朱小芳，楊會(huì)成，王萍亞，趙巧靈，陳 康，薛 靜，沈 清*

（1 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心 浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室浙江工商大學(xué)海洋食品研究院 杭州 310012 2 舟山市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院 浙江舟山 316000 3 浙江省海洋開發(fā)研究院 浙江舟山 316100）

鹽酸氯苯胍（Robenidine hydrochloride）作為一種抗球蟲藥，添加于飼料中，對(duì)治療雞、兔的急、慢性球蟲病均有較好的效果[1-2]，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中被允許用于治療魚類孢子蟲病的國標(biāo)漁藥[3-5]。然而，鹽酸氯苯胍長(zhǎng)期使用會(huì)導(dǎo)致球蟲產(chǎn)生嚴(yán)重的抗藥性[6]。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部、國家衛(wèi)生健康委員會(huì)、國家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局三部門聯(lián)合發(fā)布的GB 31650-2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》規(guī)定氯苯胍在雞脂肪、皮以及其它可食組織中的最高殘留限量分別為200，200，100 μg/kg[7]。鹽酸小檗堿是黃連、黃柏的主要有效成分，具有瀉火解毒、清熱燥濕效用以及抗微生物和顯著的抑菌作用，用于治療由愛德華氏菌、弧菌等引起的養(yǎng)殖魚類的出血病、腹水病等疾病[8]。過量使用鹽酸小檗堿會(huì)導(dǎo)致便秘、皮疹、發(fā)熱，甚至可能導(dǎo)致橫紋肌溶解癥及乳酸中毒癥，引起B(yǎng) 族維生素吸收障礙，出現(xiàn)周圍神經(jīng)炎。為保障我國水產(chǎn)品質(zhì)量安全以及消費(fèi)者身體健康，促進(jìn)水產(chǎn)品養(yǎng)殖行業(yè)的綠色、可持續(xù)發(fā)展，建立一種同時(shí)、快速測(cè)定魚肉中鹽酸氯苯胍和鹽酸小檗堿殘留分析的檢測(cè)方法，對(duì)水產(chǎn)品的質(zhì)量安全與相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)工作具有重要意義。

目前，對(duì)動(dòng)物源性食品中的獸藥殘留的定性與定量分析主要有酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、氣相色譜-電子捕獲檢測(cè)法、電化學(xué)法、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法等。ELISA 具有靈明度高、檢測(cè)量大、步驟簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，目前廣泛用于水產(chǎn)品中獸藥殘留的快速檢測(cè)。王強(qiáng)等[9]制備免疫原MT17-KLH 并獲取特異性識(shí)別甲基睪酮的多克隆抗體，通過酶聯(lián)免疫吸附法建立測(cè)定水產(chǎn)品中甲基睪酮的方法。氣相色譜對(duì)于有機(jī)磷、有機(jī)氯等易揮發(fā)藥物檢測(cè)具有分離效能高、技術(shù)穩(wěn)定成熟的優(yōu)勢(shì)。符靖雯等[10]通過HLB 小柱凈化、氣相色譜分離、電子捕獲檢測(cè)，成功分離并檢測(cè)出11 種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥和3 種氯霉素類獸藥。液-質(zhì)譜聯(lián)用法是目前最為廣泛使用的一種高效、可靠、穩(wěn)定的獸藥殘留檢測(cè)方法[11-13]。孫丕等[14]建立液-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定水產(chǎn)品、禽畜肉、牛奶中7 種喹諾酮類藥物的殘留。殷平等[15]采用液相色譜-質(zhì)譜同位素稀釋法同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中氯霉素、氟苯尼考、甲砜氯霉素3 種殘留藥物的方法。然而，液-質(zhì)譜聯(lián)用法的樣品前處理復(fù)雜，需將樣品進(jìn)行提取、固相萃取凈化、過膜去除大顆粒等步驟，存在操作步驟繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)這一弊端[16]。

本研究采用新型固相濾膜萃取 （Solid-phase and membrane based extraction，SPME），通過兼容性研究和條件優(yōu)化，整合通過式固相萃?。≒RiME）和微孔濾膜，具有快速、省時(shí)等特點(diǎn)。以固相濾膜萃取液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定魚肉中鹽酸氯苯胍和鹽酸小檗堿殘留，旨在為研究鹽酸小檗堿、鹽酸氯苯胍在魚肉體內(nèi)的殘留監(jiān)測(cè)提供一種快速、有效的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售鯽魚、鯉魚、草魚，杭州城西物美超市。

