楊 程 徐 萍 文 芳 田丹丹 孫澤平

（黔南民族師范學院生物科學與農(nóng)學院，貴州 都勻 558000）

0 引言

近些年，魚類養(yǎng)殖等行業(yè)面臨養(yǎng)殖水體的水質(zhì)劣化、養(yǎng)殖物容易發(fā)生病害等問題，嚴重影響了行業(yè)的發(fā)展，并產(chǎn)生水體污染等問題。 利用一些具備特殊降解能力的微生物來降解水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)生的污染物，凈化水體，穩(wěn)定水質(zhì)是一種可行的解決辦法[1，2]。 在實際生產(chǎn)中，很多微生物可以通過單一或復合制劑的形式應用在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，從而對水質(zhì)、底質(zhì)問題有所改良。 其中，芽孢桿菌不僅具有一般微生態(tài)制劑的特性，還具有一系列的自身優(yōu)勢，例如，抗逆性強，穩(wěn)定性高等，因此已經(jīng)用于水產(chǎn)業(yè)中。 根據(jù)芽孢桿菌的生理特點以及在養(yǎng)殖過程中嚴格的要求，它在水產(chǎn)行業(yè)及水體生態(tài)治理方面具有較好的應用前景，值得深入挖掘其潛能[3-6]。

本研究從都勻市雨花湖底泥樣品中用熱處理和富集培養(yǎng)分離出芽孢桿菌，再通過試驗指標篩選出降解NO2-有明顯效果的菌株，并對篩選的菌株進行了鑒定。 實驗證明篩選出的芽孢桿菌能有效降低水體中的NO2-含量，凈化水質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

從貴州省都勻市雨花湖公園附近，5～15 cm 深土層的土壤和不同水域的泥底中各取樣10 個。 試驗用的泥鰍購于江蘇省連云港市贛榆區(qū)大學生生態(tài)漁場養(yǎng)殖基地。

1.2 試劑及儀器

用到的試劑主要有香柏油、KNO3、NaNO2、（NH4）2SO4、芽孢染色液（廣東環(huán)凱029020）、瓊脂粉、二甲苯、革蘭氏染色液、蛋白胨。 設備主要有：恒溫搖床、分光光度計、高壓滅菌鍋和超凈臺等。

1.3 模擬水樣及培養(yǎng)基

模擬水樣：LB 培養(yǎng)基稀釋6.5 或60 倍備用。富集培養(yǎng)基：硝酸鉀0.5 g，亞硝酸鈉0.5 g，硫酸銨 1 g，葡萄糖2.5 g，泥鰍缸廢水500 mL。 篩選培養(yǎng)基：硝酸鉀1.5 mg，亞硝酸鈉 3.75 mg，硫酸銨 3.125 mg，葡萄糖0.5 g，泥鰍缸廢水500 mL。

1.4 產(chǎn)芽孢菌株的篩選和分離

在富集培養(yǎng)基中按照樣品和培養(yǎng)基1∶5 接種樣品，然后恒溫培養(yǎng)24 小時左右。 將所得菌懸液放在預熱好的80 ℃水浴中保溫25 分鐘后取出， 再用搖床120 r/min，30 ℃震蕩培養(yǎng)約12 小時，將處理過的菌懸液按10-2、10-3的濃度梯度涂布在LB 固體培養(yǎng)基上，30℃靜置培養(yǎng)20～36 小時。 待長出菌落后，挑選單個菌落進一步進行純化，采用斜面?zhèn)鞔２胤ê透视屠鋬龇ū４嬉源齻溆谩?/p>

1.5 篩選具有降亞硝酸鹽特性的菌株

純培養(yǎng)得到的產(chǎn)芽孢菌用LB 液體培養(yǎng)基活化后稀釋，取稀釋后的菌液涂布在篩選培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)24 小時后觀察菌落，挑取其中最大的幾個菌落，純培養(yǎng)后保藏，以備后續(xù)實驗。 所得菌株重復上述過程進行復篩。 最終得到一株降解亞硝酸鹽效果明顯的菌株，命名為Y2。

1.6 菌種鑒定

分離、 篩選得到的菌Y2 通過采用涂布平板的方法進行接種，30℃培養(yǎng)至長出菌落后， 觀察菌落的形狀、大小、顏色等特征且用常規(guī)的染色方法及革蘭氏染色法、芽孢染色法進一步觀察菌體的形態(tài)特征。 菌株進行 16S rDNA 測序（上海生工），通過 NCBI 網(wǎng)站中的 Blast 程序進行同源性比對，用MEGA-X 軟件進行同源排列，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，推測Y2 的同源關系。

