白路平，喬向宇，海 勒，其布勒，吉日木圖，2，明 亮，2*

（1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 呼和浩特010018 2 內(nèi)蒙古駱駝研究院 內(nèi)蒙古阿拉善 750306）

駱駝乳是營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高的飲品，因富含維生素、礦物質(zhì)、微量元素，低過敏原以及耐貯藏等特性，而受到人們的喜愛。駱駝乳還富含乳鐵蛋白、溶菌酶、免疫球蛋白等，具有抗微生物的作用[1]。近年來，有文獻(xiàn)報(bào)道，與其它乳類相比，駱駝乳中的微生物含量最高，達(dá)到105CFU/mL[2]，并且其具有改善腸道內(nèi)微生物平衡，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收的作用[3]。XU 等[4]研究發(fā)現(xiàn)蒙古國(guó)駱駝乳中分離出的副干酪乳桿菌亞種具有成為益生菌的潛力，推測(cè)該菌可作為肝損傷抑制劑，用于基于代謝異常和炎癥應(yīng)答的肝病干預(yù)，說明駱駝乳可作為調(diào)節(jié)腸道菌群的功能性乳制品。

酒精性肝?。ˋlcoholic liver disease，ALD）是全世界較常見的可預(yù)防疾病之一，每年診斷為ALD 患者有上百萬人，并且全球死亡人數(shù)中約6%是由ALD 引起的[5]。戒酒是ALD 患者的首要治療措施，可防止ALD 患者發(fā)生進(jìn)一步的病變[6]。有研究表明，長(zhǎng)期大量飲酒會(huì)造成腸道屏障功能障礙[7]，增加腸道通透性，使微生物產(chǎn)物脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）易位到血液和肝臟中[8]，引發(fā)炎癥反應(yīng)，并與乙醇誘導(dǎo)的肝毒性產(chǎn)生協(xié)同作用，從而導(dǎo)致脂肪變性，造成ALD[9]。Ming 等[10]研究表明駱駝乳通過調(diào)節(jié)ALD 小鼠腸道菌群來減輕肝臟炎癥應(yīng)答，發(fā)揮其保肝作用。以上研究表明，腸道菌群與ALD 發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，通過靶向腸道菌群的治療可能對(duì)ALD 有效。表征ALD共生微生物組的結(jié)構(gòu)，鑒定飲酒后產(chǎn)生的微生物組的變化，以及探討駱駝乳對(duì)ALD 微生物多樣性及物種結(jié)構(gòu)的影響具有重大意義。

本實(shí)驗(yàn)以駱駝乳為原料，使用NIAAA 模型誘發(fā)慢性ALD 小鼠為研究對(duì)象，研究駱駝乳對(duì)慢性酒精性肝損傷小鼠腸道菌群多樣性及其結(jié)構(gòu)的影響，以期為駱駝乳益生菌的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與材料、試劑

SPF 級(jí)雄性C57BL/6NCr 小鼠，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK （京）2016-0006。飼養(yǎng)于IVC 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)內(nèi)，室溫20～25 ℃，相對(duì)濕度50%～60%，晝夜交替周期為12 h。

駱駝乳，采自內(nèi)蒙古自治區(qū)巴彥淖爾市牧區(qū)；Lieber-DeCarli（Lieber-DeCarli，LDC）液體飼料，南通特洛菲飼料科技有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：蘇飼證（2014）06092。

小鼠脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）ELISA試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司；無水CH3CH2OH（GR），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；E.Z.N.A.?Soil DNA 抽提試劑盒，美國(guó)Omega Bio-Tek 公司；MiSeq 測(cè)序試劑盒，美國(guó)Illumina 公司；FastPfu Polymerase AxyPrep DNA Gel Extraction試劑盒，美國(guó)Axygen 公司；建庫試劑盒，美國(guó)Bio Scientific 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

