高瓊, 劉昱昕, 陳冬梅, 尚元元, 司佳薇, 施惠娟△

1寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院皮膚科(寧夏銀川 750004)； 2銀川市婦幼保健院皮膚科(寧夏銀川 750001)； 3寧夏醫(yī)科大學(xué)(寧夏銀川 750004)

銀屑病是一種易于復(fù)發(fā)的慢性炎癥性皮膚病，病情可控制，難根治，目前尚無(wú)特效療法，對(duì)患者的身心健康造成嚴(yán)重影響，其主要特征是表皮角質(zhì)細(xì)胞增生和炎癥因子分泌。HaCaT細(xì)胞為人永生化的角質(zhì)形成的細(xì)胞株，來(lái)源于人表皮細(xì)胞，與角質(zhì)細(xì)胞的特性極為相似，且易于培養(yǎng)，是目前銀屑病體外培養(yǎng)的模式細(xì)胞[1]。目前用于治療銀屑病的藥物存在一些缺陷，如快速?gòu)?fù)發(fā)、高成本和不良反應(yīng)等，氧化苦參堿逐漸出現(xiàn)在治療銀屑病的研究中。氧化苦參堿在我國(guó)用于治療肝炎和癌癥已有悠久的歷史，對(duì)皮膚損傷性細(xì)胞增殖有抑制作用[2]，可有效改善嚴(yán)重斑塊型銀屑病，且不良反應(yīng)小[3]。叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O亞族1(forkhead box transcription factorO1，F(xiàn)OXO1)在銀屑病皮損組織中表示水平顯著高于正常皮膚組織，與角質(zhì)形成細(xì)胞的異常增殖密切相關(guān)[4]。其中，促炎信號(hào)分子Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)是FOXO1的下游基因靶點(diǎn)[5]，而抑制蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)/FoxO1信號(hào)通路可減輕炎癥反應(yīng)[6]。另外，銀屑病患者皮損處腫瘤壞死因子-α(TNF-α)表達(dá)顯著升高，采用TNF-α誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞增殖，可模擬銀屑病患者皮損處角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖的病理特征[7]。所以，2019年1月至2020年6月，本研究通過(guò)體外培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞，以TNF-α刺激HaCaT細(xì)胞，建立銀屑病細(xì)胞模型，使用氧化苦參堿和FOXO1激活劑干預(yù)該模型，旨在探究氧化苦參堿調(diào)控FOXO1表達(dá)對(duì)TNF-α誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞炎癥因子分泌的影響，為銀屑病患者的治療提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株及藥品 人永生化表皮細(xì)胞株(HaCaT細(xì)胞)購(gòu)自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞資源庫(kù)。氧化苦參堿(純度≥98%，規(guī)格：20 mg)購(gòu)自正大天晴公司。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)審核通過(guò)(寧醫(yī)總院醫(yī)倫審[2018]0610B)。

1.1.2 主要試劑及儀器 胰蛋白酶和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)均購(gòu)自美國(guó)Giboc公司；DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)購(gòu)自北京安必奇生物科技有限公司；96孔板購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；RNA提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Genecopoeia公司；FOXO1、β-actin引物以及陰性對(duì)照空病毒載體(LV-NC-GFP)和FOXO1過(guò)表達(dá)慢病毒載體(LV-CA-FOXO1)均由上海生工生物科技有限公司構(gòu)建；腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF-α)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、蛋白marker、β-actin鼠抗和PVDF膜均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自嘉美生物技術(shù)有限公司；IL-6、TNF-α和IL-1β ELISA試劑盒均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒和ECL顯色試劑盒均購(gòu)自北京中山金橋生物科技有限公司；TLR-4、FOXO1、AKT、p-AKT鼠抗和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。酶標(biāo)儀Fax-20100購(gòu)自美國(guó)INStat公司；尼康SMZ745光學(xué)顯微鏡購(gòu)自于上海普赫生物科技有限公司；FACSCanto流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Beckman公司；全能型凝膠成像分析系統(tǒng)ChemiDoc-MP購(gòu)自山東三瑞科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HaCaT細(xì)胞使用含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，置于25 cm2培養(yǎng)瓶中，在37℃、含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)不同濃度TNF-α對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖活性的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HaCaT細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/mL，用移液器吸取每孔100 μL接種至96孔板中，每組設(shè)立6個(gè)復(fù)孔。將96孔板置于37℃，含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h，至細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。分別加入終濃度為0、10、25、50 μg/L的TNF-α，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，加入濃度為10%的CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，取出96孔板，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔在波長(zhǎng)為450 nm處的吸光度值。OD值越大表明細(xì)胞增殖活性越高。

