劉東來

中國食品藥品檢定研究院

張棟

中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科

韓東升

浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院檢驗科

艾靜文

復旦大學附屬華山醫(yī)院感染科

關文達

廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院廣州呼吸健康研究院

胡晉君

中國食品藥品檢定研究院

李曼郁

中國食品藥品檢定研究院

周海衛(wèi)

中國食品藥品檢定研究院

王佑春

中國食品藥品檢定研究院

吳文娟*

同濟大學附屬東方醫(yī)院南院檢驗科

許四宏*

中國食品藥品檢定研究院

病原宏基因組高通量測序（metagenomic nextgeneration sequencing，mNGS）通過對標本總核酸進行測序分析，能夠無偏倚地檢測標本中的病毒、細菌、真菌和寄生蟲等[1-2]，尤其適合新發(fā)突發(fā)病原體鑒定、復雜及混合感染以及不明原因感染的臨床輔助診斷[3-11]。近年來，mNGS 技術在臨床診斷領域得到快速發(fā)展和應用，并在新冠肺炎疫情發(fā)生后迅速鎖定新型冠狀病毒的過程中發(fā)揮了重要作用[2]?，F(xiàn)階段，mNGS 檢測流程對實驗室環(huán)境、儀器設備和人員專業(yè)技能要求高，主要在第三方醫(yī)學實驗室開展[12]。

隨著mNGS 自動化、集成化及智能化程度的提升，國內(nèi)越來越多的醫(yī)療機構(gòu)（醫(yī)院）已經(jīng)或計劃在本院實驗室內(nèi)完成標本檢測和結(jié)果報告全流程[13-15]。然而，mNGS 檢測流程仍存在實驗操作復雜、技術選型多樣及質(zhì)量控制標準化程度較低等技術挑戰(zhàn)，其可靠性和準確性等仍有優(yōu)化潛力[16-17]。因此，為保證mNGS檢測的有序開展、規(guī)范管理及合理使用，醫(yī)院對mNGS 本地化質(zhì)量評價的需求較為迫切。盡管國內(nèi)外已有多個研究團隊報道過mNGS 質(zhì)量評價的相關研究，但仍未建立公認的適合醫(yī)院本地化開展質(zhì)量評價活動的方案[11-12,17-24]。

中國食品藥品檢定研究院（以下簡稱中檢院）于2021 年9 月至2022 年2 月 聯(lián) 合42 家 醫(yī) 院的47 個科室開展相關質(zhì)量評價研究，以期為推動國內(nèi)醫(yī)院mNGS本地化建設提供參考經(jīng)驗。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)量評價參考品

本次聯(lián)合研究使用的mNGS技術質(zhì)量評價參考品由中檢院團隊設計研制[23]，由D1 和D2 系列2 組參考品組成，分別包括2個陽性參考品、6 個陰性參考品、1 個重復性參考品、1 個檢出限參考品以及6 個穩(wěn)健性參考品，詳見表1。除空白參考品D0 僅含有人源細胞以外，其他參考品均由5 種微生物與人源細胞混合制備，詳見表2。

表1 mNGS 技術質(zhì)量評價參考品

表2 mNGS 技術質(zhì)量評價參考品組成

1.1.2 參考品使用方法

參考品于-20℃及以下條件保存及運輸，編盲后分發(fā)至各醫(yī)院。以D1 系列參考品為例，說明參考品檢測方案：使用mNGS 本地化檢測流程，對D1-1、D1-2各檢測1 次，評價陽性符合率（準確性）；對D1-2 重復檢測3 次，評價重復性；對D1-3 檢測1 次，評價檢出限；對D1-1、D1-2和 D1-3 及 D1-3、D1-2(10)和D1-1(100) 2 組線性標本分別各檢測1 次，評價穩(wěn)健性（魯棒性）；對D0 檢測1 次，再結(jié)合以上各參考品的檢測結(jié)果，共同評價陰性符合率（特異性）。

