趙麗娜，鞏俊明，張 娜，李 晨，5，田洪濤，2，5*，王妙姝，康紅艷，羅云波

（1 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院 河北保定 071001 2 國(guó)家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心 河北保定 071001 3 保定學(xué)院生物化工與環(huán)境工程學(xué)院 河北保定 071001 4 河北新希望天香乳業(yè)有限公司 河北保定 071001 5 河北省益生功能性乳制品技術(shù)創(chuàng)新中心 河北保定 071001 6 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院 北京 100083）

近年來(lái)，隨著乳酸菌與健康關(guān)系研究的深入，發(fā)酵食品越來(lái)越多的健康功能被揭示，發(fā)酵乳制品行業(yè)快速崛起，成為全球發(fā)展最快的高附加值行業(yè)之一[1-3]。隨之，發(fā)酵乳制品的生產(chǎn)技術(shù)受到極大關(guān)注，而發(fā)酵劑制備是其核心技術(shù)之一。傳統(tǒng)人工型液態(tài)發(fā)酵劑存在弊端，20世紀(jì)初，國(guó)外開(kāi)始研究高效直投式發(fā)酵劑，至20世紀(jì)60年代后逐漸商品化。而我國(guó)在高效直投式發(fā)酵劑方面研究起步較晚，長(zhǎng)期被國(guó)外企業(yè)壟斷，主要依賴(lài)進(jìn)口，價(jià)格異常昂貴[4-5]。高效直投式發(fā)酵劑在酸奶中應(yīng)用時(shí)普遍存在后酸化的問(wèn)題，原因是保加利亞乳桿菌是主要的產(chǎn)酸菌株，在長(zhǎng)期高溫發(fā)酵、低溫貯存的過(guò)程中，菌株繼續(xù)發(fā)酵產(chǎn)酸，進(jìn)而導(dǎo)致發(fā)酵乳制品貯藏期質(zhì)量不穩(wěn)定，保質(zhì)期縮短[6]。目前，國(guó)外研究出一些弱后酸化效果顯著的菌株，然而均受專(zhuān)利保護(hù)。目前，我國(guó)主要在工藝水平上控制酸奶后酸化，不能從根本上解決問(wèn)題。研制開(kāi)發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的弱后酸化高效直投式發(fā)酵劑，是解決酸奶后酸化問(wèn)題的關(guān)鍵。

制備弱后酸化高效直投式發(fā)酵劑的關(guān)鍵技術(shù)主要包括：弱后酸化乳酸菌株的選育、廉價(jià)增菌培養(yǎng)基的篩選、細(xì)胞增菌培養(yǎng)；菌體細(xì)胞濃縮分離；高效保護(hù)劑篩選與干燥工藝；高效直投式發(fā)酵劑的貯藏穩(wěn)定性等。本實(shí)驗(yàn)室研究人員前期對(duì)弱后酸化乳酸菌株進(jìn)行選育，并對(duì)選育的菌株進(jìn)行廉價(jià)增菌培養(yǎng)基的篩選。關(guān)于乳酸菌細(xì)胞增菌培養(yǎng)技術(shù)，考慮到乳酸菌生長(zhǎng)繁殖速度較快，采用分批式培養(yǎng)，對(duì)培養(yǎng)設(shè)備要求簡(jiǎn)單，易于控制。為獲得高濃度細(xì)胞培養(yǎng)物，采用分批補(bǔ)料式培養(yǎng)，主要有化學(xué)中和法、緩沖鹽法、膜滲析法?；瘜W(xué)中和法可獲得高密度菌體，簡(jiǎn)便易行，是目前應(yīng)用最廣泛的一種方法，然而，當(dāng)乳酸與堿液反應(yīng)產(chǎn)生乳酸氨或乳酸鈉等鹽類(lèi)物質(zhì)達(dá)到一定濃度時(shí)，也會(huì)抑制菌體生長(zhǎng)繁殖[7-8]。緩沖鹽的緩沖作用有一定范圍，發(fā)酵菌液不能達(dá)到很高的菌體濃度，高鹽濃度會(huì)對(duì)乳酸菌菌體生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用[7]。膜滲析法是目前最先進(jìn)的方法，培養(yǎng)效果最好，然而設(shè)備投資大，多次過(guò)濾耗能大，對(duì)超濾膜材料和操作要求較嚴(yán)格，同時(shí)在培養(yǎng)過(guò)程中易感染噬菌體，工業(yè)上應(yīng)用并不廣泛[4，7-9]。本實(shí)驗(yàn)室新選育的弱后酸化菌株生長(zhǎng)特性是否發(fā)生改變？ 該菌株究竟適宜采用何種培養(yǎng)方法？需要用產(chǎn)率和轉(zhuǎn)化率指標(biāo)來(lái)衡量，并通過(guò)試驗(yàn)探明。