1.2.3 細(xì)胞分組與處理 根據(jù)細(xì)胞存活情況，篩選出終濃度為25 μg/L的TNF-α處理HaCaT細(xì)胞24 h為誘導(dǎo)濃度和時(shí)間。隨后將誘導(dǎo)后的HaCaT細(xì)胞分為模型組(培養(yǎng)基中加終濃度為25 μg/L的TNF-α)、氧化苦參堿組(HaCaT細(xì)胞未轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)基中加終濃度為25 μg/L的TNF-α和終濃度為40 mg/mL氧化苦參堿[8])、氧化苦參堿+LV-NC-GFP組(HaCaT細(xì)胞轉(zhuǎn)染LV-NC-GFP，培養(yǎng)基中加終濃度為25 μg/L的TNF-α和終濃度為40 mg/mL氧化苦參堿)、氧化苦參堿+LV-CA-FOXO1組(HaCaT細(xì)胞轉(zhuǎn)染LV-CA-FOXO1，培養(yǎng)基中加終濃度為25 μg/L的TNF-α和終濃度為40 mg/mL氧化苦參堿)，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的病毒感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)加入適量LV-NC-GFP或LV-CA-FOXO1進(jìn)行轉(zhuǎn)染：接種HaCaT細(xì)胞于96孔板中，調(diào)整細(xì)胞密度為1.3×105/孔，轉(zhuǎn)染時(shí)采用不加血請(qǐng)的培養(yǎng)基與聚凝胺混合物稀釋病毒，控制聚凝胺濃度為8 mg/L，病毒濃度為1×1011TU/L。另取正常培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞為對(duì)照組。

1.2.4 qRT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中FOXO1 mRNA表達(dá)水平 各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，采用RNA抽提試劑盒提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA，以cDNA為模板，按照qRT-PCR試劑盒說(shuō)明書配置PCR反應(yīng)體系：2×SYBR mix 10 μL，H2O 8 μL，上下游引物各0.5 μL，10×cDNA模板1 μL。反應(yīng)條件設(shè)定為：95 ℃預(yù)變性5 min、95 ℃變性15 s、60 ℃退火50 s、40個(gè)循環(huán)、72 ℃延伸10 min。以β-actin為內(nèi)參，根據(jù)2-ΔΔCt算法，計(jì)算FOXO1 mRNA表達(dá)水平。FOXO1和β-actin引物序列見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.5 CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活性 收集各組培養(yǎng)24 h的細(xì)胞，使用上述1.2.2中CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞細(xì)胞增殖活性。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率 收集各組培養(yǎng)24 h的細(xì)胞，1 200 r/min離心5 min，棄上清液，用PBS洗滌2次后，加入400 μL結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，再加入5 μL Annexin V染液，輕輕混勻后置于2～8 ℃避光條件下孵育15 min；然后加入10 μL PI輕輕混勻，于2～8 ℃避光下繼續(xù)孵育5 min后，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.2.7 ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞中炎性因子含量 取培養(yǎng)24 h后的各組細(xì)胞，嚴(yán)格按照IL-6、TNF-α和IL-1β ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)，每組設(shè)置6個(gè)重復(fù)。

1.2.8 Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞中AKT、TLR-4和FOXO1蛋白表達(dá)水平 收集培養(yǎng)24 h后各組細(xì)胞，使用蛋白提取試劑盒提取總蛋白，使用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行定量。然后進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)PVDF膜、5%脫脂奶粉封閉1 h、1∶1 000濃度稀釋后的p-AKT、AKT、TLR-4、FOXO1和β-actin鼠抗4 ℃過(guò)夜孵育、含辣根過(guò)氧化物酶綴合的二抗室溫孵育2 h，用ECL顯色試劑盒顯色，全能型凝膠成像分析系統(tǒng)拍照，以β-actin為內(nèi)參，分析各組蛋白表達(dá)水平，每組設(shè)置6個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度TNF-α對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖活性的影響 0 μg/L TNF-α相比，10、25、50 μg/L TNF-α均可顯著提高HaCaT細(xì)胞增殖活性(P<0.05)，其中25 μg/L TNF-α組的細(xì)胞增殖活性最高。見(jiàn)表2。所以后續(xù)將采用25 μg/L TNF-α處理24 h誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞。

