郭俊俊，張國香

（山西省科技資源與大型儀器開放共享中心，山西 太原 030006）

連翹果實為木犀科植物連翹（Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl）的干燥成熟種子[1]，主產(chǎn)于我國河南、山西、陜西、山東等地[2]。中藥制劑中，連翹果實長于清心熱，用于治療邪陷心包、神昏譫語等癥[3]。連翹果實主要含有苯乙醇及其苷類、木脂素及其苷類、五環(huán)三萜類、黃酮類及揮發(fā)油類等活性成分，藥理研究認為其具有抗菌、抗炎、止呃逆、抗肝損傷、抑制磷酸二酯酶、抗病毒、降血壓等作用[4]。目前，應季采收的連翹（青翹）處理方式主要有自然風干、熱風干燥及真空冷凍干燥等方式，通過比較發(fā)現(xiàn)真空冷凍干燥工藝處理的連翹與自然風干、熱風干燥處理的樣品連翹相比，外觀品質(zhì)較好，復水率顯著提高，連翹中連翹酯苷A、連翹苷、連翹脂素、蘆丁的提取率有提高。真空冷凍干燥過程中，預凍速率、擋板溫度及真空壓力等工藝參數(shù)均會影響連翹最終產(chǎn)品的品質(zhì)。因此，以連翹（青翹）冷凍干燥工藝參數(shù)為研究對象，從優(yōu)化凍干產(chǎn)品質(zhì)量品質(zhì)及提高連翹活性成分的提取率等方面入手，系統(tǒng)研究真空冷凍干燥工藝中預凍速率、真空壓強及隔板溫度等工藝參數(shù)對二者的影響，選出優(yōu)化后的工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

對照品連翹酯苷A（批號11810-201606）、連翹苷（批 號110821-201615）、蘆 ?。ㄅ?號100080-201608）、連翹脂素（生產(chǎn)編號PCS1413，質(zhì)量分數(shù)均大于98%），中國食品藥品檢定研究院提供；甲醇為色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司提供；甲酸為色譜純，西格瑪奧德里奇（中國）有限公司提供；其他試劑均為分析純；水為制備的超純水；連翹，取自山西汾西縣連翹生產(chǎn)基地的成熟青翹果實。

1.2 試驗儀器

SCIENTZ-10ND型冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品；BSA223S型電子天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司產(chǎn)品；KQ-500E型超聲波清洗器，（200 W，25 kH），昆山超聲波聲儀器廠產(chǎn)品；XW80A型渦旋混合器，上海醫(yī)科大學儀器廠產(chǎn)品；CP225D型十萬分之一天平，德國Sartorius公司產(chǎn)品；明澈-D 24 UV純水/超純水一體系統(tǒng)，Merck millipore默克密理博中國有限公司產(chǎn)品；S-4800型場發(fā)射掃描電子顯微鏡，日本日立公司產(chǎn)品；VERTEX 70型傅立葉紅外變換光譜儀，布魯克光譜儀器有限公司產(chǎn)品；TSQ Endura型液相色譜三重四極桿串聯(lián)色譜儀配有Thermo fisher VANQUISH UHPLC超高壓液相部分，TSQ Endura的三重四極桿的質(zhì)譜儀，賽默飛世爾科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

取部分連翹樣品進行連翹共晶點、共熔點溫度測定，取部分連翹樣品進行冷凍干燥工藝參數(shù)設定試驗。真空冷凍干燥技術(shù)主要包括物料鋪盤厚度、預處理、預凍結(jié)、升華干燥、解析干燥、后處理等工藝過程。對冷凍干燥后的樣品，使用液相質(zhì)譜聯(lián)用儀對活性成分進行含量分析，使用紅外光譜儀及掃描電鏡對活性物種類和內(nèi)部結(jié)構(gòu)進行評價。

