王洪秀，孫 鵬，安 穎，胡 佳，陳緒濤，李 菁，魏云輝

（1江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)應(yīng)用微生物研究所，南昌 330200；2浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物物理研究所/教育部生物系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)與保護(hù)重點實驗室，杭州 310058）

0 引言

茶樹菇(Agrocybe aegerita)屬于球蓋菇科(Strophariaceae)田頭菇屬(Agrocybe)，分布于中國的江西、福建、云南、浙江及四川等地。因其生長宿主的多樣性及形態(tài)上的細(xì)微差別，又被命名為楊樹菇、柳松茸（日本與中國臺灣省）、柳環(huán)菌（貴州、云南）、柱狀田頭菇、茶薪菇、油菜菇等[1]，是集高蛋白、低脂肪、低糖分的可營養(yǎng)、保健和食療的珍稀食用菌。江西省茶樹菇產(chǎn)量為全國第一[2]，種植規(guī)模越來越大。食用菌種質(zhì)資源是選育優(yōu)良品種的基礎(chǔ)，對茶樹菇種質(zhì)資源親緣關(guān)系進(jìn)行準(zhǔn)確分析和評價，可為種植品種選擇和育種親本選配提供科學(xué)依據(jù)。

DNA分子標(biāo)記是對DNA水平遺傳變異的直接反映，不受環(huán)境、組織特異性和發(fā)育階段等因素的影響，具有數(shù)量大、多態(tài)性高、遺傳穩(wěn)定等優(yōu)勢[3-9]。簡單序列重復(fù)區(qū)間 (inter-simple sequence repeat，ISSR)是在微衛(wèi)星(simple sequence repeats，SSR)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的分子標(biāo)記技術(shù)[10]。采用分子標(biāo)記對茶樹菇種質(zhì)資源進(jìn)行分類、評價，分析親緣關(guān)系和多態(tài)性的研究已經(jīng)有一些報道[11-16]。由于每種方法的原理不同，聚類分析結(jié)果通常會存在較大差異。因此，本研究綜合采用ISSR分子標(biāo)記、拮抗試驗和同工酶技術(shù)相結(jié)合的方法，對18株不同來源茶樹菇親緣關(guān)系進(jìn)行分析，評價其農(nóng)藝性狀，以期為茶樹菇分類鑒定、遺傳育種和商業(yè)化栽培菌株篩選提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

參與研究的18株茶樹菇均保存于江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)應(yīng)用微生物研究所食用菌育種室，菌株信息見表1。其中4株是野生菌株（編號Aa1～4）、7株是栽培菌株（編號Aa5～11）、5株是經(jīng)鈷60（劑量為600、700、800 Gy）輻照誘變菌株（編號Aa12～16）、2株為搭載神十的航天誘變菌株（編號Aa17～18）。

表1 茶樹菇的18個供試菌株

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 馬鈴薯綜合培養(yǎng)基 200 g馬鈴薯，1.5 g硫酸鎂，20 g瓊脂，1.0 g磷酸二氫鉀，20 g葡萄糖，水1000 mL[17]。

1.2.2 栽培袋培養(yǎng)基 45%棉籽殼，30%玉米芯，18%麩皮，5%玉米粉，1%石灰，1%石膏，含水量60%左右。

1.3 試劑與儀器

DP305植物基因組DNA提取試劑盒購于TIANGEN生化科技（北京）有限公司，Taq DNA聚合酶、dNTP、瓊脂糖、Marker DL2000和 6× Loading Buffer購于寶生物工程（大連）有限公司，PCR引物購于上海立菲生物技術(shù)有限公司，核酸染料、溴酚藍(lán)指示劑和RNaseA購于北京索萊寶科技有限公司。

S1000TMThermal Cycler型PCR儀和PowerPacTMBasic型電泳槽購于Bio-Rad公司，G:Box F3型高級凝膠成像系統(tǒng)購于Syngene公司。

1.4 拮抗試驗

參照國家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《食用菌菌種區(qū)別性鑒定拮抗反應(yīng)》(NY/T 1845—2010)[18]操作。18株供試菌接種到馬鈴薯綜合培養(yǎng)基中活化，然后用打孔器取直徑0.5 cm的10天菌齡的菌塊，按“品”字形接種于同一固體平板上，于25℃恒溫培養(yǎng)15天，每個處理3次重復(fù)，觀察菌株間菌落交界處菌絲的拮抗現(xiàn)象[19]。

1.5 酯酶同工酶電泳試驗

參照國家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《食用菌菌種真實性鑒定酯酶同工酶電泳法》(NY/T 1097—2006)[20]操作。將保存的試管種接種到150 mL馬鈴薯液體培養(yǎng)基中180 r/min、25℃避光培養(yǎng)20天。采用3層紗布過濾菌絲球，并用濾紙吸干菌絲球的水分，稱取0.5 g菌絲，放于預(yù)冷研缽中，加入液氮研磨至乳白色疏松狀，加入2倍體積樣品緩沖液[稱取6.02 g磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)，0.5 g磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)，溶于水中，并稀釋至100 mL，pH 7.5]，4℃、10000 r/min離心10 min。取上清液與蔗糖溶液（稱取40 g蔗糖，溶于水中，并稀釋至100 mL）、溴酚藍(lán)指示劑混合，比例為8:3:1，混合液即為電泳樣品。采用聚丙烯酰胺凝膠雙槽垂直平板電泳，濃縮膠濃度為3.0%，分離膠濃度為7.5%，染色液為固藍(lán)RR-乙酸萘酯染色液[21]。電泳開始時電壓為80 V，溴酚藍(lán)指示劑進(jìn)入分離膠以后，將電壓升至120 V，指示劑距離凝膠底部約1 cm時，結(jié)束電泳。取下膠后，用染色液在37℃培養(yǎng)箱染色，最后用7%醋酸溶液（量取14 mL乙酸，加到適量水中，并稀釋至200 mL）固定保存并拍照記錄。計算每個菌株條帶的相對遷移率Rf，如式(1)[17]。

