李文慧，朱陵群，郭蓉娟

慢性失眠以夜間失眠和日間功能損害為主要特征，失眠癥狀常表現(xiàn)為入睡困難、睡眠維持障礙、早醒、醒后難以再次入睡，甚則徹夜不眠，日間癥狀包括疲勞、情緒不穩(wěn)、周身不適、認知功能減退等，且上述癥狀持續(xù)≥3個月[1-2]。慢性失眠屬于中醫(yī)學(xué)“不寐”范疇，痰熱與痰濁導(dǎo)致的陰陽不和形成的失眠最為常見[3]，臨床研究表明，痰熱內(nèi)擾證是不寐最常見的證型之一，黃連溫膽湯是治療不寐痰熱內(nèi)擾證的經(jīng)典方劑，具有良好的療效與安全性[4-7]。在符合失眠癥診斷的病人中，31%～75%為慢性失眠，其中66.67%以上的病人病程>1年[8]。長期失眠可導(dǎo)致焦慮、抑郁、高血壓、冠心病、糖尿病、腫瘤等疾病，全面深入剖析其發(fā)病機制并對其有效防治至關(guān)重要。

失眠的發(fā)病機制十分復(fù)雜，有過度覺醒機制、神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫機制、相關(guān)腦區(qū)及神經(jīng)遞質(zhì)機制等[9]，由于大腦結(jié)構(gòu)的特殊性及神經(jīng)生物學(xué)的復(fù)雜性，其發(fā)病機制的研究受到限制。代謝組學(xué)的日益發(fā)展，為失眠的診斷、闡明發(fā)病機制、治療監(jiān)測、藥物研發(fā)等提供了思路，其整體性和系統(tǒng)性的分析思想與中醫(yī)整體觀念不謀而合，因此，特別適用于中醫(yī)藥領(lǐng)域的研究。目前，關(guān)于慢性失眠的代謝組學(xué)研究很少，已有的研究以動物實驗為主，且人體代謝環(huán)境比較復(fù)雜，因此，臨床代謝組學(xué)研究尤為重要。由于男女存在顯著代謝差異，故本研究對男性和女性分別進行檢測分析，最后整合分析共同變化趨勢的代謝物質(zhì)，以期減小誤差，提高研究結(jié)果的可靠性。

1 資料與方法

1.1 病例來源 選取2019年8月—2020年12月自愿參加本研究的痰熱內(nèi)擾型慢性失眠病人36例作為慢性失眠組，選取同期健康受試者36名作為健康對照組，其中，慢性失眠組脫落3例，最終納入33例。慢性失眠組給予黃連溫膽湯免煎顆粒(組方：黃連、法半夏、竹茹、橘紅、麩炒枳實、茯神、甘草、生姜、大棗，由江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn))，每日1劑，上下午分服，治療4周。健康對照組不予干預(yù)。本研究經(jīng)中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所倫理委員會批準，所有研究對象對本研究知情同意并簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準 慢性失眠納入標準：符合慢性失眠西醫(yī)診斷標準[10]和中醫(yī)證候診斷標準[11]；Spiegel睡眠問卷總分≥9分；年齡18～70歲。健康對照組納入標準：無睡眠障礙、嚴重精神疾病及其他器質(zhì)病變；年齡18～70歲；簽署知情同意書者。

1.2.2 排除標準 不符合納入標準者；焦慮自評量表(SAS)評分≥50分，貝克抑郁自評問卷(BDI)評分≥14分，患有精神分裂癥和其他嚴重精神障礙者；其他繼發(fā)性失眠者或軀體疾病引發(fā)失眠者(如腦卒中后、帕金森病等)；妊娠或哺乳期婦女，或在接受治療過程中準備妊娠者；合并糖尿病、肝腎功能異常、免疫性疾病、代謝綜合征。

1.3 儀器與試劑 Q EXACTIVE液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)購自美國Thermo公司，ACQUITY BEH C18色譜柱購自美國Thermo公司，Millipore-Q超純水系統(tǒng)購自美國Millipore公司，DIONEX Ultimate 3000超高效液相色譜儀購自美國DIONEX公司，離心機購自德國Eppendorf公司，移液槍購自德國Eppendorf公司，渦旋混合儀購自美國Thermo公司，超低溫冰箱購自美國Thermo公司，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC/MS)級乙腈購自德國Merck公司，HPLC級甲醇購自德國Merck公司，甲酸購自德國CNW公司。

