黃永松 王婷婷 徐 麗 芮 艷

（蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，蚌埠 233004）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease， COPD）與慢性牙周炎（chronic periodontitis， CP）的相關(guān)性研究，目前成為諸多學(xué)者關(guān)注的重點(diǎn)[1，2]。研究表明，COPD合并CP（COPD+CP）的患者中，牙周炎的嚴(yán)重程度明顯高于單純CP患者，提示COPD對(duì)慢性牙周炎的潛在促進(jìn)作用[3]。最近研究發(fā)現(xiàn)，局部結(jié)締組織的成纖維細(xì)胞在受到外界炎癥介質(zhì)刺激后，其釋放的VEGF能誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成[4]，其中VEGF的功能與M-CSF相似，能夠刺激破骨細(xì)胞前體RANK受體， VEGF還能夠促血管形成，導(dǎo)致單核-巨噬細(xì)胞系的破骨細(xì)胞前體局部聚集，從而進(jìn)一步有利于破骨細(xì)胞發(fā)生[5]。

本課題組前期研究證實(shí)了根尖牙周炎病變處成纖維樣細(xì)胞的VEGF-A可變剪接，與根尖區(qū)牙槽骨破壞過程密切相關(guān)，其中A型可變剪接體（VEGF-A165a）與總VEGF-A的比例，與曲面斷層影像中，根尖區(qū)牙槽骨吸收破壞范圍呈正相關(guān)。確認(rèn)了慢性炎癥狀態(tài)下，根尖區(qū)牙周膜，至少部分憑借VEGF-A165a型可變剪接異構(gòu)體刺激局部破骨細(xì)胞形成，導(dǎo)致了牙槽骨吸收[6]。而在COPD循環(huán)系統(tǒng)中，炎癥介質(zhì)、代謝產(chǎn)物、細(xì)胞因子等生物學(xué)大分子的存在，也被證實(shí)與牙周炎嚴(yán)重程度有關(guān)[7]。隨著COPD病程的增加，VEGF水平增加，與COPD的嚴(yán)重程度成正相關(guān)[8]，而VEGF-A165a是VEGF最主要的異構(gòu)體，且未有文獻(xiàn)報(bào)道VEGF-A165a在牙周炎患者局部牙周組織表達(dá)情況。因此本研究推測COPD合并慢性牙周炎（COPD+CP）患者的牙周膜細(xì)胞所處微環(huán)境應(yīng)不同于單純的慢性牙周炎（CP），可能因此改變了VEGF-A異構(gòu)體的表達(dá)，導(dǎo)致骨破壞狀態(tài)改變。為驗(yàn)證此推論，本研究以COPD+CP的患者及CP患者為模型，通過培養(yǎng)拔除的患牙牙周膜成纖維細(xì)胞，對(duì)VEGF-A165a的骨破壞作用進(jìn)行探討，旨在為COPD合并慢性牙周炎疾病的發(fā)病機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象及分組

選擇2018年7月至2019年12月間在蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸科就診的COPD伴發(fā)重度牙周炎（CP）患者12例，其中輕、中、重和極重度各3例，年齡68 ～ 86歲，平均年齡（72.1±6.2）歲，男性8例，女性4例。另選取口腔門診診斷為單純性重度牙周炎患者11例，年齡65 ～ 79歲，平均年齡 （70.5±4.6）歲，男性6例，女性5例。兩組病人年齡、選取的拔除患牙各指標(biāo)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。

納入標(biāo)準(zhǔn)： COPD+CP組：（1）在吸入支氣管擴(kuò)張劑后，第一秒用力呼氣容積（FEV1）占用力肺活量（FCV）比值（FEV1/FCV<70%），表明存在持續(xù)氣流受限。（2）近3個(gè)月未住院行慢阻肺治療的患者，且近3個(gè)月未使用激素、抗組胺及抗生素類藥品；（3）所有患者均有≥1顆牙齒松動(dòng)達(dá)III度且牙槽骨吸收≥根長的1/2至2/3，達(dá)到拔除指標(biāo)。（4）近3個(gè)月未行系統(tǒng)的牙周治療。CP組：（1）沒有任何基礎(chǔ)性疾??；（2）沒有吸煙等不良習(xí)慣；（3）所有患者均有≥1顆牙齒松動(dòng)達(dá)III度且牙槽骨吸收≥根長的1/2至2/3，達(dá)到拔除指標(biāo)。（4）近3個(gè)月未行系統(tǒng)的牙周治療。

