邢小芳，柏 青，何飛敏，邵文璠，李春健，黃 晶，華 蕾，王永梅

(云南省第三人民醫(yī)院，云南 昆明 650011)

妊娠后女性體重會大幅增加，只要沒有超出標準范圍，一般不會造成不良影響，但如果孕婦過度肥胖，會給自身和胎兒帶來不利影響。對孕婦自身而言，過度肥胖可引起難產(chǎn)、胎兒死亡等，產(chǎn)后可誘發(fā)高血糖、高血脂、高血壓等[1-2]。對胎兒可導致發(fā)育遲緩，甚至引起新生兒神經(jīng)管缺陷，另外胎兒在長大后相較于正常人也容易發(fā)生肥胖、高血脂、高血壓等[3-4]。目前對于妊娠期肥胖的治療以鍛煉和控制飲食為主，但是多數(shù)孕婦依從性較差；部分肥胖孕婦使用辛伐他汀和二甲雙胍治療[5]，但均有不良反應，耐受性較差，因此開發(fā)安全的藥物用于妊娠期肥胖的治療勢在必行。紫檀芪是葡萄中的活性成分，其和白藜蘆醇在藥理活性上具有一定的相似性[6]，理論上有用于妊娠期肥胖治療的潛在價值。本研究通過構建妊娠期肥胖小鼠模型，探討了紫檀芪對糖脂代謝的影響及可能作用機制，以為其臨床應用提供理論依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 60只雌性和30只雄性清潔級昆明小鼠，均購于昆明醫(yī)科大學動物實驗中心，動物合格證號：SCXK(滇)K2020-0004。購買后飼養(yǎng)于云南中醫(yī)藥大學標準動物房，溫度控制為21～23 ℃，濕度60%，光照/黑暗12 h，小鼠日常給予自來水飲用和普通飼料喂養(yǎng)，造模時相應小鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)，飼料均購于昆明醫(yī)科大學動物實驗中心。動物實驗經(jīng)云南省第三人民醫(yī)院倫理委員會批準(202002)。

1.2實驗試劑 0.9%氯化鈉注射液購于貴州科倫藥業(yè)有限公司；胰島素ELISA試劑盒購于上海酶聯(lián)生物科技公司；高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)生化試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)生化試劑盒、總膽固醇(TC)生化試劑盒和三酰甘油(TG)生化試劑盒購于南京建成生物工程研究所；PVDF膜購于Millipore公司；GAPDH單克隆抗體、CD36單克隆抗體和載脂蛋白B(Aop B)單克隆抗體購于Santa Cruz公司；成纖維細胞生長因子21(FGF21)單克隆抗體購于Abcam公司；二抗購于北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3儀器設備 高精度防水電子天平(FX-200GD型，日本 AND 公司)；低溫高速離心機(Mini Spin型，德國 Eppendorf 公司)；酶標儀(MLDEL680型，美國 Bio-Rad公司)；凝膠電泳圖像分析儀(Gel Doc XR型，美國 Bio-Rad公司)；石蠟切片機(RM2235型，德國 LEICA 公司)；石蠟包埋機(TKD-BMB型，湖北康強醫(yī)療器械有限公司)；倒置/熒光/相差顯微鏡(IX73型，日本 OLYMPUS 公司)；蛋白電泳系統(tǒng)(Mini-PROTEAN Tetra Cell型，美國伯樂公司)。

1.4實驗方法 所有小鼠均給予適應性喂養(yǎng)1周，1周后隨機選取10只雌鼠作為正常組，其余50只雌鼠給予高脂飼料(83.25%基礎飼料、10%豬油、5%蔗糖、1.5%膽固醇和0.25%膽酸鈉)喂養(yǎng)2個月建立肥胖模型。2個月后，將所有小鼠按照雄性和雌性1∶2比例進行合籠交配。次日清晨將查到陰道栓的肥胖孕鼠隨機分為模型組、紫檀芪低劑量組、紫檀芪中劑量組和紫檀芪高劑量組，每組12只。受孕4 d后，每天10：00-12：00，正常組和模型組孕鼠給予生理鹽水1 mL灌胃，紫檀芪低、中、高劑量組孕鼠分別給予2.5 mg/(kg·d)、5 mg/(kg·d)、10 mg/(kg·d)紫檀芪懸混液(相應劑量的紫檀芪懸混于1 mL生理鹽水中)灌胃，均連續(xù)灌胃2周。灌胃期間正常組孕鼠給予普通飼料喂養(yǎng)，各造模孕鼠繼續(xù)給予高脂飼料喂養(yǎng)。

1.5動物取材 末次灌胃結束后，麻醉孕鼠后腹主動脈取血，然后取出肝臟，一部分置入超低溫冰箱中用于相關蛋白表達檢測，一部分置入多聚甲醛溶液中用于病理學觀察和相關蛋白免疫熒光檢測。