鹽酸氯苯胍，純度≥98%，百靈威科技有限公司；鹽酸小檗堿，純度≥98%，阿拉丁試劑有限公司；甲醇、乙腈、甲酸（色譜純級(jí)），美國TEDIA 公司；實(shí)驗(yàn)用水為電阻率18.2 MΩ·cm 的Milli-Q 高純水，其余試劑均為分析純級(jí)；固相濾膜萃取柱（500 mg，6 mL），實(shí)驗(yàn)室自制，向針頭濾膜腔體填入PRiME 填料，并用篩板（或棉花）固定。

1.2 儀器與設(shè)備

液相色譜儀（Agilent 1200），美國Agilent 公司；三重四極桿質(zhì)譜儀（4000 QTrap），美國AB Sciex 公司；高速離心機(jī) （Allegra X-12），美國Beckman 公司；數(shù)控式恒溫循環(huán)水浴槽（HD120-T8），英國Prima 公司；渦旋振蕩器（Multi Reax），德國Heidolph 公司；Waters XSelect HSS T3 色譜柱（2.1 mm×150 mm，3.5 μm），美國Waters 公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

以甲醇為溶劑配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的鹽酸氯苯胍和鹽酸小檗堿混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，臨用時(shí)以空白魚肉基質(zhì)提取液將上述標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋為混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 方法

1.4.1 樣品的采集與制備 對(duì)活樣品 （鯽魚、鯉魚、草魚）通過放血、去鱗片去皮等步驟處理后，分別取魚腹部和背部肌肉組織，用清水清洗并去除血污與泥沙后，吸除多余水分，分別將肌肉組織放入攪拌機(jī)中搗成勻漿狀，置于-20 ℃凍藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 樣品前處理 準(zhǔn)確稱取魚肉樣品2.0 g（精確到0.1 g） 于50 mL 離心管中，加入5 mL 90%（體積分?jǐn)?shù)）甲醇水溶液后將螺旋蓋蓋上，高速旋渦振蕩5 min，并放置于80 ℃水浴加熱20 min。取出離心管，于5 000 r/min 轉(zhuǎn)速下離心5 min，轉(zhuǎn)移全部上層清液于10 mL 容量瓶中。向離心管中繼續(xù)加入4 mL 90%甲醇水溶液，重復(fù)上述提取步驟。合并2 次提取液，用90%甲醇水溶液定容到10 mL 備用。

使用一次性注射器將提取液上樣至固相濾膜萃取柱，通過手動(dòng)活塞加壓，使樣品以1 滴/s 的速度通過固相濾膜萃取柱，將流出液全部收集，在40 ℃下氮?dú)獯蹈?，? mL 甲醇復(fù)溶，上機(jī)檢測(cè)。

1.4.3 液相色譜-質(zhì)譜條件 液相條件：流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）和0.1%甲酸乙腈溶液（B）；梯度洗脫條件：初始5%B；0～3 min，5%～20%B；3～6 min，20%～80%B；6 ～8 min，80%～100%B；8 ～9 min，100%B；9～10 min，100%～5%B；流速：0.6 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫保持30 ℃。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI），正離子掃描，多反應(yīng)離子檢測(cè)模式（MRM），噴霧電壓5.5 kV，干燥溫度500 ℃，源內(nèi)碰撞誘導(dǎo)解離氣為氮?dú)?，氣簾?5 psi，GS1 為40 psi，GS2 為50 psi。

2 結(jié)果與分析

2.1 固相濾膜萃取優(yōu)化

傳統(tǒng)的固相萃取和過膜整個(gè)試驗(yàn)步驟分為上樣、淋洗、洗脫、過膜4 個(gè)步驟，耗時(shí)長(zhǎng)，溶劑使用量大[17]。本研究將通過型PRiME 固相萃取和針頭濾膜有效結(jié)合，實(shí)現(xiàn)萃取、凈化、除雜一步到位，大大縮短了常規(guī)操作耗時(shí)由10 min 至2 min，減少實(shí)驗(yàn)人員工作量，同時(shí)減少了常規(guī)SPE 淋洗和洗脫溶劑6～10 mL，免去了用于收集洗脫液的離心管的使用。經(jīng)試驗(yàn)檢測(cè)分析，傳統(tǒng)方法的化合物回收率為92.8%～96.4%，新型固相萃取膜化合物回收率為91.3%～93.2%（表1），兩種方法對(duì)鹽酸氯苯胍和鹽酸小檗堿的回收率差異不顯著，均可滿足實(shí)驗(yàn)室分析測(cè)試需求。

表1 傳統(tǒng)固相萃取和過膜與新型固相萃取膜試驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)比Table 1 Performance comparison of traditional solid-phase extraction and membrane filtration with SPM

