孫優(yōu)蘭，黃永光*，胡 峰，程平言，尤小龍，陸倫維

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025；2.貴州茅臺(tái)酒廠（集團(tuán)）習(xí)酒有限責(zé)任公司，貴州 遵義 564622）

醬香型白酒是我國三大傳統(tǒng)香型白酒中風(fēng)味極其復(fù)雜而獨(dú)特的酒種，其生產(chǎn)過程中的原酒或基酒常伴有缺陷特征，使酒體香氣和口感平衡失調(diào)，其中生青味則是酒體中常見的一種異嗅味，且還伴有口感微澀等特征[1]。對(duì)黃酒異嗅味的研究結(jié)果表明[2]，導(dǎo)致該特征缺陷酒體的主要原因是釀酒原料中蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的氨基酸態(tài)氮含量過高，從而導(dǎo)致大量的高級(jí)醇（雜醇）、醛、酮等物質(zhì)生成，進(jìn)而形成“生青味”缺陷特征，但并未具體說明是哪些物質(zhì)，同時(shí)，在白酒研究領(lǐng)域也鮮見該缺陷特征的相關(guān)研究及其報(bào)道。生產(chǎn)實(shí)踐表明生青味的出現(xiàn)不僅嚴(yán)重影響產(chǎn)品質(zhì)量，給企業(yè)造成經(jīng)濟(jì)損失，甚至還一定程度上制約了白酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

感官風(fēng)味是評(píng)價(jià)白酒品質(zhì)的重要指標(biāo)，且通過結(jié)合儀器分析對(duì)醬香型白酒中異嗅味化合物的研究是認(rèn)識(shí)酒體缺陷和提升質(zhì)量的重要前提和途徑。近年來，喬敏莎[3]采用感官品評(píng)結(jié)合頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）確定了醬香型白酒中的臭味物質(zhì)；王尹葉等[4]采用感官導(dǎo)向結(jié)合GC-MS分析方法成功建立了一種白酒中揮發(fā)性苦味和澀味化合物的提取、分離和鑒定方法；趙騰飛等[5-7]采用味覺稀釋分析感官強(qiáng)度為導(dǎo)向結(jié)合儀器分析分離鑒定了醬香型白酒中的后鼻嗅糊味化合物和苦味化合物?？梢姡S著科技發(fā)展和行業(yè)研究人員的努力，在醬香型白酒異嗅味化合物研究方面取得較多研究成果，但就目前的研究進(jìn)展而言，存在研究手段較為單一，且目前研究僅涉及鹽菜味、泥臭味、糊味酒體，生青味、餿味、油味等酒體的異嗅味鮮見相關(guān)報(bào)道，同時(shí)對(duì)于異嗅味缺陷酒，可能存在多種呈異嗅味的成分，并且由多種風(fēng)味化合物互作導(dǎo)致，一定程度上使科研工作者在克服儀器設(shè)備、技術(shù)方法等困難的同時(shí)對(duì)醬香型白酒異嗅味化合物的研究仍然停留在客觀層面，給異嗅味物質(zhì)的形成機(jī)制認(rèn)識(shí)及其相關(guān)研究帶來較大困難。

代謝組學(xué)在醫(yī)學(xué)[8]、營養(yǎng)科學(xué)[9]、毒理學(xué)[10]等方面廣泛應(yīng)用。該方法首先利用高通量、高靈敏度、高分辨率的實(shí)驗(yàn)儀器定性定量分析樣品中所有的小分子物質(zhì)，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析方法，從海量數(shù)據(jù)中比較分析出有意義的標(biāo)記物，最后再對(duì)該標(biāo)記物進(jìn)行驗(yàn)證、解釋和分析[11]。目前，廣泛應(yīng)用于代謝組學(xué)數(shù)據(jù)采集的技術(shù)平臺(tái)有GC-MS[12]、液相色譜-質(zhì)譜[13]、核磁共振[14]技術(shù)等，其中GC-MS和液相色譜-質(zhì)譜具有靈敏度高、選擇性好、通量高等優(yōu)勢(shì)[15]。截至2013年，“酒代謝組學(xué)”[16]的出現(xiàn)說明代謝組學(xué)已經(jīng)成功應(yīng)用于酒類研究領(lǐng)域，且基于非靶向和靶向代謝組學(xué)的研究思路和技術(shù)正在為酒類風(fēng)味物質(zhì)的新發(fā)現(xiàn)提供一條快捷便利的通道[17]。