本研究通過蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者已簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 肺功能檢查 COPD分級(jí)參考《內(nèi)科學(xué)》第8版GOLD 2018年度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[9]。牙周檢查：參考《牙周病學(xué)》第4版慢性牙周炎分型的重度[10]：牙周袋＞6 mm，附著喪失≥5 mm，牙槽骨吸收超過根長的1/2至2/3。選取兩組患者對(duì)拔除的患牙進(jìn)行檢測記錄，檢測指標(biāo)包括牙槽骨吸收程度，探診深度、附著喪失、齦溝出血指數(shù)，菌斑指數(shù)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將拔除的患牙，以及拔牙手術(shù)中刮除根尖區(qū)炎癥性牙周膜組織的病例，收集其新鮮手術(shù)標(biāo)本，分離培養(yǎng)病變狀態(tài)的牙周膜成纖維細(xì)胞，采用文獻(xiàn)[4]的方法進(jìn)行原代培養(yǎng)。使用α-MEM（GIBCO，GrandIsland，NY，USA） 培養(yǎng)基。破骨細(xì)胞前體 raw264. 7使用DMEM培養(yǎng)基（GIBCO）。培養(yǎng)條件為37 ℃，95 %濕度，5%CO2。所有培養(yǎng)基含1%雙抗（ 青霉素100 U/mL，鏈霉素100 g/mL） ，2 mM L-谷氨酰胺，10% 胎牛血清（ fetal bovine serum，F(xiàn)BS， GIBCO）。

1.2.3 制備條件培養(yǎng)基和誘導(dǎo)破骨細(xì)胞 培養(yǎng)病變的牙周膜成纖維細(xì)胞，制備條件培養(yǎng)基[4]。細(xì)胞接種于100 mm培養(yǎng)皿，至匯合度70% ～ 80%，更換無血清 α-MEM 培養(yǎng)基培養(yǎng) 7 d，550×g離心10 min，棄沉淀后，以50%上清，40%新鮮α-MEM，10% FBS和 20 ng/μl 重 組 鼠 RANKL（R&D，Minneapolis，MN，USA）混合制備條件培養(yǎng)基。破骨前體細(xì)胞（Raw 264.7細(xì)胞）以1 000個(gè)/孔接種于24孔板，條件培養(yǎng)基培養(yǎng)。隔日換液至第10 d，以抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate- resistant acid phosphatase，TRAP）試劑盒（TRAP kit，廠商 ： Sigma，St. Louis，MO，USA） 染色。破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)：僅TRAP陽性且細(xì)胞核不少于3個(gè)的細(xì)胞（TRAP+MNCs）。

1.2.4 RNA提取及real-time PCR 采用TRIzol Reagent（Life Technologies， Carlsbad，California，USA）提取細(xì)胞總RNA，2 μg總RNA制備cDNA用第一鏈逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Life Technologies）。20 μl real-time PCR反應(yīng)體系，以Light Cycler real-time PCR system（Roche Diagnostics Ltd，Shanghai，China） 運(yùn)行，程序 ： 95℃ 10 min，退火延伸 40個(gè)循環(huán)，60 ℃ 1 min，95℃ 15 min[4]。所有異構(gòu)體相對(duì)表達(dá)量由β-actin校準(zhǔn)。VEGF-A引物序列參照相關(guān)文獻(xiàn)[12]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 牙周膜成纖維細(xì)胞中VEGF-A165a的表達(dá)水平

兩組牙周膜成纖維細(xì)胞狀態(tài)相同，細(xì)胞呈典型的梭形成纖維細(xì)胞樣（圖1）。COPD+CP組表達(dá)VEGF-A165a（0.025±0.017 ） 水平高于CP組（0.012±0.007）（P<0.05）。PCR結(jié)果顯示重度和極重度組的牙周膜成纖維細(xì)胞的VEGF-A165a表達(dá)水平均高于輕度組（P<0.05），由此提示牙周膜患者中的VEGF-A165a的表達(dá)水平與COPD的患病程度密切相關(guān)。

圖1 CP和COPD+CP組的牙周膜成纖維細(xì)胞（40×）

2.2 牙周膜成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)破骨效應(yīng)

相比CP組， COPD+CP組患者的牙周膜成纖維細(xì)胞的條件培養(yǎng)基能誘導(dǎo)更多的破骨細(xì)胞形成（P<0.05）。重度組與極重度組基誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的數(shù)量均高于輕度組（P<0.05），詳見表1、2和圖2、3。

圖2 CP組和COPD+CP組誘導(dǎo)破骨細(xì)胞效應(yīng)

表1 COPD+CP組VEGF-A165a相對(duì)表達(dá)量及誘導(dǎo)破骨細(xì)胞數(shù)量對(duì)比（）

表1 COPD+CP組VEGF-A165a相對(duì)表達(dá)量及誘導(dǎo)破骨細(xì)胞數(shù)量對(duì)比（）

指標(biāo) COPD+CP輕度(n=3) COPD+CP 中度(n=3) COPD+CP 重度(n=3) COPD+CP 極重度(n=3)VEGF-A165a 0.014±0.006 0.09±0.009 0.036±0.012 0.042±0.011破骨細(xì)胞誘導(dǎo)數(shù)量 12.187±1.630 10.667±9.018 25.317±4.531 31.250±4.234

