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        土家藥山姜水提物的安全性初步評價*

        2022-02-17 02:18:20汪子榮吳美靜許太靜梁渝敏
        吉首大學學報(自然科學版) 2022年5期
        關鍵詞:谷草轉氨酶肌酐

        汪子榮,吳美靜,許 睿,許太靜,向 露,梁渝敏,陳 希,向 娟,2,3

        (1.吉首大學藥學院,湖南 吉首 416000;2.土家醫(yī)藥傳承與創(chuàng)新實驗室國家民委重點實驗室,湖南 吉首 416000;3.湖南省土家醫(yī)藥研究中心,湖南 吉首 416000)

        山姜(Alpiniajaponica(Thunb.) Miq.)是姜科山姜屬植物,產于我國東南部、南部至西南部各省區(qū),生于林下蔭濕處,山姜廣泛分布于湖南省湘西地區(qū)[1].山姜又名和山姜、姜葉淫羊藿、九龍盤、九姜連、姜七等,在湘西地區(qū)又被稱之為小桿子、小柑子、小甘草等.山姜具有抗?jié)?、?zhèn)痛、抑菌、抗腫瘤、抗炎等作用[2-3],化學成分以萜類、黃酮類為主[4-6].湘西地區(qū)的土家醫(yī)、苗醫(yī)及普通百姓廣泛使用山姜的根莖用于治療感冒等呼吸系統疾病,山姜的常用藥用部位為根莖,亦有人采用山姜的果實、種子、莖葉入藥,主要用法為水煎服.目前,山姜的使用主要基于民間用藥經驗,尚缺乏對其藥用安全性的評價,開展山姜藥用安全性評價是保證其用藥安全的重要措施.

        為探究山姜水提物的安全性,本研究通過急性毒性試驗和亞急性毒性試驗對山姜的水提物進行初步的安全性評價,以小鼠的行為特征、體重變化、臟器系數、肌酐(CRE)含量、尿素氮(BUN)含量、谷丙轉氨酶(GPT)活力、谷草轉氨酶(GOT)活力作為安全性評價的重要依據,以期為山姜的臨床研究及臨床應用提供一定理論依據.

        1 材料與儀器

        1.1 試驗動物

        ICR小鼠,雄性,體重20~24 g,SPF級,試驗動物許可證號為SCXK(湘)2019-0004,購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司.在開始試驗前,筆者對小鼠進行適應性飼養(yǎng)1周,即讓小鼠自由進水、進食,使其適應生存環(huán)境.小鼠被飼養(yǎng)在相對清潔、安靜、恒溫(23 ℃±3 ℃)、恒濕(55%±15%)的環(huán)境中,日夜周期調節(jié)為12 h光照和12 h黑暗,小鼠可自由獲得食物和水.本研究所有動物試驗符合吉首大學生物醫(yī)學倫理委員會規(guī)定.

        1.2 藥品及試劑

        1.2.1 藥材 山姜藥材購于湘西土家族苗族自治州吉首市乾州農貿市場,產地吉首.此藥材經吉首大學張代貴老師、向娟老師鑒定為姜科山姜屬植物山姜的根莖.

        1.2.2 試劑 肌酐、尿素氮、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶的檢測試劑盒均購于南京建成生物工程研究所;通用型多聚甲醛固定液購于武漢賽維爾生物科技有限公司;水合氯醛購于天津市科密歐化學試劑有限公司.其他試劑均為市售的純度為化學純或分析純試劑.

        1.3 儀器

        SUNRISE酶標儀(TECAN)、冷凍干燥機(寧波新芝生物科技股份有限公司)、旋轉蒸發(fā)儀(瑞士步琪公司)、BM-500T系列生物顯微鏡(南京南派科技有限公司)、FB224電子天平(上海舜宇恒平科學儀器有限公司).

        2 實驗方法

        2.1 山姜水提物的制備

        稱取適量干燥的山姜根莖,按照料液比1∶10的比例加入山姜根莖和水,采用加熱回流方法提取2次,每次2 h,過濾后合并濾液,濃縮成浸膏狀后冷凍干燥,置于4 ℃冰箱備用,計算得到山姜水提物的得率為17.8%.