基于此，本研究擬對(duì)醬香型白酒中的生青味缺陷酒展開研究，以非靶向代謝組學(xué)和感官風(fēng)味為導(dǎo)向的研究策略為指導(dǎo)，借助儀器分析和化學(xué)計(jì)量學(xué)工具為輔助，全面解析醬香生青缺陷酒樣中的特征風(fēng)味化合物結(jié)構(gòu)，以正常風(fēng)味酒樣為對(duì)照，對(duì)生青缺陷酒體特征風(fēng)味化合物進(jìn)行差異統(tǒng)計(jì)及正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discrimination analysis，OPLS-DA），以期找出目標(biāo)差異特征化合物，為醬香型白酒品質(zhì)提升提供科學(xué)依據(jù)。同時(shí)基于該研究方法的建立，為醬香型白酒中異嗅味的研究提供了重要思路，還對(duì)明晰醬香型白酒的特征風(fēng)味，以及食品體系中符合復(fù)合型特征風(fēng)味的解析提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒樣：生青味基酒（SQ）、正常味基酒（ZC）樣品均采自XJ公司，在感官初篩的基礎(chǔ)上挑選出3個(gè)生青味酒樣和3個(gè)正常味酒樣（乙醇體積分?jǐn)?shù)53%，500 mL/個(gè)）。所采集酒樣均統(tǒng)一置于10 ℃以下干燥貯存，待測(cè)。

正構(gòu)烷烴混合標(biāo)準(zhǔn)品（C7～C40）、2-辛醇、乙醇、2-乙基丁酸、乙酸正戊酯、乙酸乙酯、丙酸乙酯、正丙醇、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、辛酸乙酯、糠醛、2-乙?；秽?、苯甲醛、5-甲基-2-乙?；秽?、癸酸乙酯、3-甲基丁酸、苯甲酸乙酯、3-甲硫基-1-丙醇、2-苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯甲醇、苯乙醇、苯酚、苯乙醛、2,3-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2-庚醇、乳酸乙酯、正庚醇、丁二酸二乙酯、正丁醇、2-丁醇、正戊醇、2-戊醇、丙醇、棕櫚酸乙酯、油酸乙酯、亞油酸乙酯（分析級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品，純度均大于98%） 上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；超純水由實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2 儀器與設(shè)備

GC 7890-5975 MSD GC-MS聯(lián)用儀 美國安捷倫公司；MPS2型多功能自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng) 德國Gerstel公司；50/30 μm二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷萃取頭 美國Supelco公司；SB25-12DT超聲波清洗器寧波新芝生物科技股份有限公司；Aquaplore3S超純水系統(tǒng) 美國艾科浦公司；AR2130/C電子天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 感官品評(píng)小組的建立

根據(jù)文獻(xiàn)[18]方法，建立醬香酒體感官品評(píng)小組，各成員均具有2 a以上的品評(píng)訓(xùn)練經(jīng)驗(yàn)，且均通過基本味覺測(cè)試和嗅味標(biāo)度測(cè)試、差別檢驗(yàn)及嗅味描述檢驗(yàn)，最終選擇敏感度和識(shí)別能力較強(qiáng)的品評(píng)員構(gòu)成最終的品評(píng)小組。小組成員共18 人，年齡在20～45 歲之間，其中3 名具有10 a以上白酒品評(píng)經(jīng)驗(yàn)的教師（國家評(píng)委、省級(jí)評(píng)委、國家一級(jí)品酒師），研究生7 人，另外8 人為XJ公司嘗評(píng)工作室人員，均具有國家一級(jí)品酒師以上資質(zhì)。0～5 分制，0 分代表無明顯感官強(qiáng)度，5 分代表強(qiáng)烈感知。