針對(duì)以上問(wèn)題，選用選育并優(yōu)化組合的優(yōu)良弱后酸化乳酸菌菌株及廉價(jià)胡蘿卜汁復(fù)合增菌培養(yǎng)基，通過(guò)300 mL 三角瓶水平的搖瓶分批式培養(yǎng)，采用單因素和正交優(yōu)化試驗(yàn)研究培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)方式、培養(yǎng)基起始pH 值、接種量對(duì)弱后酸化菌株生長(zhǎng)的影響。通過(guò)50 L 發(fā)酵罐分批補(bǔ)料式擴(kuò)大培養(yǎng)試驗(yàn)研究調(diào)節(jié)pH 值、流加葡萄糖補(bǔ)料以及既調(diào)節(jié)pH 值又流加葡萄糖補(bǔ)料對(duì)弱后酸化菌株生長(zhǎng)的影響。通過(guò)優(yōu)化后酸化乳酸菌的增殖培養(yǎng)條件，為高效直投式發(fā)酵劑產(chǎn)業(yè)化提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌種 弱后酸化保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）Lb-s1 rp-1：本試驗(yàn)室（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院發(fā)酵工程試驗(yàn)室）前期自行選育。

1.1.2 原料 胡蘿卜，購(gòu)自本市大型超市，用于制作胡蘿卜汁復(fù)合增菌培養(yǎng)基。

1.1.3 培養(yǎng)基

1） MRS 培養(yǎng)基[10]液體用于菌種的活化，固體用于活菌計(jì)數(shù)；

2） 胡蘿卜汁復(fù)合增菌培養(yǎng)基 挑選新鮮、完好、大小適中的胡蘿卜→洗凈→切片（厚度2 mm）→煮沸 （料∶水＝1∶1，100 ℃，10 min）→打漿（10 min）→過(guò)慮（100 目濾布，2 遍）→磨漿（膠體磨，10 min）→添加促生長(zhǎng)物質(zhì)（0.3%大豆蛋白胨、1.0%蛋白胨、0.5%酵母膏、0.5%碳酸鈣）→調(diào)糖度 （2～3 Bix°）→調(diào)pH 值→滅菌（115 ℃，20 min）→冷卻至37 ℃?zhèn)溆?，用于搖瓶分批式培養(yǎng)試驗(yàn)和發(fā)酵罐分批補(bǔ)料式擴(kuò)大培養(yǎng)試驗(yàn)。

1.1.4 主要儀器設(shè)備 YXQ-LS-18SI/22L 手提式濕熱滅菌鍋，上海東亞壓力容器公司；SHP-250 型生化培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；JM-80F 型膠體磨，江蘇丹徒縣紀(jì)中電器五金廠；FOM-Z150-2 打漿機(jī)，鎮(zhèn)江市丹徒區(qū)紀(jì)中電器廠；STARTER 2100 實(shí)驗(yàn)室pH 計(jì)，奧豪斯（OHAUS）儀器（上海）有限公司；50 L 全自動(dòng)發(fā)酵罐，上海迪比爾生物工程有限公司；阿貝折光儀，上海歡奧科技有限公司；78-1 磁力加熱攪拌器，金壇市杰瑞爾電器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)室搖瓶分批式培養(yǎng)試驗(yàn) 首先通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)研究培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)方式、培養(yǎng)基起始pH 值、接種量對(duì)實(shí)驗(yàn)室搖瓶分批式培養(yǎng)菌種增菌的影響，然后對(duì)有交互作用的因素條件進(jìn)行正交優(yōu)化，最后在正交優(yōu)化試驗(yàn)得到的最佳工藝條件下培養(yǎng)菌種進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