        2.2 急性毒性試驗

        按照成人(體重70 kg)可服用10 g生藥的一般規(guī)則,計算出山姜人用給藥劑量為0.143 g/kg,將人用給藥劑量按體表面積法折算成小鼠的給藥劑量,生藥量為1.3 g/kg,即浸膏量0.23 g/kg.給藥當天將小鼠按體重隨機分成山姜水提物組和對照組,每組5只雄性小鼠.山姜水提物組小鼠以最大耐受劑量給藥,以浸膏量5 g/kg溶于純凈水配成相應濃度的灌胃液,再以10 mL/kg的給藥體積給藥[7].小鼠給藥前禁食12 h,稱重之后進行1次灌胃給藥(以5 g/kg給藥劑量給藥,此劑量大約是臨床10 g劑量的22倍),對照組不做處理.對小鼠給藥后,密切觀察并記錄前4 h山姜水提物組和對照組小鼠的狀態(tài),4 h后每間隔0.5 h觀察1次,8 h后觀察間隔時間延長,共觀察7 d,記錄此期間小鼠的行為特征及體重變化.

        2.3 亞急性毒性試驗

        小鼠給藥劑量的換算方法同2.2節(jié),給藥劑量分別為1.3,2.6 g/kg.給藥當天將小鼠按體重隨機分為山姜水提物低劑量組(給藥劑量為1.3 g/kg)、高劑量組(給藥劑量為2.6 g/kg)和對照組,共3組,每組5只雄性小鼠,對照組不做處理.每天用浸膏以純凈水配置成相應濃度的灌胃液對山姜水提物各劑量組小鼠進行灌胃,按照10 mL/kg的給藥體積灌胃給藥,每天灌胃1次,連續(xù)給藥15 d.給藥期間,每天觀察記錄小鼠的行為特征及體重變化.

        2.4 尿素氮、肌酐含量及谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶活力的檢測

        2.4.1 觀測指標 每個試驗快結束時(急性毒性試驗第7 d,亞急性毒性試驗第15 d),小鼠均需要在末次給藥晚上禁食不禁水過夜.在兩個試驗結束后一天,即第8 d和第16 d,按10 mL/kg給藥體積向小鼠腹腔注射4%水合氯醛,將小鼠麻醉后采血,血液分別置于有肝素鈉和無肝素鈉的離心管中,于3 000 r/min,4 ℃的離心機中離心10 min,獲得的上清液分別為血漿和血清樣品,樣品置于-20 ℃冰箱備用,用于檢測尿素氮、肌酐、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶等肝、腎功能生化指標.

        2.4.2 尿素氮、肌酐含量的測定 待測血漿按照試劑盒說明配成相應的待測溶液后,利用酶標儀在520 nm波長處測定OD值,尿素氮含量的計算公式為:尿素氮(mmol/L)=(OD測定-OD空白)/(OD標準-OD空白)*10.

        待測血漿按照試劑盒說明配成相應的待測溶液后,利用酶標儀在546 nm波長處測定吸光度.肌酐含量的計算公式為:肌酐(μmol/L)=(ΔA測定-ΔA空白)/(ΔA標準-ΔA空白)*C標準,其中ΔA=A2-K*A1(A1為加入酶溶液A后的吸光度值,A2為加入酶溶液B后的吸光度值,K為稀釋因子,數值為186/246).

        2.4.3 谷丙轉氨酶活力、谷草轉氨酶活力的測定 待測血清按照試劑盒說明配成相應的待測溶液后,利用酶標儀在505 nm波長處測定各管的OD值,OD絕對=OD測定-OD對照,根據試劑盒原始數據繪制標準曲線,將OD絕對代入標準曲線計算求得谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶活力(卡門氏單位),其中1卡門氏單位為0.482 U/L.

        2.5 臟器系數的計算

        在急性和亞急性毒性試驗中,對小鼠腹腔注射4%水合氯醛,麻醉后采血,處死小鼠后收集其肝臟、腎臟、心臟、脾臟、腎臟稱重并計算臟器系數,臟器系數指實驗動物某臟器的重量與其體重之比值(單位為mg/g).

        2.6 組織病理學分析

        將小鼠肝、腎、脾等組織置于4%甲醛固定液中固定后,經脫水、石蠟包埋、切片(切片厚約4~5 μm)、H&E(伊紅和蘇木素染色)染色,在光學顯微鏡下觀察并采集圖片,分析小鼠的組織病理變化.

        2.7 統計學分析

        3 結果分析

        3.1 行為特征

        在急性和亞急性毒性試驗中,所有小鼠均未出現死亡.在急性毒性試驗給藥后的前8 h,山姜水提物組部分小鼠出現舔足、舔毛、精神不振等行為,在8 h后均恢復正常.在亞急性毒性試驗中,給藥后的第10天,山姜水提物高劑量組的部分小鼠出現豎毛現象.

        3.2 體重變化

        在急性毒性試驗中,給藥后的7 d,山姜水提物組和對照組小鼠的體重均有逐漸增長趨勢,如圖1所示.在進行亞急性毒性試驗的15 d中,對照組小鼠的體重隨著時間的延長而逐漸增加,山姜水提物低劑量組和高劑量組小鼠的體重呈緩慢增長的趨勢,增長幅度低于對照組,如圖2所示.