真空冷凍干燥機(jī)（2014-18Ab），上海東Omega Bio-Tek 富龍科技股份有限公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（5810R），美國(guó)Eppendorf 公司；多功能微孔板檢測(cè)儀（Synergy H1），美國(guó)BioTek 公司；Richter喂養(yǎng)管，南通特洛菲飼料科技有限公司；醫(yī)用低溫保存箱（DW-88L388J），青島海爾特種電器有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9030A）、電熱恒溫水槽（DK-8AXX），上海一恒科學(xué)儀器有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器（SQ510C），上海申安醫(yī)療器械廠；潔凈工作臺(tái)（SW-CJ-2FD），北京東聯(lián)哈爾儀器制造廠；超微量分光光度計(jì)（NanoDrop2000），美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；電泳儀（DYY-6C），北京市六一儀器廠；PCR 儀 （ABI GeneAmpR9700），美國(guó)ABI 公司；測(cè)序儀（Illumina Miseq），美國(guó)Illumina 公司。

1.3 方法

1.3.1 分組與取樣

1） 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 小鼠適應(yīng)性飼喂1 周后，將24 只小鼠隨機(jī)分為4 組，對(duì)照組（Con，n=6）、模型組（Et，n=6）、駱駝乳劑量組（EtCM，n=6）和牛乳劑量組（EtNM，n=6）。每組所飼喂飼料和實(shí)驗(yàn)處理如表1所示。分組后單籠飼養(yǎng)，專用Richter 喂養(yǎng)管給食，飼喂量30 mL/只·d。開始實(shí)驗(yàn)后，除液體飼料外，不再單獨(dú)給水。實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行8 周，前4 周僅飼喂專用飼料，不進(jìn)行灌胃操作；后4 周飼喂方式不變，灌胃給乳或生理鹽水，每日灌胃1 次，灌胃體積0.3 mL。

2） 造模 參考Bertola 等[11]的研究方法，建立NIAAA 模型（圖1）。第1 周采用過渡飼喂法[12]，第2～9 周開始，造模組連續(xù)接受8 周的4%LDC 酒精液體飼料飼喂，對(duì)照組喂等熱量LDC 對(duì)照液體飼料。造模組在結(jié)束液體飼料飼喂后的第2 天，按照5 g/kg 劑量一次性灌胃體積分?jǐn)?shù)31.5%的酒精溶液，對(duì)照組灌胃等熱量的麥芽糖糊精溶液。

圖1 NIAAA 造模圖Fig.1 NIAAA modeling diagram

造模結(jié)束后，異氟烷麻醉小鼠，眼眶采血，頸椎脫臼法處死小鼠，并在無菌操作臺(tái)上收集小鼠結(jié)腸部糞便，保存于滅菌后的EP 管中，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱。樣本分組情況如表2所示。

表2 小鼠結(jié)腸糞便樣本信息Table 2 Mice colon stool sample information

1.3.2 血清指標(biāo)檢測(cè) 血液常溫下靜置4 h 后，低溫離心（4 ℃，3 000 r/min，25 min）分離血清，按照ELISA 試劑盒說明書的方法檢測(cè)血清中LPS的含量（EU/L）。

1.3.3 小鼠腸道菌群分析

1.3.3.1 小鼠微生物群落多樣性測(cè)序?qū)嶒?yàn)過程將小鼠糞便從-80 ℃冰箱取出后，快速放入干冰內(nèi)送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測(cè)序。實(shí)驗(yàn)過程如下：

1） E.Z.N.A.?Soil DNA 抽提試劑盒隨機(jī)提取部分小鼠糞便中的DNA，以338F（5′-ACTCC TACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GCAC TACHVGGGTWTCTAAT-3′）為引物，進(jìn)行PCR 預(yù)實(shí)驗(yàn)，擴(kuò)增16S rRNA 基因的V3-V4 區(qū)域。并用NanoDrop2000 超微量分光光度計(jì)和2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物的質(zhì)量和濃度以及完整性。擴(kuò)增出濃度合適的產(chǎn)物后，進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。