1.4 血清樣本采集與保存 于治療前后采集清晨空腹靜脈血5 mL置于真空采血管中，靜置30～60 min 后，4 ℃、3 000 r/min離心10 min。離心后取上清1 mL裝于EP管中，登記樣本信息后置于-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆茫赃M行代謝組學(xué)檢測。

1.5 液相色譜-質(zhì)譜(LC/MS)聯(lián)用分析條件

1.5.1 色譜參數(shù) 儀器名稱：DIONEX Ultimate 3000超高效液相色譜儀；色譜柱：ACQUITY BEH C18 1.7 μm，2.1 mm×50 mm；液相條件：水(含2 mmol/L甲酸銨和0.1%甲酸)，乙腈。梯度洗脫，分析時間0～18 min，進樣量5 μL，流速0.25 mL/min。

1.5.2 質(zhì)譜參數(shù) 儀器名稱：Thermo Q EXACTIVE離子源。ESI(±)監(jiān)測模式采用一級全掃描和二級數(shù)據(jù)依賴性掃描。離子源參數(shù)：電噴霧離子源ESI以正離子(ESI+)和負離子(ESI-)運行，ESI(-)噴霧電壓為2 800 V；ESI(+)噴霧電壓為3 500 V。蒸發(fā)溫度：350 ℃；鞘氣：35 Arb；輔助氣：10 Arb；毛細管溫度：320 ℃；S-lens RF：50。一級全掃描：分辨率為70 000，AGC target為1e6，Maximun TT為100 ms，掃描范圍為70～1 050 m/z。二級數(shù)據(jù)依賴性掃描：分辨率為35 000，AGC target為1e5，Maximun TT為50 ms；NCE：20 V、40 V、60 V。

1.6 樣本制備與檢測 取血清樣本50 μL加入450 μL沉淀劑(甲醇∶乙腈=1∶1)沉淀蛋白，渦旋混勻60 s后，4 ℃，10 000 r/min，離心10 min，取100 μL置于Thermo Q EXACTIVE液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)中進行LC-MS/MS分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 利用中國檢驗檢疫科學(xué)研究院自建的Tracefounder軟件對LC/MS數(shù)據(jù)進行預(yù)處理后，采用Metabo Analyst 4.0軟件進行主成分分析(PCA)和偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)構(gòu)建預(yù)測模型和尋找代謝標志物，選擇變量重要性投影(VIP)>1的代謝物作為主要的差異性內(nèi)源代謝物，選擇P>0.1的作為影響的主要代謝通路。

2 結(jié) 果

2.1 原始色譜圖的可視化檢查 對質(zhì)量控制(QC)樣品的總離子流色譜圖(TIC)進行重疊，采用一級全掃描模式，分析細胞上清液，羅列出樣本TIC圖，如圖1～圖6所示，觀察發(fā)現(xiàn)儀器的保留時間重現(xiàn)性非常好，儀器穩(wěn)定。

圖2 QC樣本負總離子流色譜圖

圖3 正離子全掃描總離子流圖

圖4 負離子全掃描總離子流圖

圖5 賴氨酸色譜圖

圖6 賴氨酸相應(yīng)的精確質(zhì)量數(shù)和分子式

2.2 慢性失眠組與健康對照組對比分析

2.2.1 多元統(tǒng)計分析 為觀察各組的分組聚類效果，將標準化后的數(shù)據(jù)進行PCA分析(見圖7、圖8)，慢性失眠組與健康對照組之間不完全重疊；再進行監(jiān)督的PLS-DA模式識別(見圖9、圖10)，慢性失眠組與健康對照組完全分離，樣本間呈現(xiàn)出良好的分類效果。

圖7 男性PCA得分圖

圖9 男性PLS-DA立體圖

圖10 女性PLS-DA立體圖

2.2.2 差異性代謝物 慢性失眠男性病人與男性健康受試者比較，共發(fā)現(xiàn)53個差異性代謝產(chǎn)物，其中28個代謝物質(zhì)上升，25個代謝物質(zhì)下降；女性慢性失眠病人與女性健康受試者比較，共發(fā)現(xiàn)48個差異性代謝產(chǎn)物，其中18個代謝物質(zhì)上升，30個代謝物質(zhì)下降。去除性別因素進行綜合分析，與健康受試者比較，男性和女性慢性失眠病人血清中均上升的代謝物質(zhì)有L-乙酰肉堿、L-亮氨酸、L-纈氨酸、溶血磷脂酰膽堿(LysoPC)[20∶3(5Z，8Z，11Z)]、LysoPC(17∶0)、組胺、磷脂酰膽堿(PC)[18∶1(9Z)/20∶4(5Z，8Z，11Z，14Z)]；下降的物質(zhì)有肌酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、鞘磷脂(SM)[d18∶0/18∶1(11Z)]、油酸、PC[18∶3(6Z，9Z，12Z)/16∶0]、二十二碳六烯酸(DHA)。