1.2 聯(lián)合研究方案

1.2.1 參加單位

項目組于中檢院官網(wǎng)發(fā)布通知介紹研究背景及申報要求，并公開邀請國內(nèi)已經(jīng)開展mNGS 本地化項目的醫(yī)院共同參加聯(lián)合研究。報名單位按要求提交相關技術資料以供參加資格審核。

1.2.2 研究流程

（2）焊接材料選擇 根據(jù)N08367超級奧氏體不銹鋼的化學成分、力學性能以及焊接性的特點，在焊接材料的選擇時需要保證其焊縫金屬力學性能，同時要保證焊接接頭的耐腐蝕性能與母材相當，焊縫金屬的抗點腐蝕當量指數(shù)PREN≥40。焊接Mo含量為6%的超級奧氏體不銹鋼，遵循“高匹配”原則，采用Mo含量達到9%的Ni-Cr-Mo系列鎳基合金材料，以確保焊縫金屬的耐腐蝕性能，例如NiCrMo合金系列焊接材料。同時，在焊接材料選擇時還需要考慮焊接材料的經(jīng)濟性原則。

參加單位收到低溫寄送的編盲參考品后，對其溫度和外觀進行檢查。確認參考品狀態(tài)正常后，各單位在本院實驗室內(nèi)使用已經(jīng)建立的呼吸道感染或中樞神經(jīng)感染mNGS 檢測流程，按參考品使用方法（見1.1.2 參考品使用方法）進行檢測。檢測結(jié)束后，各單位于規(guī)定時間內(nèi)、按規(guī)定格式回報原始數(shù)據(jù)和檢測報告，包括技術選型、質(zhì)量控制參數(shù)、原始下機數(shù)據(jù)及檢測結(jié)果等。中檢院對各單位的回報結(jié)果進行質(zhì)量控制和過濾后，完成匯總、統(tǒng)計、分析及評價，研究流程詳見圖1。

圖1 聯(lián)合研究流程

1.2.3 評分標準

mNGS 本地化檢測流程的質(zhì)量評價，包括陽性符合率（準確性）、陰性符合率（特異性）、重復性、檢出限及穩(wěn)健性5 個項目。根據(jù)參考品檢測要求以及各單位對相應參考品中微生物的具體檢出情況進行評分，各項目計20 分，詳見表3。

表3 參考品檢測要求及評分標準

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

對各單位的回報結(jié)果按以下原則進行質(zhì)量控制：①審核回報結(jié)果的完整性。如果數(shù)據(jù)信息不完整，則聯(lián)系參加單位進行補充。②初篩檢測數(shù)據(jù)的準確性。如果數(shù)據(jù)疑似有誤，則聯(lián)系參加單位進行復核并確認。

對符合規(guī)定的回報結(jié)果進行匯總和統(tǒng)計，分析5 個評價指標分布及其與各單位檢測流程的技術選型相關性，包括標本處理方式、測序平臺、測序數(shù)據(jù)量、生物信息學分析流程及各環(huán)節(jié)自動化程度等。此外，對相關參考品的檢測數(shù)據(jù)進行計算并分析變異系 數(shù)（coefficient of variation，CV）及線性相關系數(shù)絕對值（|r|）。

1.4 統(tǒng)計分析方法

采用R 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析及作圖。相關性分析采用Spearman 法，平均值比較采用Mann-Whitney U 檢 驗，P＜0.05 為有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1 參加單位評價結(jié)果總體情況

共有來自全國17 個省、直轄市的42 家醫(yī)院的47 個科室，共同參與聯(lián)合研究，其中上海7 家、北京6 家、廣東5 家及浙江4 家等，詳見圖2。共回報49 組有效數(shù)據(jù)，其中有2 個科室分別提交了基于2 個不同檢測流程的回報結(jié)果，總數(shù)據(jù)量26 432 MB（約25.8 GB），單標本的最高測序數(shù)據(jù)量168.8 MB，最低測序數(shù)據(jù)量3.9 MB。