1.7 Y2 菌對模擬水樣及泥鰍養(yǎng)殖水中亞硝酸鹽的降解作用

稀釋模擬水樣6.5 倍后取樣測定初始OD 值，28℃靜置處理，設置2 個平行組和1 個空白對照，平行試驗組每個三角瓶都投入濃度約為4.0×106cfu/mL 的等量菌液且每相隔48 小時取樣測3 個模擬水樣OD 值，用分光光度法根據(jù)亞硝酸鹽國標檢測標準測得出平行組與空白組中亞硝酸鹽的含量， 實驗組結(jié)果取2 個平行組的平均值[8]。 購回的泥鰍置于魚缸中養(yǎng)殖大約一個星期，挑選大小及活躍度相近的45 條，隨機平均分配在3個相同的魚缸內(nèi)，魚缸內(nèi)初始的水體相同。實驗組中加入濃度約為3.0×106cfu/ml 的Y2 菌液，每日固定時間投喂等量的食物一次，每隔48 h 取樣測3 個模擬水樣OD 值，采樣前的24 h 停止喂食，用分光光度法根據(jù)亞硝酸鹽國標檢測平行組與空白組亞硝酸鹽的含量，實驗組結(jié)果取2 個平行組的平均值。

2 實驗結(jié)果

2.1 菌株分離、篩選與鑒定

將樣品經(jīng)過富集和熱處理以后接種于固體平板，得到單菌落若干，挑選其中五株較大的單菌落培養(yǎng)保藏。 將這五株菌活化后進行初篩和復篩，最后獲得生長速度較快，菌落較大的菌株一株，命名為Y2，將Y2菌株進一步確定為研究對象。 肉眼觀察Y2 菌落為米黃色，菌落表面較光滑，如圖1A。對Y2 芽孢染色，染色結(jié)果顯示Y2 菌呈桿狀，具有芽孢結(jié)構(gòu)，其芽孢為橢圓且為中生，如圖1B。對Y2 進行革蘭氏染色顯示Y2為革蘭氏陽性菌。 對Y2 進行16S rDNA 測序并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹分析，結(jié)果如圖1D 所示。 由進化樹可知，Y2 菌株和阿耶波多氏芽孢桿菌 （Bacillus aryabhattai B8W22） 的親緣關系最近。 結(jié)合形態(tài)學的鑒定和16S rDNA 的分析結(jié)果可以基本確定出Y2 為阿耶波多氏芽孢桿菌。

圖1

2.2 Y2 菌株對亞硝酸鹽的降解

將Y2 菌株按一定濃度稀釋后分別加入模擬水樣和泥鰍養(yǎng)殖水樣中， 測定Y2 對兩類水體中亞硝酸鹽的降解效果。 首先在模擬水樣中亞硝酸鹽濃度的測定結(jié)果如圖2A 所示。在實驗組加入4.0×106cfu/mL 濃度的Y2 菌液，實驗組NO2-含量變化呈明顯的下降，NO2-去除率為63.58%；作為對照的未加入Y2 組中NO2-含量則呈上升的趨勢，上升率為17.35%；這一結(jié)果表面在模擬水樣中加入Y2（Bacillus aryabhattai）可以有效地降低模擬水樣中NO2-含量。 在泥鰍養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽濃度變化結(jié)果如圖2B 所示。 實驗組中加入了濃度約為 3.0×106cfu/mL 的 Y2 菌液，NO2-含量在實驗組中也有下降，NO2-去除率為24.3%； 而未加入Y2 的對照組中NO2-含量略微有上升趨勢，上升率3.6%。 這一結(jié)果表明泥鰍養(yǎng)殖污水中加入Y2 菌后也可有效降低水中NO2-含量。

圖2 模擬水樣以及泥鰍養(yǎng)殖水樣中NO2-含量隨時間的變化

3 討論與展望

本研究以人工湖泊和土壤為樣品源，以其對亞硝酸鹽的降解能力為主要參考指標篩選出1 株芽孢桿菌Y2，并根據(jù)其形態(tài)特征和分子鑒定，該菌被鑒定為阿氏芽孢桿菌。 通過對Y2 菌株在模擬水樣及泥鰍養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽含量的影響研究， 證明Y2 菌株可以有效的降低水體中亞硝酸鹽的含量。

水體中NO2-濃度太高會對水體中的一些生物造成危害，對于水產(chǎn)養(yǎng)殖有較大的危害。 本研究分離的阿氏芽孢桿菌Y2 菌株在實驗中顯示出較好的亞硝酸鹽去除效果，從而改善水質(zhì)，因此本研究所分離的Y2菌株在凈化水體，改善水產(chǎn)養(yǎng)殖水體水質(zhì)方面具有一定的應用潛力和價值。 另外阿氏芽孢桿菌作為一種芽孢桿菌，生長條件要求不高、抗逆性極強，十分便于大規(guī)模的培養(yǎng)和應用在微生物制劑中。 很多研究表明，微生物制劑不僅能夠有效地降低水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中有害物質(zhì)的很多不利影響，而且能有效改善水質(zhì)[6，7]。 可以用來在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應用益生菌改善養(yǎng)殖水體的質(zhì)量、提高養(yǎng)殖物的生長力和免疫能力[8]。 在未來進一步的研究中可以深入研究Y2 菌株的這一潛力。