林志鑾，張傳海，馬春華，張靜，詹寶珍

（1.武夷學院 福建省生態(tài)產業(yè)綠色技術重點實驗室，福建 武夷山 354300；2.武夷學院 茶與食品學院，福建 武夷山 354300；3.福建農林大學 食品科學學院，福建 福州 350002）

土霉素(OTC)、四環(huán)素(TC)、金霉素(CTC)、多西環(huán)素(DCC)屬四環(huán)素類(TCs)抗生素，由于價格便宜和廣譜抗菌性被廣泛用于養(yǎng)殖業(yè)[1]。為此，GB 3838—2002《地表水環(huán)境質量標準》[2]和GB 2763—2014《食品安全國家標準食品中農藥殘留最大限量》[3]中對四環(huán)素的含量都有嚴格的規(guī)定。為此建立一種快速、準確的分離、提取和檢測四環(huán)素方法顯得十分重要。

實驗室中對四環(huán)素的主要提取方法有:固相微萃取發(fā)[4]、超聲萃取[5-6]、微波輔助萃取[7]、離子液體富集[8]等方法。離子液體（ionic liquid）具有萃取和分離弱極性、非極性、極性物質的能力，廣泛應用于天然產物提取[9]。對均相萃取、異相分離的特點，可實現(xiàn)連續(xù)操作、易于放大等優(yōu)點，廣泛應用與對抗生素、農殘、獸殘的富集、提取[10-11]。

論文建立離子液體液-液微萃取超聲波輔助提取法從雞肉中提取4 種四環(huán)素類抗生素，并用高效液相色譜法(high-performance liquid chromatography,HPLC)測定。探討離子液體種類、用量，分散劑種類、用量，超聲波時間對雞肉中的四環(huán)素萃取的影響，通過HPLC法測定雞肉中四環(huán)素的含量，以期為雞肉中痕量/超痕量四環(huán)素類抗生素的分離富集提供一種新方法。

1 檢測實驗

1.1 材料與試劑

雞肉:散裝雞肉購于武夷山某超市。

1.2 標準品與試劑

四環(huán)素(TC)，土霉素(OTC)，北京百靈威科技公司，純度98%；多西環(huán)素(DCC)，金霉素(CTC)，美國Aladdin 公司，純度90%；甲酸，乙腈，國藥集團，色譜純；甲醇,乙醇,丙酮，國藥集團，1-丁基吡啶四氟硼酸鹽（[Bupy][BF4]）、溴化1-辛基-3-甲基咪唑（[OMIM]Br）、1-丁基-3 甲基咪唑六氟磷酸鹽([OMIn][PF6])，美國Aladdin 公司，分析純。實驗用水為純凈水。

1.3 主要儀器設備

1260 高效液相色譜系統(tǒng)；C18色譜柱（TC，4.6 mm×150 mm，5 μm），美國安捷倫科技有限公司；TGL-21M，高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)責任公司；DHG-9071A，電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；ME55/05，分析天平，上海梅特勒-托利多儀器公司；S6H，超聲波清洗機，廈門致微儀器公司。

1.4 溶液的配制

標準液的配置: 準確稱取DCC、CTC、TC、OTC 標準品各0.01 g，溶解后轉移到10.00 mL 的容量瓶中定容，即為10.00 mg/mL。實驗中所需的標準溶液均由該標準母液適當稀釋后配制。

1.5 實驗方法

1.5.1 色譜條件

流動相:A 為0.20%甲酸水溶液，B 為水。洗脫程序流速:1.00 mL/min；柱溫:26 ℃；檢測波長:350 nm，進樣體積:10 μL。

表1 洗脫程序Table 1 Elution procedure

1.5.2 工作曲線測定

準確配制DCC、CTC、TC、OTC 混合母液的濃度:0.50～50 μg/mL，按照1.5.1 色譜條件進行進樣。以DCC、CTC、TC、OTC 峰面積為縱坐標，DCC、CTC、TC、OTC 濃度為橫坐標建立方程，并獲得相關系數(shù)R。

1.5.3 樣品前處理

雞肉經(jīng)過攪碎均質處理后，準確稱取10.00 g 雞肉樣品，加入20.00 mL 0.20%甲酸水溶液，在功率為100 W條件下超聲輔助提取30 min 后，粗提液減壓抽濾，轉移到50 mL 容量瓶中定容。準確移取9.00 mL 粗提液于離心管中，加入450 μL 3.00%的離子液體與720 μL丙酮，使用超聲輔助提取，提取時間15 min，功率100 W。以4 000 r/min，4 ℃放入冷凍離心機中離心8 min。取底部溶液1.00 mL，過0.45 μm 濾膜，待測。