1.3.2 真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)

取200 mL缺陷酒樣置于1 000 mL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中進(jìn)行真空旋轉(zhuǎn)蒸餾，設(shè)置水浴加熱溫度45 ℃，真空度0.085～0.095 MPa，蒸餾至5 min內(nèi)沒有液體滴出記為蒸餾結(jié)束，收集得到揮發(fā)性組分與難揮發(fā)性組分，并將收集組分復(fù)溶至原始乙醇體積分?jǐn)?shù)，用于感官品評(píng)。

1.3.3 基于感官導(dǎo)向的異嗅味組分分離提取方法

參考Wang Li等[19]的方法，并適當(dāng)調(diào)整。50 mL揮發(fā)性組分用去離子水稀釋至乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%，加入3 g NaCl至飽和。60 mL乙醚萃取3 次，靜置分層后取上層萃取液，合并3 次萃取液并記為萃取相I。萃取相I將進(jìn)一步分離成酸性、中堿性、水溶性3個(gè)組分。

50 mL飽和去離子水加入到萃取相I中，以25% NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至10，待靜置分層，然后分離保存。其中，上層組分記為萃取相II，下層組分記為水相I。以25% NaOH溶液調(diào)節(jié)水相I pH值至2，并加入3 g NaCl飽和，然后用40 mL乙醚萃取3 次，靜置分層后取上層有機(jī)相保存并記為萃取相III，將萃取相III用適量無水Na2SO4進(jìn)行干燥過夜，得到酸性組分。20 mL飽和去離子水水洗萃取相II，靜置分層后分離得到上層組分記為萃取相IV，下層組分記為水相II，將萃取相IV利用無水Na2SO4進(jìn)行干燥過夜，得到中/堿性組分。水相II加入3 g NaCl進(jìn)行飽和，然后用40 mL乙醚萃取3 次，分離得到上層組分記為萃取相V，然后無水Na2SO4進(jìn)行干燥過夜，得到水溶性組分。

將收集得到的3種有機(jī)相組分分別平均分成2 份，一份氮吹濃縮至250 μL，保存于4 ℃冰箱中直至檢測(cè)。另一份加入20 mL去離子水進(jìn)行水洗，并使用真空旋蒸蒸發(fā)去除多余的有機(jī)溶劑，再加入10 mL 53%乙醇溶液，用于感官品評(píng)，最終選擇異嗅味強(qiáng)度較大的亞組分進(jìn)行GC-MS檢測(cè)分析。以上感官評(píng)定均采用定量描述性分析方法進(jìn)行六點(diǎn)刻度法（0～5 分）定量分析，通過3 次以上重復(fù)嗅聞打分，最終以評(píng)分均值為其結(jié)果。

1.3.4 檢測(cè)條件

GC條件：DB-FFAP色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；GC檢測(cè)器和進(jìn)樣口溫度為250 ℃；不分流進(jìn)樣；氦氣作為載氣，流量2 mL/min；程序升溫：色譜柱初溫40 ℃維持2 min，以3 ℃/min升溫到110 ℃，再以3.5 ℃/min升溫至230 ℃，并保持該溫度15 min。

MS條件：電子電離源；離子源溫度230 ℃；電子能量70 eV；四極桿溫度150 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z25～550。