圖2 參加單位分布情況

回報的49 組數(shù)據(jù)，包括3種不同原理的測序平臺，再根據(jù)所使用的測序儀和芯片，可進一步分為7 種測序策略，分別是基于深圳華大智造科技股份有限公司的MGISEQ-200-SE50、MGISEQ-2000-SE50及BGISEQ-50-SE50， 基 于 因美納（中國）科學器材有限公司的Nextseq-SE50、Nextseq-SE75 及MiSeq-SE50， 以 及 基于賽默飛世爾科技（中國）有限公司的Ion Torrent-SE150。

從測序數(shù)據(jù)量來看，深圳華大智造科技股份有限公司平臺略高于其他平臺；從測序質(zhì)量來看，Q20 數(shù)據(jù)各平臺均一致，Q30 數(shù)據(jù)因美納（中國）科學器材有限公司平臺略高于其他平臺，見圖3A；人源細胞濃度相對較低的參考品，如D1-2(10)、D1-1(100)、D2-2(10) 及D2-1(100)，其測序數(shù)據(jù)量相較其他參考品略低，而測序數(shù)據(jù)的GC含量則略高于其他參考品，見圖3B。

圖3 測序數(shù)據(jù)的基本參數(shù)指標

各參加單位按回報的49 組數(shù)據(jù)，根據(jù)評分標準對各mNGS本地化檢測流程的5 個性能指標進行分析及評分。所有回報數(shù)據(jù)中，全部性能指標均為滿分的占29%。其中，陰性符合率（特異性）的滿分占比最高，為92%；其次為陽性符合率（準確性）和檢出限，滿分占比分別為73%和71%；重復性和穩(wěn)健性的滿分占比則偏低且均小于50%，分別為47%和31%。詳見表4。

表4 mNGS 檢測流程質(zhì)量評價評分結(jié)果

2.2 評價指標統(tǒng)計分析

2.2.1 陽性符合率分析

陽性參考品D1-1、D1-2、D2-1 及D2-2 的 檢 出 情 況 詳見圖4。根據(jù)評分標準，評價陽性符合率（準確性）。在49 組數(shù)據(jù)中，36 組數(shù)據(jù)的陽性符合率均為滿分，滿分占比73%；陽性符合率為90% 的有10 組數(shù)據(jù)；此外，還有2 組數(shù)據(jù)和1 組數(shù)據(jù)的陽性符合率分別為70% 和50%，見圖4。各參加單位對不同微生物的檢出能力略有差異。對于D1 系列參考品，副流感嗜血桿菌的檢出率最高，為100% ；馬紅球菌最低，為78%；格氏李斯特菌、瓊氏不動桿菌及藤黃微球菌分別為98%、96% 及94%。 對 于D2系列參考品，熒光假單胞菌、嗜肺軍團菌及葡萄牙念珠菌的檢出率，均為100% ；嗜水氣單胞菌和干燥奈瑟菌分別為98% 和96%。

圖4 參考品中各微生物總體檢出率

2.2.2 陰性符合率分析

對所有參考品的檢測結(jié)果進行分析，根據(jù)評分標準，評價陰性符合率（特異性）。在49 組數(shù)據(jù)中，45 組數(shù)據(jù)的陰性符合率均為滿分，滿分占比92%；3 組數(shù)據(jù)的陰性符合率均為75%，另有1 組數(shù)據(jù)的陰性符合率僅為15%，見圖4。對假陽性微生物的種類及檢出頻率進行分析，其中2 組數(shù)據(jù)均在檢測空白參考品D0 時，出現(xiàn)假陽性結(jié)果，假陽性微生物種類均為D1 和D2 系列參考品中存在的；有1 組數(shù)據(jù)在不同參考品或同一個參考品的重復檢測時，檢出不同的假陽性微生物，種類為臨床常見病原微生物，并非D1和D2 參考品中存在的；另有1組數(shù)據(jù)，對于除D0 以外的每一個參考品進行檢測時，均出現(xiàn)由于菌種鑒定異常發(fā)生的假陽性結(jié)果，格氏李斯特菌被錯誤鑒定為單核細胞增生李斯特菌，干燥奈瑟菌被錯誤鑒定為黏膜奈瑟菌及腦膜炎奈瑟菌，見圖5。