1.5.4 萃取劑的選擇

按照1.5.2 實驗步驟，討論加入不同的離子液體（[OMIn][PF6]、[OMIM]Br、[Bupy][BF4]）及不同的分散劑（甲醇、丙酮、乙腈、乙醇）進行微萃取對4 種四環(huán)素萃取的影響。

1.5.5 單因素實驗

按照1.5.2 實驗步驟，討論加入不同的離子液體體積分數(shù)（1%、2%、3%、4%、5%），不同的分散劑用量（480、600、720、840、960 μL）、不同的微萃取時間（5、10、15、20、25 min）、不同的超聲功率（50、75、100、125、150 W）對4 種四環(huán)素萃取進行考察和分析，重復3 次取其平均值，確定適宜的提取條件。

1.5.6 方法學實驗

樣品加標回收率實驗:取雞肉6 份，向其中5 份加入濃度為50 μg/mL，10 mL 的混標準，按照1.5.2 實驗步驟進行提取，按照1.5.2 實驗步驟進行測定，計算樣品加標回收率。穩(wěn)定性試驗:按照1.5.2 實驗步驟對雞肉中四環(huán)素進行提取，按照1.5.1 實驗步驟進行測定，重復進樣6 次，計算其RSD%。重現(xiàn)性實驗:按照1.5.2 實驗步驟進行，對雞肉中的四環(huán)素進行平行提取6 次，并按照1.5.1 洗脫條件下進行測定。最小檢測限試驗:在最低檢出濃度下測定6 次，根據(jù)3 倍的信號/噪聲來計算4 種四環(huán)素的最小檢出限。

2 實驗結果與討論

2.1 四環(huán)素分離及標準曲線的測定

2.1.1 4 種四環(huán)素分離效果

按照1.5.1 實驗步驟，在此色譜洗脫的程序下，土霉素、四環(huán)素、金霉素、多西環(huán)素這4 種四環(huán)素得到比較好的分離效果。其中4 種四環(huán)素在12 min 都出峰完畢，且全部基線分離。

圖1 4 種四環(huán)素分離效果圖Fig.1 Four kinds of tetracycline separation diagram

2.1.2 工作曲線的測定

在1.5.1 實驗步驟下測定DCC、CTC、TC 和OTC 線性方程。實驗結果表明:在12 min 內能分別洗脫DCC、CTC、TC 和OTC。其線性范圍為0.50～50 μg/mL，R≥0.995 2。其中DCC 的線性方程為Y=14.678X+8.632 1，R=0.998 7；CTC 的線性方程為Y=22.423X+27.087，R=0.995 2；TC 的線性方程為Y=11.303X+14.53，R=0.995 4；OTC 的線性方程為Y=1.3293X+1.851，R=0.995 3。

2.2 不同離子液體對4 種四環(huán)素萃取的影響

考察3種離子液體（[OMIn][PF6]、[OMIM]Br、[Bupy][BF4]）對DCC、CTC、TC、OTC 的萃取效果影響。結果如圖2 顯示，CTC、TC、OTC 和DCC 的經(jīng)過3 種離子液體進行微萃取后，[OMIn][PF6]對四環(huán)素(TC)，多西環(huán)素(DCC)，金霉素(CTC)這3 種四環(huán)素的萃取效果最好，分別是0.20、0.58、0.49 μg/mL，但對土霉素(OTC)的萃取并不是最佳，綜合以上萃取數(shù)據(jù)，采用分[OMIn][PF6]作為萃取劑。

圖2 不同離子液體對4 種四環(huán)素萃取影響Fig.2 Effect of different ionic liquids on extraction of four tetracyclines

2.3 分散劑種類對4 種四環(huán)素萃取的影響

考察4 種分散溶劑（甲醇、丙酮、乙腈、乙醇）對土霉素、四環(huán)素、金霉素和多西環(huán)素的萃取效果的影響。實驗結果如圖3 顯示，選擇丙酮作為分散劑，離子液體的萃取效率最高，此時4 種四環(huán)素的檢出量分別為0.54、0.61、0.26、0.26 μg/mL。因此，選擇丙酮作為最佳分散提取劑。這個可能的原因是甲醇、乙醇、乙腈的極性比較大，丙酮的極性相對以上3 種分散劑來的小，4種四環(huán)素分散在丙酮中的效果比較好。

圖3 分散劑種類對4 種四環(huán)素萃取影響Fig.3 Effect of dispersants on extraction of four tetracyclines