1.3.2 操作要點

連翹樣品為山西汾西縣采收的應季連翹（青翹）。連翹樣品應去除雜質(zhì)，選取大小均一的備用。測定共晶點、共熔點的樣品應用小刀一分為二，以便電阻法試驗使用。用于冷凍干燥工藝試驗的樣品，由于連翹形態(tài)特點而不做切片處理，可整顆直接鋪盤。連翹冷凍干燥工藝參數(shù)設置范圍：預凍速率（5～8℃/min），隔板溫度（-10～60℃），真空壓強（30～55 Pa）。

選取連翹凍干工藝的干燥速率[5]、生產(chǎn)效率及樣品表面積收縮率[6]作為連翹凍干工藝的干燥特性指標。連翹冷凍干燥樣品活性成分提取有連續(xù)回流浸提和超聲提取2種方法。經(jīng)比較，超聲提取可滿足試驗要求，且操作簡單、方便快捷。常用提取溶劑有甲醇、乙醇、丙酮及水。經(jīng)試驗考查，甲醇-水（4∶1）系提取效率最高，且成本較乙醇低，安全性較丙酮高。超聲提取時間控制在45 min，提取效率達到最高。

2 結(jié)果與分析

2.1 連翹共晶點、共熔點測定

連翹的共晶點和共熔點采用電阻法進行測定。取50 g 1.3.2制備的連翹樣品1份進行冷凍干燥，采用預凍速率為1℃/min進行預凍，同時測定連翹的電阻變化并記錄，當物料預凍到-35℃時，通過調(diào)整隔板溫度，以1℃/min進行升溫，同時測定連翹的電阻變化并記錄

連翹電阻隨溫度降低變化圖見圖1，連翹電阻隨溫度升高變化圖圖2。

圖1 連翹電阻隨溫度降低變化圖

圖2 連翹電阻隨溫度升高變化圖

由圖1～圖2可知，當連翹溫度高于-25℃時，電阻變化緩慢，當溫度低于-25℃時，電阻隨溫度變化速率陡然增大，故連翹共晶點及共熔點溫度為-25～-30℃時，因此設定連翹預凍溫度為-35℃，預凍2 h，再進行真空冷凍干燥。

2.2 連翹凍干曲線繪制

使用SCIENTZ-10ND型冷凍干燥機（寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品），對1.3.2制備的樣品進行凍干試驗，同時監(jiān)測凍干過程物料溫度、冷阱溫度、凍干箱壓力等3個參數(shù)隨時間的變化曲線，并繪制出連翹的凍干曲線。

連翹凍干曲線見圖3。

圖3 連翹凍干曲線

由圖3可知，連翹的凍干過程主要包括物料的預凍過程、升華干燥過程和解析干燥過程[7]。-35℃下預凍2 h；然后控制隔板溫度，使物料溫度達到-30℃（共結(jié)晶溫度附近），維持15 h進行真空冷凍干燥，直到物料中的凍結(jié)冰升華完畢，此階段凍干箱內(nèi)的真空度維持在物料溫度所對應飽和蒸汽的30%，即35～50 Pa；最后控制隔板溫度，使物料溫度達到最高容許溫度30℃，同時保持高真空度，維持6 h，進行凍干物料的解析干燥，直到整個凍干程序結(jié)束。

2.3 預凍速率對連翹干燥特性的影響

取50g 1.3.2制備的樣品5份，按照凍干曲線試驗設置的條件，分別以4.5，5.5，6.5，7.5，8.5℃/min速率進行預凍2 h，隨后執(zhí)行后續(xù)冷凍干燥程序，直至凍干程序結(jié)束。分取凍干物料進行干燥速率、生產(chǎn)效率及樣品表面積收縮率計算，并繪制預凍速率對干燥特性的變化圖。