表2 不同濃度TNF-α對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖活性的影響

2.2 氧化苦參堿對(duì)HaCaT細(xì)胞FOXO1 mRNA表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，模型組HaCaT細(xì)胞FOXO1 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，氧化苦參堿組和氧化苦參堿+LV-NC-GFP組HaCaT細(xì)胞FOXO1 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，與氧化苦參堿+LV-NC-GFP組相比，氧化苦參堿+LV-CA-FOXO1組HaCaT細(xì)胞FOXO1 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組HaCaT細(xì)胞FOXO1 mRNA表達(dá)水平比較

2.3 氧化苦參堿對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖活性和凋亡率的影響 與對(duì)照組相比，模型組HaCaT細(xì)胞增殖活性顯著升高，凋亡率顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，氧化苦參堿組和氧化苦參堿+LV-NC-GFP組HaCaT細(xì)胞增殖活性顯著降低，凋亡率顯著升高(P<0.05)，與氧化苦參堿+LV-NC-GFP組相比，氧化苦參堿+LV-CA-FOXO1NC組HaCaT細(xì)胞增殖活性顯著升高，凋亡率顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表4和圖1。

注：A為對(duì)照組；B為模型組；C為氧化苦參堿組；D為氧化苦參堿+LV-NC-GFP組；E為氧化苦參堿+LV-CA-FOXO1NC組圖1 各組細(xì)胞凋亡情況

表4 各組HaCaT細(xì)胞增殖活性、凋亡率比較

2.4 氧化苦參堿對(duì)HaCaT細(xì)胞中炎性因子的影響 與對(duì)照組相比，模型組HaCaT細(xì)胞TNF-α、IL-6和IL-1β含量顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，氧化苦參堿組和氧化苦參堿+LV-NC-GFP組HaCaT細(xì)胞TNF-α、IL-6和IL-1β含量顯著降低(P<0.05)；與氧化苦參堿+LV-NC-GFP組相比，氧化苦參堿+LV-CA-FOXO1組HaCaT細(xì)胞TNF-α、IL-6和IL-1β含量顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 各組HaCaT細(xì)胞炎性因子含量比較

2.5 氧化苦參堿對(duì)HaCaT細(xì)胞中TLR-4、FOXO1蛋白表達(dá)及AKT磷酸化水平的影響 與對(duì)照組相比，模型組HaCaT細(xì)胞TLR-4、FOXO1蛋白表達(dá)及AKT磷酸化水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，氧化苦參堿組和氧化苦參堿+LV-NC-GFP組HaCaT細(xì)胞TLR-4、FOXO1蛋白表達(dá)及AKT磷酸化水平顯著降低(P<0.05)；與氧化苦參堿+LV-NC-GFP組相比，氧化苦參堿+LV-CA-FOXO1組HaCaT細(xì)胞TLR-4、FOXO1蛋白表達(dá)及AKT磷酸化水平顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表6和圖2。

表6 各組細(xì)胞TLR-4、FOXO1蛋白表達(dá)及AKT磷酸化水平比較

3 討論

銀屑病俗稱牛皮癬，是一種頑固性的慢性炎癥性皮膚病，病程長(zhǎng)，易復(fù)發(fā)，甚至部分患者會(huì)出現(xiàn)終生不愈，該病臨床表現(xiàn)以紅斑、鱗屑為主，全身均可發(fā)病，但以頭皮、四肢處較為常見(jiàn)，多在冬季加重，對(duì)患者的身心健康造成嚴(yán)重影響，其病理表現(xiàn)為角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)度增殖且出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)[9]，由于現(xiàn)有藥物的不良反應(yīng)或治療費(fèi)用昂貴，目前可用于治療銀屑病的方法并不令人滿意[10]。而TNF-α是炎癥性皮膚病中的關(guān)鍵因子[11]，誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞中TNF-α的表達(dá)可通過(guò)引起HaCaT細(xì)胞異常增殖[12]，促進(jìn)銀屑病的發(fā)生進(jìn)程[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，25 μg/L TNF-α誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞24 h，可顯著提高細(xì)胞增殖活性、TNF-α、IL-6、IL-1β炎性因子含量，降低細(xì)胞凋亡率，提示TNF-α可促進(jìn)HaCaT細(xì)胞炎性因子分泌，引起細(xì)胞過(guò)度增殖。