1.3.5 定性分析

利用Agilent ChemStation將原始數(shù)據(jù)依次進(jìn)行去除噪音、基線矯正和峰面積積分等步驟，并轉(zhuǎn)換成統(tǒng)一識(shí)別格式（.csv），利用NIST 11a. L譜庫檢索、標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)，并結(jié)合保留指數(shù)（retention index，RI）進(jìn)行揮發(fā)性化合物的定性。RI定性：根據(jù)改進(jìn)的Kovats法[20]計(jì)算RI，C7～C40正構(gòu)烷烴在與酒樣相同的色譜條件下進(jìn)樣分析，通過保留時(shí)間計(jì)算未知化合物的RI，按式（1）計(jì)算：

式中：n和n+1分別為未知物流出前后正構(gòu)烷烴碳原子數(shù)；tn和t（n+1）分別為相應(yīng)正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間/min；ti為未知物的保留時(shí)間（tn＜ti＜t（n+1））。

1.3.6 定量分析

有標(biāo)樣的化合物用全定量，無標(biāo)樣的化合物采用內(nèi)標(biāo)法定量。

標(biāo)準(zhǔn)曲線定量：配制體積分?jǐn)?shù)10%乙醇溶液，經(jīng)NaCl飽和、稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值之后，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線模型溶液，加入已知濃度待測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，并進(jìn)行梯度稀釋，制成系列待檢標(biāo)準(zhǔn)化合物溶液。加入同樣品一致的混合內(nèi)標(biāo)溶液（2-辛醇、乙酸正戊酯、2-乙基丁酸），進(jìn)行GC-MS檢測(cè)分析，檢測(cè)條件與前述一致。采用選擇特征離子法掃描進(jìn)行測(cè)定。其中，酸類物質(zhì)和醇類物質(zhì)分別由2-乙基丁酸和2-辛醇計(jì)算得出定量結(jié)果，酯類及其他成分由乙酸正戊酯計(jì)算得出定量結(jié)果。最后，以待測(cè)物與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積比為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度比為橫坐標(biāo)，使用Agilent ChemStation建立內(nèi)標(biāo)曲線并計(jì)算每種化合物的質(zhì)量濃度。同時(shí)以信噪比大于3時(shí)的質(zhì)量濃度為檢出限，信噪比大于10時(shí)的質(zhì)量濃度為定量限。

內(nèi)標(biāo)法定量：通過計(jì)算內(nèi)標(biāo)物的峰面積和樣品中各組分的峰面積比值，從而定量出各個(gè)風(fēng)味成分的含量，每個(gè)組分測(cè)定3 次取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)相關(guān)分析及圖像處理采用SPSS、R語言、SIMCA-P、Adobe AI軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 生青味缺陷酒體的感官特征

采用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)方法將200 mL樣品進(jìn)行預(yù)分離，得到揮發(fā)性組分和非揮發(fā)組分，同時(shí)進(jìn)行感官品評(píng)，結(jié)果如表1所示。

表1 低溫減壓蒸餾分離組分感官品評(píng)Table 1 Sensory evaluation of fractions from gradient vacuum distillation

由表1可知，3個(gè)生青味缺陷型酒樣品在揮發(fā)性組分中感官品評(píng)結(jié)果均大于3.6 分，可初步鎖定導(dǎo)致該缺陷產(chǎn)生的特征風(fēng)味化合物主要存在于揮發(fā)性組分中。進(jìn)一步對(duì)預(yù)分離得到的揮發(fā)性組分采用乙醚溶劑萃取，分離得到酸性組分、中/堿性組分和水溶性組分，對(duì)其進(jìn)行感官品評(píng)，結(jié)果如表2所示。

表2 乙醚溶劑萃取組分感官品評(píng)Table 2 Sensory evaluation of fractions from diethyl ether extraction

在預(yù)分離的基礎(chǔ)上采用乙醚進(jìn)行萃取，可進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)異嗅味化合物的分離。由表2可知，生青味主要存在于中/堿性亞組分中，而在酸性和水溶性組分中均沒有感知到，說明溶劑萃取可以縮小異嗅味化合物的檢測(cè)范圍，同時(shí)進(jìn)一步對(duì)中/堿性組分進(jìn)行儀器分析，有助于解析生青味缺陷特征的化學(xué)組成。