1） 培養(yǎng)溫度對(duì)菌種增菌的影響 弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1 經(jīng)MRS 液體培養(yǎng)基活化后，以體積分?jǐn)?shù)0.6%（約3×106CFU/mL）接入滅菌的300 mL 三角瓶（裝液量200 mL）、pH 值為6.5～7.0 的胡蘿卜汁復(fù)合增菌培養(yǎng)基中，分別置于32，37，42 ℃恒溫、靜置培養(yǎng)12 h，定時(shí)取樣檢測(cè)活菌數(shù)，繪制生長(zhǎng)曲線。

2） 培養(yǎng)方式對(duì)菌種增菌的影響 菌株活化后，以體積分?jǐn)?shù)0.6%（約3×106CFU/mL）接種量分別接入滅菌的300 mL 三角瓶（裝液量200 mL）和滅菌的250 mL 厭氧瓶 （即輸液瓶，裝液量200 mL，裝液過(guò)程中通過(guò)Hungate 厭氧系統(tǒng)充氮除氧）、pH 值為6.5～7.0 的胡蘿卜汁復(fù)合增菌培養(yǎng)基中，于37 ℃分別進(jìn)行轉(zhuǎn)速80 r/min 搖床培養(yǎng)（三角瓶）、靜置培養(yǎng)（三角瓶）、厭氧培養(yǎng)（厭氧瓶）8 h，檢測(cè)活菌數(shù)。

3） 培養(yǎng)基起始pH 值對(duì)菌種增菌的影響 用2 mol/L Na2CO3溶液經(jīng)磁力攪拌器將胡蘿卜汁復(fù)合增菌培養(yǎng)基pH 值分別調(diào)至5.5，6.0，6.5，7.0，7.5 梯度系列，分裝300 mL 三角瓶（裝液量均為200 mL），115 ℃滅菌20 min 冷卻備用。菌株活化后，每株菌以體積分?jǐn)?shù)0.6%（約3×106CFU/mL）接種量分別接入不同pH 值的三角瓶胡蘿卜汁復(fù)合增菌培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)8 h，檢測(cè)活菌數(shù)。

4） 接種量對(duì)菌種增菌的影響 菌株活化后，分別以體積分?jǐn)?shù)0.4%，0.6%，0.8%，1.0%，1.2%接入滅菌的300 mL 三角瓶（裝液量200 mL）、pH 值為6.5 的胡蘿卜汁復(fù)合增菌培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)12 h，定時(shí)取樣檢測(cè)活菌數(shù)，繪制生長(zhǎng)曲線。

5） 菌株搖瓶增菌工藝正交優(yōu)化試驗(yàn) 考慮增菌因素之間存在交互協(xié)同作用，在單因素實(shí)驗(yàn)中選擇培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基起始pH 值、接種量為主要因素，利用L9（33）正交試驗(yàn)優(yōu)化弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1 菌株的搖瓶增菌工藝條件，因素水平見(jiàn)表1。

表1 Lb-s1 rp-1 搖瓶增菌工藝正交優(yōu)化試驗(yàn)中各因素水平表Table 1 Factor level table of Lb-s1 rp-1 in orthogonal optimization experiment of shake flask enrichment process