氧化苦參堿又名苦參素，是從豆科植物苦參或平科植物廣豆根中分離出來(lái)色生物堿，具有抗增殖、抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和促凋亡等作用，臨床適應(yīng)癥包括慢性乙型病毒肝炎的治療和腫瘤放療和療效引起的白細(xì)胞低下或其他原因引起的白細(xì)胞減少癥。氧化苦參堿是一種較強(qiáng)的免疫抑制劑，使用氧化苦參堿治療銀屑病，可顯著降低患者病情嚴(yán)重程度，且氧化苦參堿在體外可明顯抑制人角質(zhì)形成細(xì)胞的活力、增殖和分化能力，對(duì)維持人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的正常功能十分重要[14]。Xiang等[15]研究發(fā)現(xiàn)氧化苦參堿具有緩解銀屑病瘙癢和炎癥的作用，另外，Groma等[16]研究發(fā)現(xiàn)氧化苦參堿具有抗纖維化和抗病毒的作用，已被證明是一種治療銀屑病的潛在藥物。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，氧化苦參堿組HaCaT細(xì)胞增殖活性、TNF-α、IL-6、IL-1β含量顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，提示氧化苦參堿可減輕細(xì)胞炎性因子分泌，緩解HaCaT細(xì)胞過(guò)度增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但其中的機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

Li等[17]研究發(fā)現(xiàn)AKT/FoXO1信號(hào)通路參與銀屑病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，Berthelot等[18]研究發(fā)現(xiàn)FoXO1基因可選擇性地促進(jìn)部分炎性因子的生成，而銀屑病患者血清中AKT和Foxo1表達(dá)水平顯著升高[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組HaCaT細(xì)胞FOXO1蛋白和mRNA表達(dá)水平顯著升高，提示FoXO1在銀屑病中可能處于過(guò)表達(dá)狀態(tài)，而FOXO1下游因子AKT磷酸化水平和TLR-4蛋白表達(dá)水平顯著升高，提示FOXO1下游信號(hào)通路在銀屑病中可能處于激活狀態(tài)。本研究使用氧化苦參堿干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，氧化苦參堿可顯著降低TLR-4蛋白表達(dá)水平，Akt磷酸化水平以及FOXO1 mRNA和蛋白表達(dá)水平，提示氧化苦參堿可能通過(guò)抑制FOXO1及其下游因子表達(dá)，減少細(xì)胞炎性因子分泌。Arbiser等[20]研究發(fā)現(xiàn)螺藻素類似物可通過(guò)使皮膚增生正常化，減少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、逆轉(zhuǎn)銀屑病中TLR4的上調(diào)，使皮膚屏障恢復(fù)正常。為進(jìn)一步探討氧化苦參堿調(diào)控FOXO1表達(dá)對(duì)TNF-α誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞炎癥因子分泌的影響，本研究將HaCaT細(xì)胞轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)FOXO1載體后，使用氧化苦參堿培養(yǎng)和TNF-α誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)，與轉(zhuǎn)染空載體相比，轉(zhuǎn)染FOXO1過(guò)表達(dá)載體后，HaCaT細(xì)胞FOXO1 mRNA表達(dá)水平、細(xì)胞增殖活性、TNF-α、IL-6、IL-1β含量以及TLR-4、FOXO1蛋白表達(dá)和AKT磷酸化水平顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低，提示氧化苦參堿對(duì)降低TNF-α誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞炎性因子分泌及促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖的作用，可被FOXO1過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)，進(jìn)一步揭示了氧化苦參堿可能通過(guò)抑制FOXO1表達(dá)，減少炎性因子分泌并促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖。

綜上所述，氧化苦參堿可能通過(guò)抑制FOXO1表達(dá)，減少TNF-α誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞炎癥因子分泌，且可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖。但氧化苦參堿對(duì)TNF-α誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞的作用機(jī)制較為復(fù)雜，尚需深入研究。

利益相關(guān)聲明：所有作者均聲明不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說(shuō)明：高瓊負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、論文撰寫；劉昱昕、司佳薇負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)；陳冬梅、尚元元負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)分析、修改；施惠娟負(fù)責(zé)指導(dǎo)。