2.2 生青味缺陷酒體風(fēng)味化合物結(jié)構(gòu)

GC-MS檢測(cè)圖譜經(jīng)提取和匹配后，通過非靶向代謝組質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫比對(duì)、標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)和RI鑒定，以及課題組前期研究工作的基礎(chǔ)上，最后在生青味缺陷酒分離的中/堿性組分中共鑒定出94 種風(fēng)味化合物，其中包括酯類37 種，醇類15 種，醛酮類5 種，呋喃類5 種，苯環(huán)類18 種，吡嗪類4 種，以及一些雜環(huán)類、烷烴類和其他類化合物10 種。對(duì)這些化合物進(jìn)行種類及含量的比較統(tǒng)計(jì)分析，如圖1所示。

圖1 GC-MS定性定量生青味缺陷酒中的揮發(fā)性化合物Fig. 1 Volatile compounds in Baijiu with green off-flavor identified by GC-MS

酯類化合物是白酒中重要的一類骨架成分，該類化合物既能通過生物代謝途徑產(chǎn)生（如梭菌、釀酒酵母等微生物的代謝），又能通過非生物途徑產(chǎn)生（如酸和醇的酯化反應(yīng)）[21-22]。根據(jù)統(tǒng)計(jì)，3個(gè)生青味缺陷酒（SQ1、SQ2和SQ3）中的酯類化合物種類分別為48、51 種和46 種，質(zhì)量濃度分別為2 308.31、1 916.22 mg/L和2 136.87 mg/L，占風(fēng)味化合物總含量的53.67%、40.03%和47.07%。進(jìn)一步分析顯示，3個(gè)樣品中質(zhì)量濃度均較高的酯類主要有乳酸乙酯（1 006.24～1 035.78 mg/L）、乙酸乙酯（580.47～1 070.26 mg/L）、2-糠酸乙酯（66.44～9.26 mg/L）和棕櫚酸乙酯（43.42～43.79 mg/L）等。其中，棕櫚酸乙酯是白酒中常見的三大高級(jí)脂肪酸乙酯之一，含量過高，則會(huì)引起白酒渾濁，過低的酒體余味不足，但該物質(zhì)與酒體中其他風(fēng)味成分的相互作用還有待進(jìn)一步研究。本研究檢出的2-糠酸乙酯在白酒中為首次檢出，文獻(xiàn)資料表明，該物質(zhì)具有似青蘋果、獼猴桃的香氣，常于果酒中檢出[23]，但其對(duì)白酒的風(fēng)味品質(zhì)影響還需進(jìn)一步研究。此外，在本研究中首次檢出的酯類還有DL-2-己酸乙酯（33.31～43.29 mg/L）和甲氧基乙酸-3-甲基丁酯（4.63～5.85 mg/L），該2 種化合物的風(fēng)味貢獻(xiàn)未知，本課題組正在開展相關(guān)研究。

醇類化合物是白酒中醇甜和助香的重要成分，主要通過釀酒酵母發(fā)酵代謝以及蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生[24]。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)3個(gè)生青缺陷酒中定量檢出該類化合物種類分別為21、21 種和20 種，質(zhì)量濃度分別為1 382.51、2 208.05 mg/L和1 779.19 mg/L，分別占風(fēng)味化合物總含量的32.15%、46.13%和39.19%。3個(gè)樣品中質(zhì)量濃度均較高的醇類化合物主要包括異戊醇（728.02～1 128.87 mg/L）、正丙醇（373.87～543.93 mg/L）、異丁醇（194.61～328.74 mg/L）和正丁醇（36.95～108.21 mg/L）等，且上述這幾種物質(zhì)均以SQ2中質(zhì)量濃度最高。