2） PCR 正式實(shí)驗(yàn)采用TransGen AP221-02：TransStart FastPfu DNA Polymerase，20 μL 反應(yīng)體系：4 μL 的5×FastPfu Buffer，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，上、下引物各0.8 μL，0.4 μL FastPfu Polymerase，0.2 μL BSA，10 μL Template DNA，最后加ddH2O 至20 μL。PCR 反應(yīng)參數(shù)如表3所示。

表3 PCR 反應(yīng)參數(shù)Table 3 PCR reaction parameters

3） 按照1.3.3.1（1）節(jié)的方法檢測(cè)PCR 產(chǎn)物的質(zhì)量和濃度及完整性，并用FastPfu Polymerase AxyPrep DNA Gel Extraction 試劑盒回收PCR 產(chǎn)物。用酶標(biāo)儀檢測(cè) PCR 產(chǎn)物定量。用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq 試劑盒構(gòu)建MiSeq PE 文庫。最后用Illumina Miseq PE 300 平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3.3.2 生物學(xué)信息分析 MiSeq 測(cè)序得到的是雙端序列數(shù)據(jù)，并優(yōu)化數(shù)據(jù)。首先通過PE reads和overlap 的關(guān)系，將成對(duì)reads 拼接（merge）成一條序列，同時(shí)對(duì)reads 的質(zhì)量和merge 的效果進(jìn)行質(zhì)控過濾；其次，根據(jù)序列首尾兩端的barcode 和引物序列區(qū)分樣品，最后得到優(yōu)化序列?；趦?yōu)化序列進(jìn)行OTU 聚類之后與Silva 16S rRNA 數(shù)據(jù)庫（v132）進(jìn)行序列對(duì)比，并采用RDP classifier 貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU 代表序列進(jìn)行物種鑒定和注釋。根據(jù)分類學(xué)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)一方面評(píng)估本次測(cè)序樣本量是否足夠，另一方面通過Alpha 多樣性統(tǒng)計(jì)各OTU 注釋結(jié)果在每個(gè)樣本中對(duì)應(yīng)的豐度信息；之后進(jìn)行Beta 多樣性分析，得到不同樣本間菌群結(jié)構(gòu)差異及各類水平上的物種結(jié)構(gòu)信息。

1.4 數(shù)據(jù)處理

Alpha 多樣性指數(shù)數(shù)據(jù)使用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)進(jìn)行分析之后，用Graphpad prism 7 軟件進(jìn)行繪圖。與正常組比較，*.P＜0.05，**.P＜001；與模型組比較，#.P＜0.05，##.P＜0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 駱駝乳對(duì)慢性酒精性肝損傷小鼠血清LPS含量的影響

由圖2所示，與Con 組相比較，Et 組小鼠血清中LPS 含量顯著升高（P＜0.01），說明酒精導(dǎo)致小鼠腸道粘膜損傷，使腸道菌群發(fā)生定量和定性改變（即小腸細(xì)菌過度生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)不良），腸道通透性增加，從而導(dǎo)致細(xì)菌LPS 易位至門脈血流[13]。與Et 組相比較，EtCM 和EtNM 組小鼠血清中LPS 的含量顯著降低（P＜0.01），其中EtCM 組小鼠血清中LPS 含量小于Con 組小鼠。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明駱駝乳可以預(yù)防酒精引起的結(jié)腸功能障礙，能夠抑制血清中LPS 的含量的升高。

圖2 駱駝乳對(duì)慢性酒精性肝損傷引起的小鼠血清中LPS 含量的影響Fig.2 Effect of camel milk on changes in LPS content in serum of mice caused with chronic alcoholic liver injury

2.2 α 多樣性分析

長(zhǎng)期大量飲酒會(huì)降低細(xì)菌多樣性。通過α 多樣性來檢查OTU 數(shù)量[14]，α 多樣性是度量單個(gè)樣本中微生物群落的豐度和均勻度的指標(biāo)[15]。本實(shí)驗(yàn) 采 用ACE 指 數(shù)、Chao 指 數(shù)、Shannon 指 數(shù)、Simpson 指數(shù)、Coverage 指數(shù)和稀釋曲線來評(píng)估單個(gè)樣本的α 多樣性。