2.2.3 代謝通路 慢性失眠組男性病人代謝物質(zhì)變化涉及的代謝通路有8條，分別是：D-谷氨酰胺與D-谷氨酸代謝，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成，苯丙氨酸代謝，組氨酸代謝，精氨酸和脯氨酸代謝，色氨酸代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，甘油磷脂代謝；女性病人代謝物質(zhì)變化涉及的代謝通路有4條，分別是：組氨酸代謝，鞘氨醇代謝，色氨酸代謝，甘油磷脂代謝。詳見表1、表2。

表1 男性代謝通路分析結(jié)果

表2 女性代謝通路分析結(jié)果

2.3 黃連溫膽湯治療前后對比分析

2.3.1 多元統(tǒng)計分析 將標準化后的數(shù)據(jù)進行PCA分析，如圖11、圖12所示，各組樣本間尚未完全分離；再做監(jiān)督的PLS-DA模式識別，得到PLS-DA得分圖見圖13、圖14，治療后與健康組分離，治療前后樣本間尚未完全分離。

圖11 男性PCA得分圖

圖12 女性PCA得分圖

圖13 男性PLS-DA立體圖

圖14 女性PLS-DA立體圖

2.3.2 差異性代謝物 與治療前比較，慢性失眠組男性病人經(jīng)黃連溫膽湯治療后共發(fā)現(xiàn)30個差異性代謝產(chǎn)物，其中13個代謝物質(zhì)上升，17個代謝物質(zhì)下降；而女性病人經(jīng)治療后共發(fā)現(xiàn)39個差異性代謝產(chǎn)物，其中18個代謝物質(zhì)上升，21個代謝物質(zhì)下降。去除性別因素分析，經(jīng)黃連溫膽湯治療后，男性和女性病人血清中均上升的物質(zhì)有：LysoPC[18∶2(9Z，12Z)]、LysoPC[20∶4(8Z，11Z，14Z，17Z)]、LysoPC[18∶1(11Z)]、L-苯丙氨酸、L-亮氨酸、肌酸、L-色氨酸；下降的物質(zhì)有：PC[16∶1(9Z)/20∶3(8Z，11Z，14Z)]、PC[16∶1(9Z)/22∶2(13Z，16Z)]、L-肉堿、SM[d18∶0/18∶1(11Z)]、PC[18∶1(9Z)/20∶4(5Z，8Z，11Z，14Z)]、SM[d18∶0/16∶1(9Z)]、PC[o-16∶1(9Z)/20∶4(8Z，11Z，14Z，17Z)]、2-羥基丁酸、L-乙酰肉堿、SM(d18∶1/16：0)。

2.3.3 代謝通路 慢性失眠男性病人治療前后代謝物質(zhì)變化涉及的代謝通路有5條，分別是：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成，苯丙氨酸代謝，組氨酸代謝，色氨酸代謝，甘油磷脂代謝。女性病人治療前后代謝物質(zhì)變化涉及的代謝通路有3條，分別是苯丙氨酸代謝、鞘脂類代謝和甘油磷脂代謝。詳見表3、表4。

表3 男性代謝通路分析結(jié)果

表4 女性代謝通路分析結(jié)果

3 討 論

3.1 磷脂代謝分析 神經(jīng)細胞由磷脂所構(gòu)成的細胞薄膜包覆，在促進神經(jīng)傳導(dǎo)和大腦活動、增強記憶力、促進脂肪代謝等方面有重要作用。機體中主要含有甘油磷脂和鞘磷脂(sphingomyelin，SM)兩大類磷脂，其中，甘油磷脂最主要的成分是磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine，PC)。PC與人體內(nèi)的神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)有關(guān)，通過磷脂酶A2的催化作用降解為LysoPC，部分PC是炎癥的重要生物標志物[12]。LysoPC作為趨化介質(zhì)，可通過特異性G蛋白偶聯(lián)受體對免疫細胞活化的修飾來參與炎癥過程，有報道稱LPC可作為肺炎的診斷和預(yù)后重要的評價指標[13]。SM、PC、LPC均含膽堿，膽堿和乙酰輔酶A在膽堿乙酰移位酶的催化作用下合成乙酰膽堿。乙酰膽堿不僅是與神經(jīng)興奮的傳導(dǎo)、學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)，而且與睡眠的調(diào)節(jié)密切相關(guān)[14]。乙酰膽堿是快速眼動睡眠調(diào)節(jié)模型中的關(guān)鍵成分[15]，而在睡眠早期，由于乙酰膽堿的減少，增加的慢波活性有助于運動記憶的鞏固[16]。