1.6檢測指標及方法

1.6.1血脂和血糖、胰島素 按照試劑盒提供的說明書檢測血脂4項(TC、TG、HDL-C、LDL-C)、血糖、胰島素水平，計算胰島素抵抗指數(shù)。胰島素抵抗指數(shù)=血糖×胰島素/22.5。

1.6.2組織病理學表現(xiàn) 將之前用固定液固定的組織取出，用清水洗干凈組織，把組織切成小塊，置于包埋盒中，自動脫水機脫水，二甲苯透明后石蠟包埋；切片：厚度為4 μm；展片后進行常規(guī)HE染色，置入載玻片封片即完成，之后采用熒光倒置顯微鏡收集圖像，每張切片選取5個不同的視野。

1.6.3肝臟組織中FGF21、CD36和Apo B免疫熒光染色 將組織切片后，加入二甲苯10 min，共2次；100%的乙醇10 min，共2 次；95%的乙醇10 min；75%的乙醇10 min；TBST5 min，共3次；內源性過氧化物酶阻斷液 AR1108 10 min；0.25%的胰酶10～20 min/100 ℃PBS煮10 min ；去離子水5 min，共3 次； 5% 的BSA 封閉1 min；一抗(1∶50)4 ℃過夜；次日TBST 5洗滌3次；二抗(1∶100)室溫避光孵育 2 h；TBST洗滌3次； 晾干，加入DIPI 50 μL避光封片；熒光倒置顯微鏡觀察并收集圖像，每個圖片選取5個不同的視野。

1.6.4肝臟組織中FGF21、CD36和ApoB表達情況 Western blot法檢測：采用總蛋白提取試劑盒提取總蛋白；運用BCA法對蛋白進行定量，定量后調平；行SDS-PAGE電泳，電泳時壓縮膠電壓為60 V，分析膠電壓為100 V，待電泳樣品分離至膠下緣時結束電泳；轉膜；恒定電流260 mA 轉膜 1 h；將膜放入封閉液中，室溫搖床封閉2 h；一抗孵育4 ℃過夜；二抗室溫搖床孵育1 h；用凝膠成像系統(tǒng)進行分析并采集圖像，結果采用檢測蛋白的灰度值/GAPDH的灰度值表示。

2 結 果

2.1各組血糖、胰島素和血脂水平比較 模型組孕鼠血清TG、TC、LDL-C水平及血糖、胰島素、胰島素抵抗指數(shù)均明顯高于正常組(P均<0.05)，血清HDL-C水平明顯低于正常組(P<0.05)；紫檀芪各組孕鼠血清TG、TC、LDL-C水平及血糖、胰島素、胰島素抵抗指數(shù)均明顯低于模型組(P均<0.05)，血清HDL-C水平均明顯高于模型組(P均<0.05)；紫檀芪中、高劑量組血清TG、LDL-C、血糖及紫檀芪高劑量組TC、胰島素、胰島素抵抗指數(shù)均明顯低于紫檀芪低劑量組(P均<0.05)；紫檀芪高劑量組血清HDL-C水平均明顯高于紫檀芪低、中劑量組(P均<0.05)。見表1。

表1 正常組和肥胖各組孕鼠血脂指標及血糖、胰島素、胰島素抵抗指數(shù)比較

2.2各組肝臟組織病理學表現(xiàn) 正常組孕鼠肝細胞大小均一，細胞核基本位于細胞中央，分布均勻；模型組孕鼠肝臟組織中彌漫有大量的脂肪空泡，無明顯炎癥細胞浸潤；相較于模型組，紫檀芪各組孕鼠肝臟組織脂肪空泡明顯減少，且均無炎癥細胞浸潤。見圖1。

圖1 正常組和肥胖各組孕鼠肝臟組織HE染色情況(×400)

2.3各組肝臟組織中FGF21、CD36和ApoB免疫熒光染色表現(xiàn) 細胞核染色為藍色，F(xiàn)GF21、CD36和ApoB陽性表達為綠色；與正常組比較，模型組孕鼠肝臟組織中FGF21、CD36陽性表達明顯增多，Apo B陽性表達明顯減少；與模型組比較，紫檀芪各組孕鼠肝臟組織中FGF21和CD36陽性表達均明顯減少，Apo B陽性表達均明顯增多；與紫檀芪低、中劑量組比較，紫檀芪高劑量組FGF21和CD36陽性表達更少，Apo B陽性表達更多。見圖2。

圖2 正常組和肥胖各組孕鼠肝臟組織中FGF21、CD36和Apo B免疫熒光染色情況(×200)