采用對(duì)有效序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣的方法繪制稀釋曲線，以抽到的序列數(shù)與它們對(duì)應(yīng)的OTU 數(shù)目構(gòu)建稀釋曲線，并用mothur 計(jì)算不同隨機(jī)抽樣下的α 多樣性指數(shù)，利用R 語言工具制作曲線圖[16]。如圖3結(jié)果所示，在OTU 水平上，小鼠腸道菌群的多樣性指數(shù)Sobs 稀釋曲線趨于平坦（圖3a），說明本次測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，增加數(shù)據(jù)量只會(huì)產(chǎn)生少量新的OTU。并且小鼠腸道菌群的多樣性指數(shù)Shannon 稀釋曲線也趨于平坦（圖3b），說明測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣本中絕大多數(shù)的微生物多樣性信息。

圖3 基于Sobs 指數(shù)與Shannon 指數(shù)的稀釋曲線圖Fig.3 Dilution curve based on Shannon index and Sobs index

ACE 和Chao 指數(shù)反映樣本中所含微生物群落豐度。而Shannon 和Simpson 指數(shù)反映樣本中所含微生物群落豐度和均勻度兩方面評(píng)估[15]。Coverage 指數(shù)反映樣本中所含微生物群落的覆蓋度[17]。由圖4結(jié)果可知，每個(gè)樣本的Coverage 值均為0.997 以上，表明測(cè)序深度良好，覆蓋率高，可以真實(shí)反映樣本中微生物群落狀況（圖4a）。根據(jù)ACE（圖4b）和Chao（圖4c）指數(shù)結(jié)果可知，Et 組小鼠糞便微生物豐度顯著降低，而EtCM 組小鼠糞便微生物豐度顯著升高。并且根據(jù)Shannon（圖4d）和Simpson（圖4e）指數(shù)結(jié)果顯示，Et 組小鼠糞便微生物群落均勻度顯著降低，而EtCM 組小鼠糞便微生物群落均勻度呈上上升趨勢(shì)。以上結(jié)果表明，雖然EtCM 組小鼠糞便微生物群落均勻度略低，但是有更高的豐度，表現(xiàn)出比其它組較高的多樣性。

圖4 基于OTU 總數(shù)的α 多樣性指數(shù)圖Fig.4 α-Diversity indexes based on the total number of OTUs

2.3 各組在OTU 水平上的Venn 圖分析

Venn 圖可用于統(tǒng)計(jì)多組或多個(gè)樣本中所共有和獨(dú)有的物種（如OTU）數(shù)目，可以直觀展現(xiàn)不同組樣本中物種（如OTU）結(jié)構(gòu)相似性及重疊情況[18]。由圖5可知，4 組樣本中共檢驗(yàn)出1 413 個(gè)OTU。EtCM 組樣本OTU 數(shù)量最多，達(dá)到370 個(gè)，其次是Con 組，OUT 數(shù)為357 個(gè)；EtNM 組和Et 組OUT 數(shù)分別為345 個(gè)和341 個(gè)。長(zhǎng)期大量飲酒，導(dǎo)致小鼠OTU 數(shù)量有所降低，這可能由于飲酒使小鼠腸道菌群失調(diào)，影響腸道菌群結(jié)構(gòu)[14]。經(jīng)駱駝乳干預(yù)處理后，小鼠OTU 數(shù)量顯著增加，并且較Con組小鼠OTU 數(shù)量高出13 個(gè)。表明駱駝乳可以顯著提高小鼠糞便微生物群落的多樣性。該結(jié)果與α 多樣性結(jié)果相一致。從維恩圖（圖5）進(jìn)一步得出，4 組共有OTU 數(shù)為258 個(gè)，Con、Et、EtCM 和EtNM 組獨(dú)有的OTU 數(shù)分別為99，83，112，87 個(gè)，分別占各組總OTU 數(shù)的27.73%，24.34%，30.27%和25.22%。