6） 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)菌株搖瓶增菌工藝正交優(yōu)化試驗(yàn)得到的最佳增菌工藝條件培養(yǎng)弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1，對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.2 50 L 發(fā)酵罐分批補(bǔ)料式擴(kuò)大培養(yǎng)試驗(yàn) 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室搖瓶分批式培養(yǎng)試驗(yàn)得到的最佳增菌工藝，利用胡蘿卜汁復(fù)合增菌培養(yǎng)基對(duì)弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1 進(jìn)行50 L （30 L 培養(yǎng)基）全自動(dòng)發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)試驗(yàn)，以分批式擴(kuò)大培養(yǎng)為對(duì)照，設(shè)置3 種補(bǔ)料方式：①用2 mol/L 的Na2CO3溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基恒定pH 值為5.5；②在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期6 h 時(shí)補(bǔ)加1.5 mol/L 葡萄糖溶液使發(fā)酵罐中葡糖糖質(zhì)量濃度保持20 g/L；③既用2 mol/L 的Na2CO3溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基恒定pH 值為5.5，又在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期6 h 時(shí)補(bǔ)加1.5 mol/L 葡萄糖溶液。定時(shí)取樣檢測(cè)活菌數(shù)，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 乳酸菌活菌計(jì)數(shù) 參照GB 4789.35-2016平板計(jì)數(shù)法[11]，每個(gè)試驗(yàn)均重復(fù)3 次。

1.3.2 pH 值的測(cè)定 采用OHAUS Starter 2100 pH 計(jì)直接測(cè)定，每個(gè)試驗(yàn)均重復(fù)3 次。

1.4 試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 17.0 進(jìn)行方差分析及多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)室搖瓶分批式培養(yǎng)試驗(yàn)

2.1.1 培養(yǎng)溫度對(duì)菌種增菌的影響 溫度是影響微生物生長(zhǎng)繁殖的重要因素之一，通過(guò)影響蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能以及細(xì)胞結(jié)構(gòu)來(lái)影響微生物的生長(zhǎng)、繁殖和新陳代謝，不同微生物最適生長(zhǎng)溫度隨著培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件和菌體生長(zhǎng)階段變化而改變[9，12]。根據(jù)1.2.1（1）節(jié)的試驗(yàn)方法，探究不同培養(yǎng)溫度對(duì)弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1 生長(zhǎng)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 Lb-s1 rp-1 在胡蘿卜汁復(fù)合增菌培養(yǎng)基中不同溫度培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of Lb-s1 rp-1 in carrot juice complex enrichment medium at different temperatures

圖1可知，菌株在胡蘿卜汁復(fù)合增菌培養(yǎng)基中，分別于32，37，42 ℃恒溫靜置培養(yǎng)，到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期或穩(wěn)定初期的培養(yǎng)時(shí)間分別為9，7，5 h，穩(wěn)定期活菌數(shù)分別為1.33×109，9.98×109，4.89×109CFU/mL，37 ℃培養(yǎng)的活菌數(shù)顯著高于32 ℃和42 ℃培養(yǎng)（P<0.05）。原因是在一定范圍內(nèi)，當(dāng)溫度升高時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的酶催化和化學(xué)反應(yīng)速率都會(huì)加快，菌體生長(zhǎng)也會(huì)加快，同時(shí)營(yíng)養(yǎng)物和代謝物的溶解度提高，細(xì)胞膜流動(dòng)性增大，有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝產(chǎn)物的排除。然而，當(dāng)超過(guò)一定溫度后繼續(xù)升溫，會(huì)使蛋白質(zhì)和核酸等受到不可逆的損害，從而抑制菌體生長(zhǎng)代謝，甚至導(dǎo)致死亡[13]。確定培養(yǎng)溫度37 ℃作為下一步正交優(yōu)化試驗(yàn)的主要因素與基準(zhǔn)水平。