2.4 單因素實驗

2.4.1 離子液體濃度的優(yōu)化

考察不同的[OMIn][PF6]離子體積分數(shù)（1%，2%，3%，4%，5%）對土霉素、四環(huán)素、金霉素和多西環(huán)素的萃取效果。結果如圖4 顯示，當體積分數(shù)逐漸增加到3%，萃取效率會達到最高值。此時，4 種四環(huán)素的含量為0.48、0.73、5.23、3.35 μg/mL。因此[OMIn][PF6]離子體積分數(shù)最佳萃取濃度為3%為優(yōu)。

圖4 離子液體體積分數(shù)對4 種四環(huán)素萃取影響Fig.4 Effect of ionic liquid concentration on extraction of four tetracyclines

2.4.2 分散劑用量的選擇

考察不同的丙酮分散劑用量（480、600、720、840、960 μL）對土霉素、四環(huán)素、金霉素和多西環(huán)素的萃取效果的影響。實驗結果如圖5 顯示，當分散劑用量為720 μL 時，萃取效果最好，4 種四環(huán)素的檢出量都達到最大，分別為0.59、0.47、15.46、9.29 μg/mL。因此分散劑丙酮用量是720 μL 為佳。

圖5 分散劑用量對4 種四環(huán)素萃取影響Fig.5 Effect of dispersant dosage on extraction of four tetracyclines

2.4.3 萃取時間的優(yōu)化

考察不同的萃取時間（5、10、15、20、25 min）對土霉素、四環(huán)素、金霉素和多西環(huán)素的萃取效果的影響。結果如圖6 顯示，當萃取時間為15 min 時，萃取效率最好，這個時候的四種四環(huán)素的檢出量都達到最大，分別為0.50、0.56、0.66、1.39 μg/mL。但當時間超過15 min 時，萃取效率反而降低，這個可能是雞肉中的4 種四環(huán)素經(jīng)過超聲輔助提取后慢慢溶解出來，當超聲波時間為15 min 溶解達到最大，超過15 min 后，由于超聲時間太久導致四環(huán)素被超聲破壞，雞肉中四環(huán)素含量降低。所以萃取時間為15 min 為優(yōu)。

圖6 超聲時間對4 種四環(huán)素萃取影響Fig.6 Effect of ultrasonic time on extraction of four tetracyclines

2.5 方法學試驗

樣品加標回收率試驗:取雞肉6 份，向其中5 份加入濃度為50 μg/mL，10 mL 的混標準，按照1.5.2 實驗步驟進行提取和測定，計算樣品加標回收率。實驗結果表明:4 種四環(huán)素的樣品加標回收率在80.70%～112.10%時間。

穩(wěn)定性試驗: 按照1.5.2 實驗步驟對雞肉中四環(huán)素進行提取，按照1.5.1 實驗步驟進行測定，重復進樣6 次，計算其RSD 值為3.78%。重現(xiàn)性試驗:按照1.5.2實驗步驟進行，對雞肉中的四環(huán)素進行平行提取6次，并按照1.5.1 洗脫條件下進行測定。計算其RSD值為1.32%。最小檢測限試驗:在最低檢出濃度下測定6 次，根據(jù)3 倍的信號/噪聲來計算4 種DCC、CTC、TC、OTC 的檢出限分別在0.50、0.10、0.10、0.10 μg/mL。

表2 四種四環(huán)素的樣品加標回收率（n=5）Table 2 The recoveries of four tetracycline samples were determined (n=5)

3 結論

利用[OMIN][PF6]離子液體和超聲波輔助提取法從雞肉中提取4 種四環(huán)素類抗生素（土霉素(OTC)、四環(huán)素(TC)、金霉素(CTC)、多西環(huán)素(DCC)），并采用高效液相色譜法測定DCC、CTC、TC 和OTC。實驗結果表明:以濃度為3%萃取體積為450 μL [OMIN][PF6]提取劑，720 μL 丙酮為分散劑，超聲提取時間為15 min。在最優(yōu)的萃取條件下，用高效液相色譜法測定雞肉4種四環(huán)素，發(fā)現(xiàn)DCC、CTC、TC 和OTC 未檢出；在12 min 內分別洗脫DCC、CTC、TC 和OTC。DCC、CTC、TC和OTC 的檢出限分別為0.50、0.10、0.10 和0.10 μg/mL。DCC 的線性范圍為0.50～50 μg/mL，r≥0.995 2。實驗結果表明:用高效液相色譜法能滿足快速檢測雞肉中的DCC、CTC、TC 和OTC。