檢出芳香族類化合物種類僅次于酯類化合物，3個(gè)生青缺陷酒中分別檢出芳香族化合物23、23種和20 種。雖然該類化合物在白酒中含量較低，但它們香味突出，對(duì)白酒風(fēng)格特征的形成具有重要貢獻(xiàn)作用[25]。通過定量發(fā)現(xiàn)生青缺陷酒中檢出芳香族類化合物質(zhì)量濃度分別為104.75、132.33 mg/L和114.65 mg/L，相對(duì)含量占比分別僅為2.43%、2.76%和2.52%。其中，質(zhì)量濃度均較高的主要有苯乙醇（347.88～349.00 mg/L）、苯乙酸乙酯（26.73～38.63 mg/L）以及苯甲醛（7.28～118.58 mg/L）等。

醛酮類化合物主要來源于脂肪氧化和氨基酸降解[26]。在生青缺陷酒中檢出質(zhì)量濃度主要分布于5.64～11.77 mg/L，占風(fēng)味物質(zhì)總含量的0.12%～0.25%。質(zhì)量濃度較高的主要有環(huán)戊酮（2.09～3.44 mg/L）、苯基丙酮（0.83～1.23 mg/L）以及2-庚酮（0.68～1.34 mg/L）。吡嗪類化合物是醬香型白酒中種類和含量均較高的一類化合物[21]。在生青味缺陷酒中檢出質(zhì)量濃度主要在8.89～13.64 mg/L之間，占風(fēng)味化合物總含量的0.19%～0.31%。其中，質(zhì)量濃度較高的主要有2,6-二甲基吡嗪（2.48～2.84 mg/L）、2-乙基-6-甲基吡嗪（3.16～3.84 mg/L）、2,3,5-三甲基吡嗪（2.10～2.69 mg/L）；呋喃類化合物中以糠醛（451.58～464.56 mg/L）含量最高，其次為五甲基呋喃醛（9.92 mg/L左右）。

2.3 生青味缺陷酒體與正常味酒體之間的異同

為更深入解析醬香生青缺陷酒的風(fēng)味結(jié)構(gòu)特征，選取同一批次生產(chǎn)的3個(gè)相應(yīng)正常酒樣在相同條件下進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)分析，其定性定量結(jié)果作為生青味缺陷酒的對(duì)照，采用Venn及聚類熱圖進(jìn)行比較分析，如圖2所示。

3個(gè)正常酒樣中定性定量檢出共有化合物90 種，與生青味缺陷酒對(duì)比發(fā)現(xiàn)（圖2a），2 種類別樣品之間檢出風(fēng)味成分共計(jì)126 種，其中共有風(fēng)味成分58 種，質(zhì)量濃度均較高的成分主要有乳酸乙酯、乙酸乙酯、異戊醇、正丙醇、異丁醇、正丁醇、糠醛等，同時(shí)發(fā)現(xiàn)生青味缺陷酒中異戊醇（928.44 mg/L）、異丁醇（261.67 mg/L）、糠醛（458.07 mg/L）、棕櫚酸乙酯（43.60 mg/L）以及油酸乙酯（4.66 mg/L）等化合物含量遠(yuǎn)高于正常酒；生青味缺陷酒中檢出特征性成分36 種，質(zhì)量濃度較高的主要有2-糠酸乙酯、DL-2-己酸乙酯以及2-羥基-3-甲基丁酸乙酯等，但對(duì)這些物質(zhì)的香味作用還需進(jìn)一步研究。

圖2 生青味缺陷酒與正常酒之間的統(tǒng)計(jì)分析Fig. 2 Statistical analysis of unique and shared flavor compounds between Baijiu with green off-flavor and normal Baijiu