圖5 各組微生物群落OTU 水平的Venn 圖Fig.5 Venn diagram of OTU level of microbial communities in each group

2.4 β 多樣性分析

β 多樣性是度量樣本間微生物群落結(jié)構(gòu)相似度的指標(biāo)。PCoA 分析法用來考察和區(qū)分樣本間的菌群結(jié)構(gòu)差異，是β 多樣性分析方法之一。通過β多樣性分析可以確定不同組間微生物群落是否存在差異[19]。由圖6所示，每組樣本點(diǎn)分散區(qū)域比較密集，表明組內(nèi)差異較小，微生物群落結(jié)構(gòu)相似。根據(jù)P＜0.001，表明組間差異很大，Con、Et、EtCM和EtNM 組能很好地區(qū)分開來（圖6a），說明酒精和駱駝乳以及牛乳對(duì)小鼠的微生物群落有顯著影響。而EtCM 組和EtNM 組的組間差異很小，兩組小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)上無顯著差異 （P＞0.05）（圖6b）。

圖6 小鼠腸道菌群與PCoA 分析圖Fig.6 Analysis of mouse intestinal community and PCoA

根據(jù)α 多樣性和β 多樣性分析，可以確定本次實(shí)驗(yàn)測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣本中絕大多數(shù)微生物多樣性信息；其中EtCM 組小鼠糞便微生物群落α 多樣性最高，而Et 組小鼠糞便微生物群落α 多樣性最低。

通過PCoA 分析，發(fā)現(xiàn)Con 與Et 組小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)上有顯著差異，表明酒精使小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化。經(jīng)駱駝乳和牛乳干預(yù)處理后，發(fā)現(xiàn)Et 與EtCM 組和EtNM 組小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)上有顯著差異，說明駱駝乳和牛乳能在一定程度上改變小鼠腸道菌群環(huán)境，調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)。此外，研究發(fā)現(xiàn)EtCM 組和EtNM 組小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)上無顯著差異。Morrin 等[20]研究發(fā)現(xiàn)牛乳可以直接調(diào)節(jié)腸道細(xì)胞表面，并可能改變細(xì)胞的糖基化狀態(tài)，進(jìn)而促進(jìn)不同細(xì)菌群落，如雙歧桿菌（Bifidobacterium）的黏附。Morrin 等[21]研究發(fā)現(xiàn)牛乳中的免疫球蛋白G 刺激腸道上皮細(xì)胞表面來增加雙歧桿菌對(duì)腸上皮細(xì)胞的粘附。Zhao等[22]研究發(fā)現(xiàn)新鮮的駱駝乳具有較高的細(xì)菌多樣性，并且是分離新型乳酸菌的寶貴天然資源。Ming等[10]研究表明駱駝乳通過調(diào)節(jié)ALD 小鼠腸道菌群，來減輕肝臟炎癥應(yīng)答，發(fā)揮它的保肝作用。因此駱駝乳與牛乳一樣，通過改變腸道菌群的生存環(huán)境，調(diào)節(jié)腸道菌群的豐度，來調(diào)整菌群結(jié)構(gòu)，促進(jìn)有益菌在腸道內(nèi)黏附，減少有害菌的增殖，并且防止乙醇對(duì)小鼠結(jié)腸內(nèi)微生態(tài)平衡的破壞。

2.5 物種結(jié)構(gòu)分析

2.5.1 基于門水平上的物種結(jié)構(gòu)分析 物種結(jié)構(gòu)分析采用統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析方法，可得到各樣本在各水平（域、界、門、綱、目、科、屬、種、OTU 等）上含有哪些優(yōu)勢(shì)物種，以及各優(yōu)勢(shì)物種的相對(duì)豐度[23]。本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)分析了門水平和屬水平。