2.4各組肝臟組織中FGF21、CD36和ApoB表達情況 模型組孕鼠肝臟組織中FGF21和CD36相對表達量均明顯高于正常組(P均<0.05)，Apo B相對表達量明顯低于正常組(P<0.05)；紫檀芪各組孕鼠肝臟組織中FGF21和CD36相對表達量均明顯低于模型組(P均<0.05)，Apo B相對表達量均明顯高于模型組(P均<0.05)；紫檀芪中、高劑量組FGF21相對表達量均明顯低于紫檀芪低劑量組(P均<0.05)，且紫檀芪高劑量組明顯低于紫檀芪中劑量組(P<0.05)；紫檀芪高劑量組CD36相對表達量均明顯低于紫檀芪低、中劑量組(P均<0.05)，Apo B相對表達量均明顯高于紫檀芪低、中劑量組(P均<0.05)。見圖3和表2。

圖3 正常組和肥胖各組孕鼠肝臟組織中FGF21、CD36和Apo B表達情況

表2 正常組和肥胖各組孕鼠肝臟組織中FGF21、CD36和Apo B相對表達量比較

3 討 論

肥胖孕鼠造模較為復雜，理論上妊娠后給予肥胖造模更符合孕期肥胖的特點，但嚙齒類動物的孕期較短，小鼠孕期只有21 d，在這么短的時間內還沒有一種藥物可另其急劇發(fā)胖[7]。為此本實驗參考文獻報道[8],先高脂飲食建立肥胖模型，后合籠受孕，另外在整個孕期繼續(xù)給予高脂飲食喂養(yǎng)，以盡可能地保證動物模型與人孕期肥胖相似。實驗結果顯示，模型組孕鼠肝臟HE染色見大量脂肪空泡，血液學檢測存在胰島素抵抗狀態(tài)和明顯的高血脂，提示造模相對成功。

目前研究認為紫檀芪沒有毒副作用，其雖然不能降低體重，但具有降低血脂作用[9-10]。如胡向陽等[11]研究發(fā)現(xiàn)，紫檀芪能夠明顯降低高血脂癥小鼠TG和LDL-C水平，改善高血脂癥小鼠狀態(tài)。Zhang等[12]研究證實紫檀芪可以調節(jié)動脈粥樣硬化小鼠血清中血脂的含量，保護血管。本研究結果顯示，紫檀芪各組孕鼠血清TG、TC和LDL-C水平均明顯低于模型組，HDL-C水平明顯高于模型組。提示紫檀芪可調節(jié)肥胖孕鼠血脂代謝。

肥胖和糖尿病具有明顯的相關性。一項流行病學調查結果顯示，肥胖人群發(fā)生糖尿病的風險是正常人群的3倍，在肥胖早期可能存在胰島素抵抗[13]。肥胖不僅可以促進胰島素抵抗的發(fā)展，也是導致機體發(fā)生糖脂代謝紊亂的核心因素[14]。本研究結果顯示，模型組孕鼠血糖、胰島素和胰島素抵抗指數(shù)均明顯升高，紫檀芪各組上述指標均明顯降低。提示肥胖孕鼠存在高血糖、高胰島素血癥和胰島素抵抗，而紫檀芪可以明顯改善這一狀態(tài)。

肥胖患者存在脂質代謝紊亂，脂代謝基因FGF21、CD36、Apo B與肥胖密切相關。FGF21主要由肝細胞分泌，其可以促進脂肪細胞攝取葡萄糖，增加胰島素的敏感性，降低血糖，但其過量分泌可促進脂質物質，特別是脂質中TG的合成[15]。CD36又稱之為脂肪酸轉位酶，其是調控外源性脂肪酸進入細胞的關鍵因子，其表達過多會造成外源性脂肪酸在器官和組織中過量積累，進而造成肥胖；Apo B在功能上與CD36正好相反，其主要作用為幫助內源性脂肪酸從細胞中轉運出來，進而分解代謝掉[16-17]。FGF21、CD36和Apo B共同作用，促進了肥胖的發(fā)生和發(fā)展，調節(jié)三者的表達可能有預防肥胖發(fā)生或抑制肥胖相關疾病進展的作用。本研究結果顯示，模型組孕鼠肝臟組織中FGF21、CD36表達量明顯高于正常組，Apo B表達量明顯低于正常組，說明肥胖孕鼠存在FGF21、CD36和Apo B表達異常；與模型組比較，紫檀芪各組小鼠FGF21、CD36表達量明顯降低，Apo B表達量明顯升高，且紫檀芪高劑量組各指標改善更明顯，說明紫檀芪可調節(jié)FGF21、CD36和Apo B的表達，并呈一定劑量依賴性。

綜上所述，紫檀芪可調節(jié)肥胖孕鼠的糖脂代謝，其作用機制可能與調節(jié)FGF21、CD36、Apo B表達有關。但本實驗沒有進一步觀察紫檀芪對肥胖孕鼠子代的影響，特別是安全性方面的影響，需要后續(xù)進一步研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。