2.1.2 培養(yǎng)方式對(duì)菌種增菌的影響 供氧情況影響培養(yǎng)基的氧化還原電位值，可使乳酸菌的代謝途徑發(fā)生改變，這對(duì)菌種的生長(zhǎng)尤為重要[12]。因此，根據(jù)1.2.1（2）節(jié)的試驗(yàn)方法，采用不同的培養(yǎng)方式研究對(duì)弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1生長(zhǎng)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2可知，菌株在胡蘿卜汁復(fù)合增菌培養(yǎng)基中，37 ℃分別進(jìn)行搖床培養(yǎng)（轉(zhuǎn)速為80 r/min）、靜置培養(yǎng)、厭氧培養(yǎng)8 h 后，活菌數(shù)分別為2.02×1010，1.93×1010，3.23×107CFU/mL，靜置培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)的活菌數(shù)極顯著高于搖床培養(yǎng) （P＜0.01），而且靜置培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)的活菌數(shù)差異不顯著（P＞0.05）。結(jié)果表明，培養(yǎng)方式對(duì)弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1 的生長(zhǎng)影響很大，靜置培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)優(yōu)于搖床好氧培養(yǎng)。

圖2 Lb-s1 rp-1 在不同培養(yǎng)方式下穩(wěn)定期的活菌數(shù)Fig.2 Number of Lb-s1 rp-1 viable bacteria in the stationary phase of different culture methods

本研究結(jié)果與古元懿[8]、蔡毅等[14]研究結(jié)果相符，這主要是由于保加利亞乳桿菌基因組中缺少超氧化物歧化酶，導(dǎo)致其在有氧條件下的生長(zhǎng)較差，只有在發(fā)酵培養(yǎng)基中的氧含量較低的情況下，才能快速生長(zhǎng)[15]。根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果，為簡(jiǎn)化工藝操作，節(jié)省能源，降低生產(chǎn)成本，減少設(shè)備投資，確定弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1 采用靜置培養(yǎng)方式。

2.1.3 培養(yǎng)基起始pH 值對(duì)菌種增菌的影響 培養(yǎng)基起始pH 值也是影響菌株活菌數(shù)量的關(guān)鍵因素之一，合適的起始pH 值能縮短菌株生長(zhǎng)的延滯期，較快的進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，不同菌株的最適生長(zhǎng)pH 值范圍也不同[16]。因此，根據(jù)1.2.1（3）節(jié)的試驗(yàn)方法，研究培養(yǎng)基不同起始pH 值對(duì)弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1 生長(zhǎng)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 Lb-s1 rp-1 在不同起始pH 值培養(yǎng)基中穩(wěn)定期的活菌數(shù)Fig.3 Number of Lb-s1 rp-1 viable bacteria in stationary phase at different initial pH media

圖3可知，菌株在起始pH 值為5.5，6.0，6.5，7.0，7.5 的胡蘿卜汁復(fù)合增菌培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)8 h 后，活菌數(shù)分別為9.17×109，1.18×1010，2.12×1010，1.86×1010，1.14×1010CFU/mL，在起始pH值為5.5～7.5 的范圍內(nèi)，活菌數(shù)隨著pH 值的增大先升高后降低，pH 值為6.5 時(shí)，活菌數(shù)最高，顯著高于其它起始pH 值（P＜0.05）。可能由于pH 值從多方面影響著微生物的生命活動(dòng)，不僅影響胞內(nèi)、外酶的生物活性，還影響微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，以及改變培養(yǎng)基中化合物離子化程度，從而促進(jìn)或抑制菌株的生長(zhǎng)繁殖。因此，確定培養(yǎng)基起始pH 值為6.5 作為下一步正交優(yōu)化試驗(yàn)的主要因素與基準(zhǔn)水平。