從現(xiàn)代生物學(xué)視角來看，中醫(yī)學(xué)中“痰”的物質(zhì)基礎(chǔ)以脂質(zhì)代謝為主，“熱”與炎癥相關(guān)。在本研究中，慢性失眠病人血清差異性代謝物中，磷脂類代謝物數(shù)目最多，同時LysoPC、PC參與炎癥過程，與病人表現(xiàn)出的痰熱證癥狀相吻合。經(jīng)黃連溫膽湯干預(yù)后，慢性失眠病人血清內(nèi)PC、LysoPC、SM等脂類物質(zhì)發(fā)生改變，因此，黃連溫膽湯通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝發(fā)揮干預(yù)作用。

3.2 氨基酸代謝分析 色氨酸是一種可通過血腦屏障的必需氨基酸，分為L-色氨酸和D-色氨酸，D-色氨酸不能被生物體利用。體內(nèi)色氨酸代謝異常，會引起神經(jīng)系統(tǒng)的功能障礙，導(dǎo)致失眠的發(fā)生[17]。作為最重要的神經(jīng)遞質(zhì)之一的5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)，是由色氨酸在色氨酸羥化酶及五羥色氨酸脫羧酶的作用下生成的。5-HT在大腦皮層和神經(jīng)突觸內(nèi)含量最多，能維持慢波睡眠，同時5-HT能神經(jīng)元可促使具有催眠效應(yīng)的肽類物質(zhì)的累積[18-19]。研究顯示，給SD大鼠注射氯苯丙氨酸混懸液復(fù)制失眠模型，1周后大鼠外周血清5-HT含量明顯下降，然而單獨使用5-羥色氨酸后，可產(chǎn)生催眠作用[20-21]。本研究結(jié)果呈現(xiàn)慢性失眠病人色氨酸水平下降，可能導(dǎo)致5-HT合成減少，從而產(chǎn)生睡眠障礙。

苯丙氨酸屬芳香族氨基酸，具有生物活性的光學(xué)異構(gòu)體為L-苯丙氨酸，苯丙氨酸在苯丙氨酸羥化酶的催化下形成酪氨酸，并與酪氨酸一起合成與失眠密切相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺(dopamine，DA)和去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)。中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)具有調(diào)控興奮和鎮(zhèn)靜的雙重作用，失眠障礙病人存在腦內(nèi)多巴胺D2神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)異常，睡眠相關(guān)多巴胺神經(jīng)通路包括伏隔核、尾狀核、殼核，多巴胺D2受體結(jié)合力降低，且多巴胺D2受體結(jié)合力下降與失眠障礙病程相關(guān)[22]。當雙側(cè)藍斑尾部受損時，NE分泌明顯減少，快速眼動睡眠完全不能進行，導(dǎo)致睡眠障礙[23]。本研究中慢性失眠病人苯丙氨酸較健康受試者降低，可能使多巴胺、NE的合成減少，從而影響睡眠。

纈氨酸、亮氨酸均是生糖氨基酸，可以通過代謝轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟菫闄C體提供能量，同時二者作為支鏈氨基酸，可以增加肌肉量、緩解疲勞。與健康對照組比較，慢性失眠病人血清代謝物中纈氨酸、亮氨酸升高，可能是機體的代償反應(yīng)所導(dǎo)致，還需進一步研究。

綜上所述，慢性失眠病人存在顯著的氨基酸代謝紊亂，經(jīng)黃連溫膽湯治療后，苯丙氨酸、色氨酸水平上升，說明黃連溫膽湯可通過調(diào)節(jié)氨基酸代謝發(fā)揮干預(yù)作用。