探究駱駝乳和牛乳對(duì)慢性ALD 小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響。由圖7可知，在門水平上，4 組細(xì)菌種類的相對(duì)豐度，檢測(cè)到厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、脫鐵桿菌門（Deferribacteres）等為小鼠結(jié)腸腸道中相對(duì)豐度較高的菌門，其中厚壁菌門和擬桿菌門的豐度最高，兩者的相對(duì)豐度之和超過了80%。與Con 組相比，Et 組厚壁菌門豐度提高了4.97%，而擬桿菌門的豐度降低了4.30%。與Et 組相比，EtCM 組厚壁菌門豐度降低了30.96%，擬桿菌門豐度提高了27.9%。EtNM 組厚壁菌門豐度降低了20.71%，擬桿菌門豐度提高了18.70%。其中，EtCM 組有效提高了小鼠腸道菌群的豐度。

圖7 小鼠腸道菌群門水平物種結(jié)構(gòu)分析柱狀圖Fig.7 Histogram of phylum level species composition analysis of intestinal flora in mice

2.5.2 基于屬水平上的物種結(jié)構(gòu)分析 由圖8可知，在屬水平上，瘤胃菌科（Ruminococcaceae）下的未知屬Ruminococcaceae_UCG-013、副擬桿菌屬（Parabacteroides）、擬桿菌屬（Bacteroides）、阿克曼菌屬 （Akkermansia）、Muribaculaceae 科下的未知屬norank_f_Muribaculaceae 屬、柔嫩梭菌屬（Faecalibaculum）、Romboutsia 屬、毛螺旋菌科（Lachnospiraceae）下的未知屬norank_f_Lachnospiraceae等在小鼠結(jié)腸腸道中相對(duì)豐度較高的菌屬。其中瘤胃菌科下的未知屬Ruminococcaceae_UCG-013、副擬桿菌屬、擬桿菌屬、阿克曼菌屬的豐度最高。此外，由圖9可知，瘤胃菌科下的未知屬Ruminococcaceae_UCG-013 是Et 組豐度最高的優(yōu)勢(shì)菌屬，相對(duì)豐度占41%。副擬桿菌屬、擬桿菌屬和阿克曼菌屬均為EtCM 組和EtNM 組的優(yōu)勢(shì)菌屬。3 個(gè)菌屬的豐度各占10%以上，其中EtCM 組的3個(gè)菌屬豐度之和最高約為45%。而EtNM 組的3個(gè)菌屬豐度之和最高約為36%，這與門水平結(jié)果相一致。Blacher 等[23]研究發(fā)現(xiàn)，瘤胃菌會(huì)加重肌萎縮性側(cè)索硬化癥。Ponziani 等[24]還研究發(fā)現(xiàn)肝癌患者腸道菌群中瘤胃菌屬豐度增加，雙歧桿菌豐度減少。本實(shí)驗(yàn)中Et 組小鼠結(jié)腸菌群的瘤胃菌科下的未知屬Ruminococcaceae_UCG-013 豐度顯著提高，表明瘤胃菌科下的未知屬Ruminococcaceae_UCG-013 可能是加重慢性ALD 的一類菌屬。Wang 等[25]研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇處理的小鼠微生物菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化，擬桿菌、毛螺菌科下的未知屬Lachnospiraceae_NK4A136_group、Lachnoclostridium、布勞特氏菌（Blautia）、副擬桿菌屬和Ruminiclostridium_9 豐度顯著提高，并且這些菌群能調(diào)節(jié)脂肪代謝，還通過減少炎癥來改善腸屏障功能。Henning 等[26]也得到了同等結(jié)果。最新研究發(fā)現(xiàn)，羅斯伯里氏菌屬（Roseburia）、阿克曼菌屬、丙酸桿菌屬（Propionibacterium）等可以參與到未來益生菌的開發(fā)中，稱為潛在益生菌[27]?？偟膩碚f，駱駝乳和牛乳均擁有改善腸道屏障功能的優(yōu)勢(shì)菌群。而駱駝乳的優(yōu)勢(shì)菌群豐度比牛乳較高。駱駝乳的作用機(jī)制很可能是通過提高副擬桿菌屬、擬桿菌屬、阿克曼菌屬的豐度，來降低瘤胃菌科下的未知屬Ruminococcaceae_UCG-013 的豐度，達(dá)到調(diào)節(jié)小鼠結(jié)腸腸道菌群的目的。