在組學(xué)研究中，聚類熱圖通常作為對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分布情況進(jìn)行分析的直觀可視化方法，可用于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制和差異數(shù)據(jù)的具象化展示?；诖?，采用無監(jiān)督聚類熱圖統(tǒng)計(jì)比較分析生青味缺陷酒與正常酒中風(fēng)味化合物之間的相似度和差異，如圖2b所示。生青味缺陷酒與正常酒樣被顯著分成2 大類，表明生青味缺陷酒與正常酒樣風(fēng)味化合物含量間存在顯著差異；且各樣品的3個(gè)平行檢測(cè)均分別聚類，說明本研究的實(shí)驗(yàn)條件以及儀器具有較好的穩(wěn)定性。本研究結(jié)果可以說明酒體中風(fēng)味化合物含量差異對(duì)于酒體風(fēng)格、品質(zhì)具有重要的影響，因此，也為后續(xù)的代謝組學(xué)分析提供了前提基礎(chǔ)。

2.4 生青味缺陷酒體中的目標(biāo)差異代謝化合物

作為組學(xué)分析思路的一種，OPLS-DA可以實(shí)現(xiàn)對(duì)2 組數(shù)據(jù)的全譜分析，以最大化地凸顯模型內(nèi)部不同組別之間的差異，同時(shí)還可以利用不同算法，對(duì)模型進(jìn)行優(yōu)化。因此，為進(jìn)一步探討生青味缺陷酒中的目標(biāo)異嗅味化合物，本研究進(jìn)一步對(duì)生青味缺陷酒與正常味酒的全面定量分析結(jié)果進(jìn)行有監(jiān)督的OPLS-DA，如圖3所示。判別模型中R2和Q2分別表示在隨機(jī)化Y變量模型下對(duì)數(shù)據(jù)的解釋程度和對(duì)模型的預(yù)測(cè)能力，通過計(jì)算，本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚏2=0.862，Q2=0.99，說明該模型對(duì)醬香型白酒生青風(fēng)味品質(zhì)的擬合效果較好。

圖3 生青味缺陷酒與正常酒的OPLS-DAFig. 3 OPLS-DA of differential flavor compounds between Baijiu with green off-flavor and normal Baijiu

由圖3a可知，生青味缺陷酒樣品位于X軸的左側(cè)，正常酒樣品位于X軸的右側(cè)，2 種樣品有明顯分區(qū)，說明生青味缺陷酒與正常酒之間風(fēng)味化合物具有明顯差異，與聚類熱圖統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果一致。兩者之間的目標(biāo)差異性成分通過變量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）值及S-line圖表現(xiàn)，當(dāng)VIP值大于1認(rèn)為是生青味缺陷酒的差異性化合物，而S-line圖則可直觀地表現(xiàn)差異化合物，如圖3b所示，其中Y軸分為上下兩部分，上部分表示為生青味缺陷酒中化合物含量相對(duì)于正常酒偏大，下部分則表示化合物含量相對(duì)于正常酒偏小，而峰的高低則與VIP值大小一致，峰越高，VIP值則越大。根據(jù)前述方法篩選得到的生青味缺陷酒差異化合物見表3，共得到15個(gè)目標(biāo)差異成分，主要為醇類及酯類化合物。根據(jù)S-line圖并結(jié)合表3可知，在生青味缺陷酒中含量偏大的化合物主要有乳酸乙酯（VIP=4.364 89）、異戊醇（VIP=3.630 36）、糠醛（VIP=3.364 37）、2-糠酸乙酯（VIP=2.467 92）、異丁醇（VIP=1.919 03）、DL-2-己酸乙酯（VIP=1.728 04）以及棕櫚酸乙酯（VIP=1.384 72）。文獻(xiàn)[27]表明，乳酸乙酯、異戊醇、異丁醇以及糠醛是酒體中苦味和澀味關(guān)鍵貢獻(xiàn)化合物，含量越高，則酒體越加苦澀，因此，進(jìn)一步可以說明這幾種化合物可能是導(dǎo)致生青味酒體伴有苦澀特征的重要因素；根據(jù)對(duì)啤酒和葡萄酒中生青味的研究報(bào)道[2,28-32]，以異丁醇、異戊醇為代表的高級(jí)醇類和以乙醛為代表的醛類是構(gòu)成酒體生青味缺陷特征的重要因素；同樣，相關(guān)研究[31]也發(fā)現(xiàn)通過發(fā)酵控制醇類和酯類的含量可以明顯改善酒體中的生青味缺陷。因此，在其他類型酒體的研究基礎(chǔ)上，可助力推測(cè)本研究中上述酯類和醇類化合物可能是造成醬香型白酒中生青味缺陷特征產(chǎn)物的原因。同時(shí)，值得一提的是，2-糠酸乙酯和DL-2-己酸乙酯作為生青味缺陷酒中新檢出的風(fēng)味化合物，它們對(duì)生青味缺陷特征的影響還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。在生青味缺陷酒中含量偏小的化合物主要有1-乙氧基-2-丙醇（VIP=4.275 4）、乙酸乙酯（VIP=3.121 76）、正丙醇（VIP=3.040 43）、正丁醇（VIP=2.919 34）、戊酸乙酯（VIP=1.565 74）、丁酸乙酯（VIP=1.409 26）、苯乙醇（VIP=1.186 14）和糠醇（VIP=1.129 97），生青味缺陷酒和正常酒之間各差異化合物的含量呈現(xiàn)出不同程度的升高或降低趨勢(shì)，基于2 種類別酒體特征性化合物的研究結(jié)果，本結(jié)果表明生青味缺陷酒的風(fēng)味缺陷與其特征差異性化合物具有顯著相關(guān)性，其具體的化合物及其呈風(fēng)味機(jī)制本課題組正在進(jìn)一步研究和驗(yàn)證。