不同預凍速率下連翹干燥特性變化見圖4。

由圖4可知，冷凍干燥過程中，凍結(jié)溫度越低，凍結(jié)速率越快，形成的晶核數(shù)量越多，晶粒越細，凍干產(chǎn)品質(zhì)量好，但凍干過程慢，生產(chǎn)效率低、面積收縮率大。相反，如果凍結(jié)速度慢，晶核數(shù)量少，晶粒大，凍干時間短，生產(chǎn)效率高，面積收縮率小。結(jié)合真空冷凍機自身特征，預凍速率應當控制在5～8℃/min。

圖4 不同預凍速率下連翹干燥特性變化

2.4 真空壓強對連翹干燥特性的影響

取50 g 1.3.2制備的樣品6份，按照凍干曲線試驗設置的條件，分別以腔內(nèi)真空壓強為30，40，50，60，70，80 Pa執(zhí)行冷凍干燥程序，直至凍干程序結(jié)束。分取凍干物料進行干燥速率、生產(chǎn)效率及樣品表面積收縮率的計算，并繪制真空壓強對干燥特性的變化圖。

不同壓強下連翹干燥特性變化見圖5。

由圖5可知，連翹的干燥速率隨干燥室壓強增加呈先升后降的趨勢，在40 Pa時速率達最大值。物料單位時間其干燥速率[5]與生產(chǎn)率[6]呈正相關(guān)，因此連翹的單位時間生產(chǎn)率也呈現(xiàn)相同的趨勢。真空壓力過高，會影響連翹的品質(zhì)。故壓力應當控制在35～50 Pa。

圖5 不同壓強下連翹干燥特性變化

2.5 隔板溫度連翹干燥特性的影響

取50 g 1.3.2制備的樣品6份，按照凍干曲線試驗設置的條件，分別以隔板溫度為35，40，45，50，55，60℃執(zhí)行冷凍干燥程序，直至凍干程序結(jié)束。分取凍干物料進行干燥速率、生產(chǎn)效率及樣品表面積收縮率的計算，并繪制隔板溫度對干燥特性的變化圖。

不同隔板溫度下連翹干燥特性變化見圖6。

圖6 不同隔板溫度下連翹干燥特性變化

由圖6可知，隨著隔板溫度的升高，增加了傳熱推動力，有利于水分逸出，加快干燥速率，連翹的干燥速率和生產(chǎn)率也隨之增大，且溫度升高會加劇連翹的收縮變形，溫度過高會使連翹受熱不均，影響品質(zhì)。綜合考慮，隔板溫度控制在50～60℃。

2.6 不同工藝參數(shù)對連翹中4種活性物質(zhì)得率的影響

將2.3、2.4及2.5不同工藝參數(shù)條件下冷凍干燥后的樣品粉碎研磨，各取1 g，置于50 mL具塞量筒中，準確加入70%的甲醇25 mL，稱質(zhì)量，常溫超聲提取45 min，放冷，稱質(zhì)量，用75%甲醇補足失重，過0.25 μm濾膜，取濾液2.0 mL上液質(zhì)聯(lián)用儀測定連翹酯苷A、連翹苷、連翹脂素、蘆丁等4種活性成分含量。按以上方法每份凍干物料各測定2次，取平均值，繪制活性物質(zhì)得率對工藝參數(shù)的曲線圖。

不同干燥特工藝參數(shù)條件下連翹中4種活性成分變化趨勢見圖7。

由圖7可知，干燥工藝各參數(shù)設置對連翹中4種活性成分得率的影響顯著。且各活性成分得率隨干燥工藝各參數(shù)的變化規(guī)律不盡相同。因此，以單一因素對連翹冷凍干燥工藝參數(shù)進行優(yōu)化，無法綜合和全面反映干燥工藝參數(shù)設置對連翹凍干品質(zhì)的影響，需要采用正交試驗來解決問題。

圖7 不同干燥特工藝參數(shù)條件下連翹中4種活性成分變化趨勢

2.7 正交試驗設計

根據(jù)單因素試驗的考查結(jié)果，建立活性成分得率與各因素（預凍速率、真空壓強、隔板溫度）之間的數(shù)學模型，選用L9（34）設計正交試驗，每個試驗水平重復3次，以保證試驗的準確性[8]。以連翹活性物質(zhì)得率為評價指標，對預凍速率、真空壓強、隔板溫度3個因素進一步考查。以得到連翹冷凍干燥工藝參數(shù)的較佳設置。