        圖1 急性毒性試驗7天內小鼠的體重變化Fig. 1 Weight of Mice in 7 Days of the Acute Toxicity Test

        圖2 亞急性毒性試驗15天內小鼠的體重變化Fig. 2 Weight of Mice in 15 Days of the Subacute Toxicity Test

        3.3 臟器系數

        在急性毒性試驗中,與對照組相比,山姜水提物組各器官的臟器系數差異無統計學意義(P>0.05),如表1所示.在亞急性毒性試驗中,與對照組相比,山姜水提物高劑量組肝的臟器系數較高,差異具有統計學意義(P<0.05),山姜水提物低劑量組、高劑量組的心、肺、腎、脾臟器系數與對照組相比,差異均無統計學意義(P>0.05),如表2所示.

        表1 急性毒性試驗小鼠臟器系數

        表2 亞急性毒性試驗小鼠臟器系數

        3.4 肝、腎功能生化指標

        在急性毒性試驗中,山姜水提物組的尿素氮、肌酐、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶指標與對照組相比,差異均無統計學意義(P>0.05),如表3所示.在亞急性毒性試驗中,與對照組相比,山姜水提物高劑量組肌酐含量較低,差異具有統計學意義(P<0.05),山姜水提物高劑量組、低劑量組的尿素氮含量、谷丙轉氨酶活力、谷草轉氨酶活力與對照組相比,差異均無統計學意義(P>0.05),如表4所示.

        表3 急性毒性試驗小鼠肝、腎生化指標

        表4 亞急性毒性試驗小鼠肝、腎生化指標

        3.5 組織病理學檢查

        肝組織H&E染色結果顯示,對照組肝細胞索和肝血竇大致呈放射狀排列,肝細胞圓潤、飽滿,肝板排列規(guī)則、整齊.與對照組相比,急性毒性試驗中水提物組小鼠肝組織未見明顯異常,見圖3所示.

        圖3 急性毒性試驗小鼠肝組織病理檢查(×100)Fig. 3 Liver Histopathological Examination in Acute Toxicity Test

        4 討論

        山姜在湘西土家族苗族自治州中廣泛分布,其根莖在民間廣泛用于治療上呼吸道感染及一些慢性呼吸系統疾病的急性發(fā)作,但是其用藥安全性尚未明確,僅有文獻報道山姜果實的水煎液和熱浸液無明顯急性毒性和亞急性毒性[8].因此,本研究通過急性毒性及亞急性毒性試驗對山姜根莖的用藥安全性進行評價[9].急性毒性的常用評價方法包括LD50法、最大耐受劑量法、近似致死之劑量法、固定劑量法、上下法(階梯法)[10]、累積劑量設計法[11]等.由于山姜在湘西地區(qū)的應用中認為毒性較小或無毒,因此本研究選擇最大耐受劑量法對山姜根莖的用藥安全性進行評價,為進一步評價其在人體中是否有慢性毒性,本研究進行了時長達15 d的亞急性毒性試驗[12].

        本研究結果發(fā)現,在急性和亞急性毒性試驗中,給藥后小鼠的精神狀態(tài)和生活狀態(tài)均表現良好,器官形態(tài)外觀無病理性變化.在急性毒性試驗中,山姜水提物給藥組小鼠的臟器系數、尿素氮、肌酐含量、谷丙轉氨酶活力、谷草轉氨酶活力與對照組相比,均無明顯差異,提示山姜根莖水提物無明顯急性毒性.在亞急性毒性試驗中,山姜水提物低劑量組和對照組相比,給藥15 d后體重有差異,但其增長趨勢基本一致,提示山姜水提物無明顯毒性;山姜水提物高劑量組的肝系數與對照組相比較高,但小鼠的行為及狀態(tài)均正常,且谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶活力與對照組相比無明顯差異,可能和體重較輕有關,因此認為山姜水提物沒有明顯的肝毒性;當腎臟功能受到損害,腎功能失代償時血清肌酐水平會上升[13-14],而山姜水提物低劑量組、高劑量組的肌酐含量與對照組相比,均沒有明顯升高,提示山姜根莖水提物無明顯腎毒性.

        綜上所述,山姜水提物的急性毒性和亞急性毒性不明顯或較低,臨床安全性上可視為較安全.本研究僅為初步安全性評價,尚未進行慢性毒性等試驗研究,故山姜水提物的安全性仍有待進一步研究,以期為其臨床應用和新藥研發(fā)等增加理論依據.

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