圖5 假陽性微生物種類及其檢出頻率

2.2.3 重復性分析

重復性參考品D1-2 和D2-2分別重復檢測3 次，根據(jù)評分標準，計算參考品中各微生物每百萬檢出序列數(shù)的變異系數(shù)，評價重復性，見圖6。在49 組數(shù)據(jù)中，23 組數(shù)據(jù)的重復性得分為滿分，占比47%；14 組數(shù)據(jù)得分率為90%；其他12 組數(shù)據(jù)得分率較為分散，分別為80%（2組）、70%（3 組）、50%（6 組）、40%（1 組），見圖6。此外，有10 組數(shù)據(jù)，除未檢出的微生物外，其他檢出的微生物序列數(shù)的變異系數(shù)均≤50%。

圖6 D1 和D2 系列參考品中微生物的總體變異系數(shù)

2.2.4 穩(wěn)健性分析

D1 和D2 系列參考品均設置了2 組線性標本，分別為“人源細胞濃度固定-微生物濃度梯度降低”和“微生物濃度固定-人源細胞濃度梯度降低”，詳見表2。基于不同測序策略的mNGS 檢測流程，微生物的檢出序列數(shù)均呈“V”字形趨勢，詳見圖4 和圖7。

圖7 各mNGS 檢測流程對應D1 和D2 系列參考品的穩(wěn)健性分析

根據(jù)評分標準，計算參考品中各微生物每百萬檢出序列數(shù)的線性相關系數(shù)絕對值|r|，評價穩(wěn)健 性。在49 組 數(shù) 據(jù) 中，18 組數(shù)據(jù)的穩(wěn)健性得分為滿分，占比37%；其他31 組數(shù)據(jù)得分率較為分散，90%～＜100%有11 組，80%～＜90%有4 組，70%～＜80% 有8 組，60%～＜70% 有3 組，＜60%有5 組。

2.3 技術選型與評價指標的相關性分析

分析49 組數(shù)據(jù)的技術選型，包括標本前處理、病原富集、核酸提取、核酸片段化、測序儀、測序讀長、測序數(shù)據(jù)質(zhì)控和比對軟件以及自動化程度等，見表5。標本前處理環(huán)節(jié)的主要技術選型為物理珠擊研磨（59%）和化學裂解（22%）；選擇去宿主技術進行病原富集的占少數(shù)（27%）；核酸提取環(huán)節(jié)，磁珠法使用率（69%）高于柱提法（31%）；核酸片段化環(huán)節(jié)主要技術選型為內(nèi)切酶（71%）和轉(zhuǎn)座酶（24%）；測序平臺有深圳華大智造科技股份有限公司（35%）、因美納（中國）科學器材有限公司（63%）及賽默飛世爾科技（中國）有限公司（2%）3 家公司的10 種測序儀。對于自動化程度，不同環(huán)節(jié)技術選型的自動化程度各不相同，總體上生物信息學分析流程的自動化程度高于試驗操作環(huán)節(jié)，見表5。

表5 各參加單位mNGS 檢測流程技術選型

對實驗環(huán)節(jié)的不同技術選型與評價指標總體滿分率之間的相關性進行分析，結(jié)果顯示標本前處理、病原富集及核酸片段化環(huán)節(jié)的不同技術選型對檢測結(jié)果具有顯著影響。具體而言，化學裂解處理，不進行去宿主處理，以及內(nèi)切酶處理均與總體滿分率呈顯著正相關，詳見圖8～圖10。對測序數(shù)據(jù)量進行分層分析，盡管可以觀察到總體滿分率的提高與測序數(shù)據(jù)量的增加呈正相關，但無統(tǒng)計學差異。此外，核酸提取方法和測序策略，與總體滿分率無顯著相關性。進一步分析可能導致穩(wěn)健性評分降低的因素，即病原富集和測序數(shù)據(jù)量，結(jié)果顯示不進行去宿主處理且測序數(shù)據(jù)量＞30M 時，更易獲得較好的穩(wěn)健性。