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

以流動(dòng)注射將質(zhì)量濃度為1 μg/mL 的鹽酸小檗堿和鹽酸氯苯胍標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行正離子模式下MS 全掃描，分別得到兩種藥物的準(zhǔn)分子離子。其中離子峰m/z 336.40 與脫水和Cl-的鹽酸小檗堿離子質(zhì)量（m/z 336.37）相符，而離子峰m/z 334.23與脫Cl-后的鹽酸氯苯胍離子質(zhì)量（m/z 334.21）相符，故確定m/z 336 和m/z 334 為鹽酸小檗堿和鹽酸氯苯胍的母離子。通過MS/MS 碰撞解離獲取其碎片信息，其中鹽酸小檗堿的主要子離子為m/z 319.8 和m/z 291.7，鹽酸氯苯胍的子離子為m/z 177.8 和m/z 137.9。使用爬坡（Ramp）調(diào)試功能優(yōu)化去簇電壓（DP）和碰撞能量（CE），使母離子和子離子組成的離子對(duì)信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到最大，并分別以最強(qiáng)和次強(qiáng)離子對(duì)作為定量和定性離子對(duì)，具體參數(shù)見表1。本試驗(yàn)離子對(duì)信息與湯菊芬等[18]所建立的HPLC-MS/MS 法相符，而錐孔電壓和碰撞能有所出入，原因可能是不同的質(zhì)譜設(shè)備在離子化和解離設(shè)計(jì)方面有所不同。

2.3 色譜條件的優(yōu)化

本研究以水、甲醇和乙腈為流動(dòng)相，其中水相中加入了甲酸來改善化合物的色譜峰型和保留行為。試驗(yàn)結(jié)果顯示，甲醇和乙腈二者的分離效果相當(dāng)，而當(dāng)以水和乙腈為流動(dòng)相時(shí)，鹽酸小檗堿和鹽酸氯苯胍的峰對(duì)稱度好，拖尾現(xiàn)象少，因此采用水和乙腈為流動(dòng)相。向水相中加入甲酸提高了目標(biāo)化合物的保留能力和響應(yīng)值。通過提高甲酸濃度觀察信號(hào)響應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，以純水為水相時(shí)鹽酸小檗堿和鹽酸氯苯胍的響應(yīng)值較低，0.1%甲酸水-乙腈作為流動(dòng)相體系時(shí)，化合物響應(yīng)值最高。進(jìn)一步逐級(jí)升高甲酸體積分?jǐn)?shù)至0.5%時(shí)，鹽酸小檗堿和鹽酸氯苯胍的信號(hào)強(qiáng)度呈逐漸降低的趨勢(shì)。甲酸的體積分?jǐn)?shù)對(duì)目標(biāo)化合物在色譜柱上的保留行為影響不大。因此，本研究以0.1%甲酸水-乙腈為流動(dòng)相，使得目標(biāo)化合物得到有效分離。優(yōu)化后的色譜條件，峰形良好、靈敏度極高，5 min 之內(nèi)，鹽酸小檗堿和鹽酸氯苯胍得到良好的分離（圖1）。

圖1 固相濾膜萃取液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定鹽酸氯苯胍和鹽酸小檗堿殘留色譜圖Fig.1 The chromatogram of berberine hydrochloride and robenidine hydrochloride acquired by SPM HPLC-MS/MS

2.4 固相萃取填料的選擇與洗脫液體積的確定

本研究選用了C18、HLB、Slica、Florisil 4 種萃取填料進(jìn)行試驗(yàn)。如圖2a 所示，鹽酸氯苯胍和鹽酸小檗堿的吸附洗脫行為相似，使用不同填料萃取下兩者回收率十分相近。然而不同填料性質(zhì)對(duì)目標(biāo)化合物的回收率影響較大，常規(guī)C18 對(duì)鹽酸氯苯胍和鹽酸小檗堿的回收率分別為65.7%和66.9%。當(dāng)使用HLB 填料時(shí)，目標(biāo)化合物的回收率均在90%以上。Silica 和Florisil 對(duì)鹽酸氯苯胍和鹽酸小檗堿的吸附洗脫影響較小，分別僅為38.9%，42.5%和33.6%，33.4%。甲醇是一種良好的萃取溶劑，不同體積的甲醇溶液對(duì)于目標(biāo)物的回收率有一定程度的影響。本研究選用甲醇作為萃取液，分別選用1～5 mL 的甲醇進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果如圖2b 所示，鹽酸氯苯胍和鹽酸小檗堿的回收率隨著甲醇體積的增加而上升，當(dāng)甲醇體積在3～5 mL時(shí)，目標(biāo)物的回收率在90%以上，能取得較為滿意的提取效果，故確定3 mL 為洗脫液最佳體積量。