正交試驗因素與水平設計見表1，二次回歸正交試驗結(jié)果及分析見表2。

表1 正交試驗因素與水平設計

表2 二次回歸正交試驗結(jié)果及分析

由表2可知，最優(yōu)凍干工藝參數(shù)是8號，即A3B2C1，根據(jù)預凍速率、正空壓強和隔板溫度三因素對連翹有效成分得率影響的主次順序為預凍速率>隔板溫度>真空壓強，確定最優(yōu)凍干工藝組合為A3B2C1。既預凍速率為7.5℃/min，真空度為40 Pa，隔板溫度為50℃的條件下，連翹酯苷A、連翹苷、連翹脂素、蘆丁的甲醇浸出物含量分別為3.648%，0.560%，0.037%，0.170%，連翹活性成分提取得率的綜合評分最高為1.103 9%。

2.8 凍干產(chǎn)品品質(zhì)分析

在最優(yōu)干燥工藝下制備凍干連翹樣品，并以自然干燥、熱風干燥樣品為對照，進行特性對比研究。自然干燥指自然條件下曬干，熱風干燥樣品是在與優(yōu)選的真空冷凍干燥工藝相同的溫度條件下干燥。

2.8.1 連翹紅外指紋圖譜研究。

分別將適量不同干燥方式的樣品粉末與溴化鉀按照1∶100比例混合均勻，直接壓片，采用傅立葉紅外變換光譜儀進行掃描[2]。結(jié)果為不同干燥方式所得連翹樣品的紅外指紋圖譜峰形相似，僅存在信號強弱差異。表明連翹樣品在不同的干燥方式下，其化學成分并未發(fā)生變化。

2.8.2 連翹樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)研究結(jié)果

真空冷凍干燥的產(chǎn)品色度更接近新鮮連翹樣品；凍干產(chǎn)品更好地保留了連翹樣品的植物組織結(jié)構(gòu)，植物結(jié)構(gòu)未產(chǎn)生塌陷；采用真空冷凍干燥工藝制備的連翹樣品植物形態(tài)及品質(zhì)更接近新鮮樣品，質(zhì)量良好。

不同干燥方式的連翹樣品紅外指紋圖譜見圖8，不同干燥方式的連翹樣品和新鮮樣品的SEM圖見圖9。

圖8 不同干燥方式的連翹樣品紅外指紋圖譜

3 結(jié)論

從冷凍干燥技術(shù)關(guān)鍵參數(shù)的確定出發(fā)，使用電阻法測定了連翹的共晶點溫度和共熔點溫度，在-25～-30℃范圍內(nèi)，因此設定連翹預凍溫度為-35℃。通過測定凍干速率、單位時間生產(chǎn)率及干燥樣品的面積收縮率等干燥特性指標，確定冷凍干燥工藝關(guān)鍵核心參數(shù)預凍速率、真空壓強計及隔板溫度等。從而繪制出連翹冷凍干燥工藝的凍干曲線。通過各類單因素試驗及正交試驗，對工藝參數(shù)進行了優(yōu)化，得出SCIENTZ-10ND型冷凍干燥機（寧波新芝生物科技股份有限公司）對連翹的凍干工藝的最優(yōu)參數(shù)值為預凍速率7.5℃/min，真空度40 Pa，隔板溫度50℃。該條件下，凍干的連翹樣品，在外觀、色澤及內(nèi)部結(jié)構(gòu)保留了與新鮮樣品具有同樣的品質(zhì)，而且更多地保留了連翹中易揮發(fā)、高溫易氧化分解的活性成分。

圖9 不同干燥方式的連翹樣品和新鮮樣品的SEM圖