2.1.4 接種量對(duì)菌種增菌的影響 不同的接種量對(duì)菌體活性影響不同，從而影響菌體適應(yīng)能力和生長(zhǎng)速率[13]。因此，根據(jù)1.2.1（4）節(jié)的試驗(yàn)方法，研究不同接種量對(duì)弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1 生長(zhǎng)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可知，菌株分別以0.4%，0.6%，0.8%，1.0%，1.2%的接種量在胡蘿卜汁復(fù)合增菌培養(yǎng)基中37 ℃靜置培養(yǎng)，通過(guò)檢測(cè)活菌數(shù)，到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期的培養(yǎng)時(shí)間分別為10，9，7，6，5 h；穩(wěn)定期活菌數(shù)分別達(dá)到2.09×1010，2.13×1010，2.18×1010，2.28×1010，2.20×1010CFU/mL。結(jié)果表明，接種量對(duì)菌種到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期的時(shí)間有顯著影響（P＜0.05），對(duì)穩(wěn)定期的活菌數(shù)無(wú)顯著影響（P＞0.05）。接種量較低會(huì)延長(zhǎng)菌體的延滯期，接種量較高菌體會(huì)較快進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，進(jìn)而較快進(jìn)入菌體穩(wěn)定期，在穩(wěn)定期菌體容易發(fā)生自溶現(xiàn)象[16]。因此，選擇1.0%的接種量作為下一步正交優(yōu)化試驗(yàn)的主要因素與基準(zhǔn)水平。

圖4 Lb-s1 rp-1 在胡蘿卜汁復(fù)合增菌培養(yǎng)基中不同接菌量培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線Fig.4 Growth curve of Lb-s1 rp-1 in carrot juice complex enriched medium with different inoculation amount

2.1.5 菌株搖瓶增菌工藝正交優(yōu)化試驗(yàn) 根據(jù)1.2.1（5）節(jié)的試驗(yàn)方法進(jìn)行弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1 搖瓶增菌工藝正交優(yōu)化試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 Lb-s1 rp-1 搖瓶增菌工藝正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal optimization test results of Lb-s1 rp-1 in shake flask enrichment process

表2表明，三因素對(duì)菌株的影響順序?yàn)椋号囵B(yǎng)溫度（A）＞接菌量（C）＞起始pH 值（B），通過(guò)對(duì)活菌數(shù)極差分析得到菌株的最佳增菌培養(yǎng)條件為：A2B2C3，即培養(yǎng)溫度37 ℃、起始pH 值6.5、接菌量1.0%。

2.1.6 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)1.2.1（6）節(jié)的試驗(yàn)方法對(duì)弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1 搖瓶增菌工藝條件正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖5。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果[17]：未經(jīng)過(guò)弱后酸化選育的保加利亞乳桿菌Lb-s1 在番茄復(fù)合汁增菌培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h，活菌數(shù)達(dá)到2.25×1010CFU/mL。與本研究結(jié)果圖5所示：保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1 在最佳增菌培養(yǎng)條件下，6 h 到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期，穩(wěn)定期活菌數(shù)為2.28×1010CFU/mL。對(duì)比表明：經(jīng)過(guò)弱后酸化選育后，穩(wěn)定期活菌數(shù)無(wú)顯著性差異（P＞0.05），到達(dá)對(duì)數(shù)末期的時(shí)間極顯著縮短（P＜0.01）。

圖5 Lb-s1 rp-1 在最佳增菌培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)曲線Fig.5 Growth curve of Lb-s1 rp-1 under optimal culture conditions

進(jìn)一步證明保加利亞乳桿菌Lb-s1 經(jīng)過(guò)弱后酸化選育之后，其細(xì)胞生長(zhǎng)特性大大提高，細(xì)胞生長(zhǎng)量未發(fā)生顯著改變。因此，優(yōu)化的搖瓶分批式培養(yǎng)工藝是可行的，可為下一步研究50 L 全自動(dòng)發(fā)酵罐分批補(bǔ)料式擴(kuò)大培養(yǎng)工藝奠定基礎(chǔ)。

綜上所述，弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1 實(shí)驗(yàn)室搖瓶分批式培養(yǎng)最佳增菌工藝條件為：培養(yǎng)溫度37 ℃、培養(yǎng)基起始pH 值6.5、接菌量1.0%、靜置培養(yǎng)，在此工藝條件下培養(yǎng)該菌株，6 h到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期，穩(wěn)定期活菌數(shù)為2.28×1010CFU/mL。

2.2 50 L 發(fā)酵罐分批補(bǔ)料式擴(kuò)大培養(yǎng)試驗(yàn)

