限于mtDNA中，多層次、多內(nèi)容的分析結(jié)果可能具有更全面的說(shuō)服力[17-19]。

(志謝：感謝為本文提供實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的中山市對(duì)口支援新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第三師41團(tuán)援疆工作隊(duì)鐘強(qiáng)隊(duì)長(zhǎng)和王強(qiáng)同志。)

利益相關(guān)聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說(shuō)明：王會(huì)品直接參與醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、文章撰寫(xiě)及獲取研究經(jīng)費(fèi)等；李欣行統(tǒng)計(jì)分析、對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱及研究指導(dǎo)；孫世珺參與采集數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)分析、對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱及行政、技術(shù)或材料支持。