圖2 固相濾膜萃取填料（a）和洗脫液體積（b）對(duì)鹽酸氯苯胍和鹽酸小檗堿回收率的影響Fig.2 The effect of sorbent of SPM （a） and volume of eluting solution （b） on the recovery of berberine hydrochloride and robenidine hydrochloride

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍和檢出限、定量限

選用預(yù)檢無殘留的空白鯽魚樣品為空白基質(zhì)。分別選取質(zhì)量濃度為0.5，1，5，10，100 μg/L 的鹽酸氯苯胍和鹽酸小檗堿混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行加標(biāo)檢測(cè)試驗(yàn)。以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出線性回歸方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)（r）。分別以3倍和10 倍信噪比（S/N）確定被測(cè)物的檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。由表2可知，試驗(yàn)結(jié)果表明，鹽酸小檗堿和鹽酸氯苯胍在0.5～100 μg/L 的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r＞0.999。該方法對(duì)化合物檢出的靈敏度高，其中鹽酸小檗堿的LOD 和LOQ 分別為0.51 μg/kg 和1.67 μg/kg，鹽酸氯苯胍的LOD 和LOQ 為0.53 μg/kg和1.68 μg/kg。本研究建立的固相濾膜萃取液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法相較于常規(guī)方法在靈敏度方面有顯著提高，如劉永濤等[19]用超高效液相色譜所建立的同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中鹽酸氯苯胍及其代謝物方法的LOD 為25 μg/kg。

表2 鹽酸小檗堿和鹽酸氯苯胍線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限Table 2 The linearity range，calibration curve，LOD and LOQ of berberine hydrochloride and robenidine hydrochloride

2.6 回收率與精密度

在空白鯽魚樣品基質(zhì)中加入鹽酸氯苯胍和鹽酸小檗堿混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，制備質(zhì)量濃度分別為5，10，50 μg/kg 的加標(biāo)樣品。根據(jù)前述的處理方法和測(cè)定條件進(jìn)行精密度和回收率試驗(yàn)。每個(gè)添加水平平行測(cè)定6 次，結(jié)果如表3所示，在質(zhì)量濃度分別為5，10，50 μg/kg 的情況下，鹽酸小檗堿的日內(nèi)和日間精密度RSD 為4.09%～5.73%，鹽酸氯苯胍的日內(nèi)和日間精密度RSD 為3.84%～5.29%。3 種質(zhì)量濃度水平下，鹽酸小檗堿和鹽酸氯苯胍的回收率≥91.2%～93.2%，RSD≤5.2%。結(jié)果表明，該檢測(cè)方法結(jié)果穩(wěn)定、可靠、精密度和回收率高，可以滿足在魚肉中同時(shí)檢測(cè)鹽酸小檗堿和鹽酸氯苯胍殘留量的要求。

表3 空白鯽魚肉中鹽酸小檗堿和鹽酸氯苯胍不同質(zhì)量濃度下的日內(nèi)精密度和日間精密度Table 3 The intra-day and inter-day precisions of berberine hydrochloride and robenidine hydrochlorideat different mass concentrations in fish meat

2.7 實(shí)際樣品檢測(cè)

表4 空白鯽魚肉中鹽酸小檗堿和鹽酸氯苯胍加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 4 The standard spiked recovery and RSD of berberine hydrochloride and robenidine hydrochloride in blank fish meat sample

采用本研究方法對(duì)市售商品鯽魚、草魚、鯉魚各12 批次進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果未出現(xiàn)陽性樣品，分析原因可能：（1）鹽酸小檗堿和鹽酸氯苯胍作為抗菌抗蟲藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中使用并不十分普及；（2）目前職能部門對(duì)獸藥在養(yǎng)殖業(yè)中的使用規(guī)范監(jiān)管懲治力度較嚴(yán)，獸藥濫用情況較以前有明顯改善。后期將進(jìn)一步對(duì)不同品種和來源的水產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)，擴(kuò)大抽檢樣本量。

3 結(jié)論

將通過型PEiME 固相萃取和針式濾膜結(jié)合，實(shí)現(xiàn)魚肉樣品前處理過程中，萃取、凈化、除雜的步驟一體化，在保證鹽酸小檗堿和鹽酸氯苯胍萃取效率的前提下，極大地節(jié)約了操作時(shí)間，節(jié)省了試劑和耗材使用。結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法實(shí)現(xiàn)了魚肉中鹽酸小檗堿和鹽酸氯苯胍的高效、穩(wěn)定和可靠檢測(cè)。此方法操作步驟簡(jiǎn)單、耗時(shí)較少，可作為魚肉中鹽酸氯苯胍和鹽酸小檗堿殘留的檢測(cè)方法，為水產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)管理提供技術(shù)支撐。