根據(jù)1.2.2 節(jié)的試驗(yàn)方法對(duì)弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1 進(jìn)行50 L 發(fā)酵罐分批補(bǔ)料式擴(kuò)大培養(yǎng)優(yōu)選試驗(yàn)，結(jié)果如圖6所示。

圖6可知，按照搖瓶分批式培養(yǎng)試驗(yàn)得到的最佳增菌工藝將弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1 在50 L 發(fā)酵罐中分批式擴(kuò)大培養(yǎng)，6 h 到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期，活菌數(shù)為2.35×1010CFU/mL。通過(guò)3 種補(bǔ)料方式，即調(diào)節(jié)pH 值、補(bǔ)料、調(diào)節(jié)pH 值與補(bǔ)料，到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期的時(shí)間分別是8，6，8 h，穩(wěn)定期活菌數(shù)分別是2.29×1010，2.39×1010，2.48×1010CFU/mL。表明：調(diào)節(jié)pH 值可以顯著延長(zhǎng)該菌株對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（P＜0.05），補(bǔ)料對(duì)該菌略有增菌作用，然而，經(jīng)過(guò)生物統(tǒng)計(jì)分析，3 種補(bǔ)料方式對(duì)菌株穩(wěn)定期活菌數(shù)均無(wú)顯著影響（P＞0.05）。原因可能是該菌株6 h 即可到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期，屬于生長(zhǎng)較快的微生物，培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也快速被消耗掉，單純補(bǔ)充葡萄糖單一碳源，無(wú)法滿足菌株繼續(xù)快速生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)需求。因此，綜合考慮菌株培養(yǎng)成本、設(shè)備要求、操作簡(jiǎn)便程度以及產(chǎn)率，采用50 L 發(fā)酵罐分批式擴(kuò)大培養(yǎng)弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1 的工藝是可行的，同時(shí)也為下一步產(chǎn)業(yè)化菌體培養(yǎng)工藝提供了依據(jù)。

圖6 Lb-s1 rp-1 在50 L 發(fā)酵罐中不同方式下生長(zhǎng)曲線Fig.6 Growth curve of Lb-s1 rp-1 under different methods in 50 L fermenter

3 討論與結(jié)論

目前國(guó)內(nèi)外弱后酸化保加利亞乳桿菌的選育技術(shù)主要有誘變育種、原生質(zhì)體融合、基因工程技術(shù)。傳統(tǒng)的誘變育種雖然存在工作量大、耗時(shí)長(zhǎng)等問(wèn)題，然而選育的弱后酸化菌株安全性有保證，而且沒(méi)有原生質(zhì)體融合技術(shù)的弊端[18]。本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)硫酸新霉素誘變育種法篩選得到弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1，該菌株傳至第8 代仍具有弱后酸化性能，具有遺傳穩(wěn)定性。培養(yǎng)基為乳酸菌提供菌體生長(zhǎng)、繁殖、代謝所需要的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽和生長(zhǎng)因子，試驗(yàn)室所用的MRS 培養(yǎng)基成本較高，成分較多，配制繁瑣，并不適用于工業(yè)生產(chǎn)，篩選廉價(jià)增殖培養(yǎng)基是降低成本的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)室從2000年初就開(kāi)始了對(duì)乳酸菌廉價(jià)增殖培養(yǎng)基的研究，已經(jīng)針對(duì)不同菌株研制出菊芋汁[19]、番茄汁[17]、麥芽汁[20]、冬瓜汁[21]等復(fù)合增菌培養(yǎng)基，目前，本實(shí)驗(yàn)室的這項(xiàng)技術(shù)已非常成熟。然而，國(guó)內(nèi)還沒(méi)有關(guān)于弱后酸化保加利亞乳桿菌廉價(jià)增殖培養(yǎng)基的研究報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)室對(duì)弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1 進(jìn)行了的廉價(jià)增菌培養(yǎng)基的篩選工作，得出胡蘿卜汁復(fù)合增菌培養(yǎng)基為最佳增殖培養(yǎng)基。