圖9 病原富集和測序數(shù)據(jù)量與穩(wěn)健性滿分率之間的相關性分析

圖10 檢測流程的不同技術選型對評價指標總滿分率的影響

3 討論

對于病原病因不明感染診斷的獨特優(yōu)勢，令mNGS 技術獲得越來越廣泛的臨床關注和應用[3-10]。同時在國家相關政策的鼓勵下，越來越多的醫(yī)療機構(gòu)正積極探索mNGS 本地化建設[14-15]。在推進mNGS 臨床檢測規(guī)范化臨床應用的過程中，開展臨床檢測前的性能評價和開展臨床檢測后的能力驗證或室間質(zhì)評等，均是保證臨床檢測質(zhì)量的重要方面[13]。因此，本研究聯(lián)合國內(nèi)已經(jīng)積累mNGS 本地化實踐經(jīng)驗的42 家醫(yī)院，以能力驗證和室間質(zhì)評的形式，共同探索可被廣泛認可的質(zhì)量評價方案，同時對實驗室已建立的檢測方法進行初步評估。

參考品是mNGS 質(zhì)量評價的基礎。自2018 年，中檢院曾2 次組織覆蓋行業(yè)10 余家體外診斷試劑生產(chǎn)企業(yè)、科研院所及醫(yī)療機構(gòu)等利益相關方的大規(guī)模mNGS 質(zhì)量評價聯(lián)合研究[11,17]；先后為10 余家企業(yè)提供技術指導，并完成相關mNGS 檢測試劑盒的注冊檢驗。在此基礎上，結(jié)合醫(yī)院的實際需求，中檢院研制了醫(yī)院本地化全流程質(zhì)量評價參考品，能夠?qū)NGS 檢測流程的準確性（陽性符合率）、特異性（陰性符合率）、重復性、檢出限及穩(wěn)健性等性能指標進行評價[23]，能夠讓醫(yī)院較為高效便捷地初步了解mNGS 本地化檢測系統(tǒng)的技術特點和性能情況。

對于mNGS 檢測流程，必須經(jīng)過特定的生物信息學分析流程才能獲得檢測結(jié)果，所需的病原體數(shù)據(jù)庫中參考序列的數(shù)量、種類及序列質(zhì)量，決定了mNGS 技術的理論檢測范圍[25-26]，同時也是影響檢測結(jié)果準確性的重要因素[16]。對于D1 系列參考品，12 家單位漏檢馬紅球菌，3 家漏檢藤黃微球菌，2 家漏檢瓊氏不動桿菌；對于D2 系列參考品，1 家漏檢嗜水氣單胞菌，將格氏李斯特菌被錯誤鑒定為單核細胞增生李斯特菌，將干燥奈瑟菌被錯誤鑒定為黏膜奈瑟菌及腦膜炎奈瑟菌。評估結(jié)果提示，可能的原因是部分實驗室所使用的病原體數(shù)據(jù)庫缺少該病原體基因序列信息，或生物信息學分析流程的過濾機制導致了上述漏檢和錯誤鑒定的發(fā)生。因此，在mNGS本地化建設時，需加強對于生物信息學分析流程以及病原體數(shù)據(jù)庫的關注[27-29]。此外，試劑背景菌和標本間的交叉污染是假陽性結(jié)果的主要原因[17]。實驗室在建立方法學后，可根據(jù)實際情況建立背景核酸數(shù)據(jù)模型用于監(jiān)測不動桿菌屬等mNGS 檢測流程中常見試劑背景菌。標本間的交叉污染，則可來源于mNGS 檢測流程的各環(huán)節(jié)，實驗室應建立有效的防污染策略。