表2 CP組和COPD+CP組的VEGF-A和VEGF-A165a表達(dá)水平（）

表2 CP組和COPD+CP組的VEGF-A和VEGF-A165a表達(dá)水平（）

指標(biāo) CP組(n=11) COPD+CP組(n=12) P值VEGF-A 0.071±0.059 0.107±0.041 0.138 VEGF-A165a 0.012±0.007 0.025±0.017 0.026*破骨細(xì)胞誘導(dǎo)數(shù)量 10.205±3.796 19.859±11.059 0.012*

2.3 相關(guān)性分析

雙變量Perason檢驗(yàn)結(jié)果顯示，兩組牙周膜成纖維細(xì)胞VEGF-A165a相對(duì)表達(dá)量與拔除患牙的臨床指標(biāo)，均無明顯相關(guān)性（P>0.05）。而VEGF- A165a相對(duì)表達(dá)量與破骨細(xì)胞誘導(dǎo)效率，無論是CP組（R=0.658）還是COPD+CP組（R=0.830）均為正相關(guān)性，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），詳見表3和圖4。

圖4 2組VEGF-A165a相對(duì)表達(dá)量與破骨細(xì)胞的相關(guān)性分析

表3 VEGF-A165a相對(duì)表達(dá)量與CP組和COPD+CP組各指標(biāo)的相關(guān)性分析

3 討論

本文探討了VEGF基因可變剪接和牙槽骨破壞的關(guān)系。VEGF可通過可變剪接產(chǎn)生多種mRNA， 如 VEGF-A121、VEGF-A165、VEGF- A189等，VEGF能誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成[6]。基于課題組前期研究中，證實(shí)了根尖周囊腫的骨破壞與VEGFA165a表達(dá)量正相關(guān)[6]。因此，本研究在牙周炎中探索VEGF-A165a表達(dá)量與破骨細(xì)胞發(fā)生的關(guān)系，并研究COPD對(duì)該過程的影響。

圖3 CP組和COPD+CP組VEGF-A165a表達(dá)水平及破骨誘導(dǎo)效率

目前對(duì)于特定的VEGF異構(gòu)體對(duì)破骨細(xì)胞分化過程中的作用尚有待研究。本研究采用了提取慢性牙周炎中局部牙周膜成纖維細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，觀察VEGF-A165a其對(duì)破骨細(xì)胞的誘導(dǎo)效率和COPD分級(jí)的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)COPD+CP組表達(dá)更高水平的VEGF-A165a型可變剪接異構(gòu)體（P<0.05），也能誘導(dǎo)更多的破骨細(xì)胞形成。說明COPD實(shí)際上加重了牙周炎局部牙周膜細(xì)胞中的VEGF-A165a表達(dá)，而隨之導(dǎo)致了牙周炎局部破骨細(xì)胞形成效率增高，此結(jié)果與COPD改變循環(huán)炎癥因子的報(bào)道相一致[11]，這個(gè)經(jīng)循環(huán)炎癥因子改造的局部病變微環(huán)境，也賦予了牙周膜間質(zhì)細(xì)胞更高的破骨細(xì)胞誘導(dǎo)效率。

在COPD+CP組，重度組和極重度組也會(huì)表達(dá)出更高水平的VEGF-A165a型可變剪接異構(gòu)體。此結(jié)果進(jìn)一步顯示了VEGF-A165a異構(gòu)體的表達(dá)，可能是因COPD肺功能分級(jí)而變化的，隨COPD肺功能的降低而在牙周炎部位表達(dá)增加，導(dǎo)致牙槽骨部位出現(xiàn)更多破骨細(xì)胞。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)VEGF水平的升高，與COPD預(yù)后不良有關(guān)，隨著COPD病程的增加，VEGF水平增加，與COPD的嚴(yán)重程度成正相關(guān)[12]。但是由于樣本量較少，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果還需要充實(shí)，來證實(shí)VEGF-A165a型可變剪接異構(gòu)體與COPD肺功能分級(jí)相關(guān)。

同時(shí)兩組的VEGF-A165a相對(duì)表達(dá)量與拔除患牙的臨床指標(biāo)進(jìn)行Perason相關(guān)性分析，均無相關(guān)性（P>0.05），且臨床指標(biāo)兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能是我們選擇的牙齒都是III度松動(dòng)的達(dá)到拔牙指標(biāo)的牙齒，而使得拔除患牙的臨床指標(biāo)的無差異性。然而，無論是CP組還是COPD+CP組，VEGF-A165a相對(duì)表達(dá)量和破骨細(xì)胞誘導(dǎo)效率都是成正相關(guān)性，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示我們不是因?yàn)檠乐軤顟B(tài)不同而造成的破骨細(xì)胞生成的差異，而是VEGF-A165a不同造成的破骨細(xì)胞的差異。

4 結(jié)論

本研究提示：COPD+CP組的VEGF-A165a表達(dá)量和破骨細(xì)胞誘導(dǎo)效率均高于CP組，且重度和極重度比輕度COPD組更明顯；VEGF-A165a異構(gòu)體的表達(dá)，可能因COPD肺功能分級(jí)而變化。該研究結(jié)果為臨床干預(yù)COPD合并慢性牙周炎的治療研究提供了一個(gè)潛在靶點(diǎn)。