龐啟亮等[22]研究的可以延緩后酸化的保加利亞乳桿菌H+-ATPase 缺陷型菌株在篩選的最適宜增殖培養(yǎng)基上，活菌數(shù)為1.44×109CFU/mL；姜慶玲等[23]對(duì)德氏乳桿菌保加利亞亞種的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，經(jīng)優(yōu)化后活菌數(shù)達(dá)6.07×109CFU/mL；程艷宇等[24]研究得出保加利亞乳桿菌LB在增殖培養(yǎng)基中，活菌數(shù)可達(dá)1.09×109CFU/mL。本研究得出弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1實(shí)驗(yàn)室搖瓶分批式培養(yǎng)，最高活菌數(shù)達(dá)2.28×1010CFU/mL，遠(yuǎn)高于現(xiàn)有報(bào)道結(jié)果。與弱后酸化選育前相比，菌株穩(wěn)定期活菌數(shù)無(wú)顯著差異（P＞0.05），說(shuō)明保加利亞乳桿菌Lb-s1 經(jīng)過(guò)弱后酸化選育之后，細(xì)胞生長(zhǎng)量未發(fā)生顯著改變，因此，本文優(yōu)化的搖瓶分批式培養(yǎng)工藝是可行的，可為下一步研究50 L 全自動(dòng)發(fā)酵罐分批補(bǔ)料式擴(kuò)大培養(yǎng)工藝奠定基礎(chǔ)。

由于搖瓶培養(yǎng)與發(fā)酵罐培養(yǎng)的環(huán)境條件有很大不同，因此不能直接使用搖瓶培養(yǎng)工藝進(jìn)行發(fā)酵罐培養(yǎng)，需要在搖瓶培養(yǎng)工藝的基礎(chǔ)上進(jìn)一步考察適宜發(fā)酵罐培養(yǎng)的條件?？垫嫉萚25]研究得出保加利亞乳桿菌在5 L 發(fā)酵罐中擴(kuò)大培養(yǎng)的活菌數(shù)最大達(dá)到5.5×108CFU/mL；劉洋[26]對(duì)保加利亞乳桿菌進(jìn)行1 L 的放大培養(yǎng)試驗(yàn)，結(jié)果顯示，活菌數(shù)最高可達(dá)1.8×109CFU/mL；李佳[27]在5 L 全自動(dòng)發(fā)酵罐中對(duì)保加利亞乳桿菌LB5 的高密度培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后活菌數(shù)達(dá)到2.7×109CFU/mL；本研究對(duì)弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1在50 L 發(fā)酵罐分批補(bǔ)料式擴(kuò)大培養(yǎng)試驗(yàn)中，得到的活菌數(shù)達(dá)1010CFU/mL，遠(yuǎn)高于已報(bào)道的研究結(jié)果。綜合考慮菌株培養(yǎng)成本、設(shè)備要求、操作簡(jiǎn)便程度以及產(chǎn)率，采用50 L 發(fā)酵罐分批式擴(kuò)大培養(yǎng)弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1 的工藝是可行的，可為弱后酸化保加利亞乳桿菌高效直投式發(fā)酵劑產(chǎn)業(yè)化提供菌體增殖培養(yǎng)技術(shù)。

綜上所述，本文對(duì)自行選育的弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1 在優(yōu)化的胡蘿卜汁復(fù)合增菌培養(yǎng)基上，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室搖瓶分批式培養(yǎng)優(yōu)選試驗(yàn)、50 L 發(fā)酵罐分批補(bǔ)料式擴(kuò)大培養(yǎng)優(yōu)選試驗(yàn)，在最佳的培養(yǎng)方式下得到較高的活菌數(shù)，為工業(yè)化生產(chǎn)弱后酸化保加利亞乳桿菌高效直投式酸奶發(fā)酵劑中提供細(xì)胞廉價(jià)增殖培養(yǎng)技術(shù)，也為研究其它弱后酸化益生乳酸菌的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)提供參考借鑒。