本次聯(lián)合研究的49 組數(shù)據(jù)中，有53%的變異系數(shù)＞50%，與以往的研究結(jié)果相似[17]，提示mNGS 檢測的整體穩(wěn)定性仍有較大優(yōu)化和提高的空間。相關原因比較復雜，總體上實驗操作各個環(huán)節(jié)相較于生物信息學分析環(huán)節(jié)，對高變異系數(shù)的貢獻更大，包括但不限于：標本前處理使得不同微生物核酸的釋放效率有偏差；去或不去宿主核酸流程之間的偏差；核酸片段化產(chǎn)生了隨機大小的片段使得擴增環(huán)節(jié)產(chǎn)生偏差等。目前，mNGS 檢測多以定性檢測向臨床提供結(jié)果，如需使用mNGS 對病原體進行半定量或定量檢測，應充分考慮該檢測流程重復性以及對檢測結(jié)果和臨床診療的潛在影響。

本次聯(lián)合研究中，探索性地通過線性相關系數(shù)對檢測流程的穩(wěn)健性進行評價。希望通過考察人源細胞與微生物的相對濃度或相對比例，對檢測系統(tǒng)整體穩(wěn)定性的影響，從而反映感染性臨床樣本的復雜性對檢測穩(wěn)健性的影響[23]。結(jié)果顯示，去宿主技術是mNGS 檢測穩(wěn)健性的重要影響因素。目前，去宿主技術主要有3 種[30]，一是利用人源細胞與病原體大小進行分離；二是基于真核細胞與原核細胞的核酸甲基化修飾差異，去除人源核酸；三是利用細胞外層結(jié)構(gòu)的差異，選擇性裂解宿主細胞后去除人源核酸。去宿主技術影響穩(wěn)健性的原因可能包括：人源核酸的部分去除引起總核酸產(chǎn)量的降低，導致核酸提取環(huán)節(jié)失控；用于文庫構(gòu)建的核酸始量較低，導致建庫環(huán)節(jié)失控；人源核酸占比的降低使背景核酸放大，導致背景菌過濾及結(jié)果解讀環(huán)節(jié)失控。

保證mNGS 檢測系統(tǒng)整體的穩(wěn)定性，是該技術臨床應用的重要基礎。盡管在本次聯(lián)合研究中，基于前期的研究經(jīng)驗，使用“每百萬檢出序列數(shù)”這一參數(shù)對重復性和穩(wěn)健性評價指標進行了量化評分與分析。但是，該評價方法仍存在局限性。例如，使用絕對檢出序列數(shù)、每十萬檢出序列數(shù)等其他參數(shù)進行分析時，結(jié)果可能會發(fā)生變化；如果某檢測系統(tǒng)明確聲稱檢出序列數(shù)與檢出微生物濃度之間沒有任何相關性，則該系統(tǒng)不適用上述評價方法；本研究未能考察同一檢測系統(tǒng)在一定時間段內(nèi)的長期穩(wěn)健性。在mNGS 本地化建設時，應充分考慮并重視影響檢測系統(tǒng)穩(wěn)定的各個潛在因素，有助于保證日常運行的穩(wěn)定可控。

綜上所述，中檢院聯(lián)合42 家醫(yī)院共同開展mNGS 質(zhì)量評價研究，對mNGS 各性能指標進行初步評價，并進一步對實驗環(huán)節(jié)的各技術選型對檢測結(jié)果的影響進行了相關性分析。相關研究成果將為我國醫(yī)院的mNGS 本地化建設提供參考。未來，更穩(wěn)定的檢測系統(tǒng)、更準確的檢測結(jié)果以及更簡便的操作，將是mNGS 技術發(fā)展與提高的必然方向。此外，項目組仍在對本次研究的原始數(shù)據(jù)進行生物信息學深度挖掘和關聯(lián)分析，待整理完成后也將公開。本研究尚有不足和局限，如未對mNGS 技術檢測病毒的性能進行質(zhì)量評價及分析、未對生物信息學分析流程單獨進行質(zhì)量評價以及各環(huán)節(jié)影響因素進行詳細拆解分析，在未來，計劃有針對性地研制相應實物及虛擬參考品補充研究。