3.3 能量代謝分析 肌酸廣泛分布于大腦、心肌等組織中，當體內(nèi)三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)充足時，可在肌酸磷酸激酶的作用下促使ATP中的高能磷酸鍵基團轉(zhuǎn)移到肌酸分子中形成磷酸肌酸。磷酸肌酸是腦、神經(jīng)等組織儲能的主要形式，肌酸可以通過穩(wěn)定線粒體過渡孔，并且通過增加谷氨酸重攝取起神經(jīng)保護作用[24]，可見磷酸肌酸和肌酸在腦能量代謝中發(fā)揮十分重要的作用。研究表明，失眠病人腦內(nèi)肌酸濃度降低[25]。本研究中，慢性失眠病人血清代謝物肌酸水平降低，表明機體能量代謝發(fā)生異常，或可解釋慢性失眠病人出現(xiàn)大腦昏沉不清、精神狀態(tài)差等日間癥狀。

肉堿作為有機酸和脂肪酸的中間代謝產(chǎn)物，廣泛存在于骨骼肌、心肌等組織中。肉堿有兩個立體異構(gòu)，包括有生物活躍的L-肉堿及其非生物活躍的對映異構(gòu)體D-肉堿。L-肉堿是一種促使脂肪轉(zhuǎn)化為能量的類氨基酸，能夠促進脂肪酸進入線粒體氧化分解。L-乙酰肉堿是L-肉堿的乙?；问?，L-乙酰肉堿可以提供一個乙?；糠?，被氧化產(chǎn)生能量，用作乙酰膽堿的前體，或被并入谷氨酸、谷氨酰胺和γ-氨基丁酸，或被并入脂質(zhì)，用于髓鞘形成和細胞生長[26-27]。可見，L-肉堿和L-乙酰肉堿在促進脂肪代謝和能量產(chǎn)生的過程中發(fā)揮著重要作用。本研究結(jié)果顯示，無論是男性病人還是女性病人，L-乙酰肉堿水平均上升、肌酸水平下降，提示慢性失眠病人體內(nèi)存在能量代謝障礙，脂肪酸代謝供能增加。經(jīng)黃連溫膽湯干預(yù)后，慢性失眠病人血清內(nèi)L-乙酰肉堿及L-肉堿下降，肌酸水平上升，因此，黃連溫膽湯通過調(diào)節(jié)能量代謝發(fā)揮干預(yù)作用。

3.4 脂肪酸代謝分析 油酸是一種單不飽和脂肪酸，與氨經(jīng)脂肪酸酞胺水解酶催化合成油酰胺，其具有催眠活性，其在腦中含量與睡眠周期密切相關(guān)，缺乏睡眠時濃度增加，恢復(fù)睡眠時濃度減小[28-29]。DHA屬于ω-3不飽和脂肪酸，在神經(jīng)細胞中的濃度最高，因其對腦的發(fā)育具有重要作用，故稱之為“腦黃金”。DHA具有促進神經(jīng)細胞生長、改善認知功能、抑制氧化應(yīng)激、提高免疫力等多種作用[30-32]，同時還能增強學(xué)習(xí)記憶能力[33]。海馬是調(diào)控學(xué)習(xí)、記憶、情感等活動的重要腦區(qū)。陳超剛等[34]通過體外培養(yǎng)細胞試驗對比發(fā)現(xiàn)，DHA促進海馬神經(jīng)細胞生長發(fā)育。本研究中，慢性失眠病人油酸和DHA下降，脂肪酸代謝異常，其中DHA下降，或可解釋臨床中慢性失眠病人出現(xiàn)記憶力下降、注意力不集中等認知障礙癥狀。

4 小 結(jié)

慢性失眠的發(fā)病機制很復(fù)雜，目前的研究多以局部或者靶點研究為主，僅從某一方面或單系統(tǒng)的研究往往不能解釋整體現(xiàn)象。本研究基于代謝組學(xué)進行整體、系統(tǒng)的研究，為尋找痰熱內(nèi)擾型慢性失眠的生物標志物以及黃連溫膽湯的治療機制提供了一定的參考價值。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，痰熱內(nèi)擾型慢性失眠病人體內(nèi)存在磷脂代謝、氨基酸代謝、能量代謝、脂肪酸代謝異常，經(jīng)黃連溫膽湯治療后，血清代謝物L(fēng)-苯丙氨酸、L-色氨酸、肌酸、L-乙酰肉堿及PC[18∶1(9Z)/20∶4(5Z，8Z，11Z，14Z)]回調(diào)，說明黃連溫膽湯對痰熱內(nèi)擾慢性失眠干預(yù)作用與調(diào)節(jié)氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝、能量代謝有關(guān)。