表3 生青味缺陷酒與正常酒的差異性化合物Table 3 Differential components between Baijiu with green off-flavor and normal Baijiu

3 結(jié) 論

本研究以醬香型生青味缺陷酒為對(duì)象，首次將基于GC-MS的非靶向代謝組學(xué)和感官風(fēng)味為導(dǎo)向的靶向研究策略應(yīng)用于醬香型生青味缺陷酒體風(fēng)味研究，并結(jié)合多種統(tǒng)計(jì)分析快速、全面表征醬香生青味缺陷酒樣酒體中的特征風(fēng)味化合物結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)了生青味目標(biāo)代謝化合物的標(biāo)記。通過檢測(cè)分析，從生青味酒樣中共檢出94 種風(fēng)味化合物，以酯類、醇類和芳香族類化合物為主；以正常風(fēng)味酒樣酒體為對(duì)照，應(yīng)用Venn和熱圖統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)生青味缺陷酒與正常酒樣含量間存在顯著差異，進(jìn)一步開展組間風(fēng)味化合物的OPLS-DA，共得到15個(gè)主要差異成分，主要為醇類及酯類化合物，包括1-乙氧基-2-丙醇、異戊醇、正丙醇、正丁醇、乳酸乙酯、2-糠酸乙酯、DL-2-己酸乙酯等。其中以乳酸乙酯、異戊醇、異丁醇以及糠醛為主的酯類及高級(jí)醇類化合物等可能是構(gòu)成醬香白酒生青味缺陷特征的重要因子，也是導(dǎo)致生青味酒體伴有苦澀特征重要原因；同時(shí)，2-糠酸乙酯和DL-2-己酸乙酯作為生青味缺陷型醬香白酒中新檢出的風(fēng)味化合物，它們對(duì)生青味缺陷特征的影響還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。綜上，本研究通過OPLS-DA確定醬香白酒生青味缺陷酒與正常酒中顯著候選香氣化合物，是識(shí)別導(dǎo)致感官差異的重要芳香化合物的基本策略，可用于評(píng)估生產(chǎn)中涉及的其他參數(shù)對(duì)酒精飲料質(zhì)量和風(fēng)味特征的影響。