圖8 小鼠腸道菌群屬水平物種結(jié)構(gòu)分析柱狀圖Fig.8 Histogram of the analysis of the genus level species composition of the mouse intestinal flora

圖9 樣本與物種關(guān)系圖Fig.9 Relationship between samples and species

3 結(jié)論

腸道菌群結(jié)構(gòu)主要受酒精的影響。已有文獻(xiàn)報(bào)道，長(zhǎng)期大量飲酒會(huì)增加血液酒精濃度[28]。并且降低Caco-2 腸上皮細(xì)胞中的緊密連接蛋白o(hù)ccludin 和zona-occludens-1（ZO-1）的表達(dá)，使腸道通透性增加，讓腸道菌群發(fā)生定量和定性改變，從而導(dǎo)致細(xì)菌LPS 易位到血流中并產(chǎn)生炎癥，促成ALD[29]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在慢性ALD 模型小鼠血清中細(xì)菌LPS 含量顯著升高，這與Mutlu 等[30]的臨床結(jié)果相一致。此外，研究還發(fā)現(xiàn)經(jīng)駱駝乳和牛乳干預(yù)處理后小鼠血清中LPS 含量顯著降低，其中駱駝乳效果最佳，表明駱駝乳可以預(yù)防酒精引起的結(jié)腸功能障礙，抑制血清中LPS 含量的升高。Chu 等[31]研究發(fā)現(xiàn)用益生元UG1601 治療便秘后，腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，包括厚壁菌門的減少和丁酸鹽細(xì)菌的增加，并推測(cè)這可能是減輕內(nèi)毒素血癥的主要原因。已有文獻(xiàn)報(bào)道，丙酸和丁酸鹽均被認(rèn)為是有益菌的代謝產(chǎn)物[27]；而擬桿菌門是產(chǎn)生丁酸鹽的主要菌群[32]。以上研究進(jìn)一步證明，Et 組的優(yōu)勢(shì)菌群厚壁菌門通過產(chǎn)生大量的LPS，促成ALD。而經(jīng)駱駝乳和牛乳干預(yù)處理后，擬桿菌門成為優(yōu)勢(shì)菌群，降低了厚壁菌門的豐度，從而改善了腸道微生態(tài)平衡。

在本實(shí)驗(yàn)中，通過高通量測(cè)序，觀察到駱駝乳和牛乳對(duì)ALD 小鼠腸道菌群有調(diào)節(jié)作用。其改善ALD 的主要機(jī)制是通過改變腸道菌群環(huán)境，來調(diào)節(jié)腸道菌群。其主要變化包括促進(jìn)腸道優(yōu)勢(shì)益生菌的繁殖，來抑制腸道有害菌的生長(zhǎng)。從有益菌的角度出發(fā)，在門水平上，駱駝乳和牛乳能提高擬桿菌門的豐度。在屬水平上，提高副擬桿菌屬、擬桿菌屬、阿克曼菌屬的豐度。從有害菌的角度出發(fā)，在門水平上，降低了厚壁菌門的豐度。在屬水平上，降低了瘤胃菌科下的未知屬Ruminococcaceae_UCG-013 的豐度，其中駱駝乳的有益菌豐度較牛乳高出9%，并且Et 組小鼠腸道菌群與EtCM 和EtNM 組的小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)上有顯著差異。除此之外，研究還發(fā)現(xiàn)EtCM 和EtNM 與Con 組小鼠腸道菌群有高度的相似性。由此可知，飲用駱駝乳來預(yù)防慢性ALD 有利于長(zhǎng)期維持腸道健康。特別是對(duì)患有乳糖不耐受癥的ALD 患者，飲用駱駝乳調(diào)節(jié)腸道菌群是最佳選擇。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為駱駝乳緩解慢性ALD 提供理論基礎(chǔ)，并對(duì)駱駝乳益生菌產(chǎn)品的開發(fā)具有重要意義。