1.6 供試菌株培養(yǎng)及基因組DNA的提取

接種少量菌絲體于馬鈴薯綜合培養(yǎng)基上，接入前先在平皿培養(yǎng)基上鋪一張滅菌的玻璃紙，25℃活化培養(yǎng)至菌絲長滿平板，而后刮取少量菌絲作為試驗材料，采用TIANGEN DP305植物基因組DNA抽提試劑盒提取基因組DNA，并于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 ISSR分子標(biāo)記的引物篩選

參照國家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《食用菌菌種真實性鑒定ISSR法》(NY/T 1730—2009)[22]操作，選本試驗彼此有明顯拮抗的5個供試菌株DNA為模板，經(jīng)過ISSR-PCR擴(kuò)增，篩選出電泳條帶清晰、穩(wěn)定、多態(tài)性高的引物用于下一步的ISSR試驗。試驗篩選到的引物序列如表2所示。

表2 ISSR分析用引物

1.8 ISSR-PCR擴(kuò)增

用篩選到的20條多態(tài)性引物對所有供試菌株進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增，ISSR擴(kuò)增反應(yīng)20 μL的總體系為2 × PCR Premix 10 μL、Primer 10 μmol/L 1 μL、DNA 1 μL、ddH2O 8 μL。ISSR擴(kuò)增反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性3min，然后94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸2 min，進(jìn)行35次循環(huán)后72℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物于1.8%的瓊脂糖凝膠電泳上檢測并拍照[23]。

1.9 子實體農(nóng)藝性狀測定

將18株茶樹菇分別接種到栽培袋中，每個菌株接種32袋，在相同的培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)至出菇，待茶樹菇子實體生長至七八分熟（菌膜已經(jīng)被打破，菌褶全部舒展開，但菌蓋卻沒有完全打開，顏色由灰白色變?yōu)楹稚樽罴巡墒諘r期即進(jìn)行采收。從產(chǎn)量、生育期、顏色、子實體規(guī)格（菌蓋直徑、菌柄直徑、菌柄長度）等商品性狀進(jìn)行農(nóng)藝性狀調(diào)查[17]，從中篩選出子實體朵型好、產(chǎn)量高、出菇整齊、生育期短的優(yōu)異菌株。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

酯酶同工酶使用SPSS軟件對茶樹菇菌株酶譜進(jìn)行聚類分析。ISSR分子標(biāo)記分析通過擴(kuò)增條帶在瓊脂糖凝膠上出現(xiàn)與否分別標(biāo)記為1或0。用SensiAnsys和UPGMA(NTSYS-pc2.1)軟件進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建樹狀圖[24]。使用SPSS軟件對子實體農(nóng)藝性狀進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗試驗分析

茶樹菇供試菌株間的拮抗反應(yīng)為隆起型（圖1），依據(jù)拮抗線的有無共分為7組。茶園1號、茶園2號、楊樹洞1號、楊樹上2號和白茶這5個菌株均與其他17個供試菌株都發(fā)生拮抗反應(yīng)，分別單獨為一組。茶3、古1、古2、AS-1、AS-1-700、AS-2、AS-2-600、茶3-800和茶3神這9個菌株里每一個菌株與其他17個菌株的拮抗反應(yīng)類型一致，聚為一組，茶5、茶5-800、白茶700和AS-1神這4個菌株里每一個菌株與其他17個菌株的拮抗反應(yīng)類型一致，聚為一組（表3）。菌株間沒有拮抗反應(yīng)或拮抗性反應(yīng)極不明顯，說明其親緣關(guān)系很近。而菌株之間都有著不同程度的拮抗反應(yīng)，表明菌株之間的親緣關(guān)系較為疏遠(yuǎn)[4,24]。

圖1 茶樹菇供試菌株間的拮抗現(xiàn)象

表3 18株供試菌株間的拮抗反應(yīng)結(jié)果

2.2 酯酶同工酶檢驗

2.2.1 酯酶同工酶電泳圖譜分析 圖2為18個茶樹菇菌株的酯酶同工酶電泳圖譜。18個菌株共檢測出93條酯酶同工酶譜帶，其中遷移率不同的有15條，Rf在0.151～0.636之間。多數(shù)菌株酶帶數(shù)目和遷移率不同，酶帶數(shù)分別為3～8條，多為6條。18個供試菌株分為5個酶譜類型，大部分菌株間酶帶存在一定差異。茶5、茶5-800和白茶700酶帶基本相同；楊樹洞1號和楊樹上2號酶帶基本相同；AS-1-700、AS-2-600、茶3-800、茶3、古2、古1、AS-2、AS-1酶帶基本相同，表明菌株間遺傳差異較小。茶園1號、茶園2號、茶3神、AS-1神和白茶這5個菌株譜帶與其他菌株間的酶譜差異顯著，說明這5個菌株與其他菌株間遺傳差異較大[25-29]。

圖2 茶樹菇酯酶同工酶電泳條帶及對應(yīng)相對的遷移率

2.2.2 酯酶同工酶聚類分析 由圖3可知，在相似水平為50%時可將供試菌株聚合為6類。第1類包括楊樹洞1號、楊樹上2號2個野生菌株，第2類包括AS-1-700、AS-2-600、茶3-800、茶3、古2、古1、AS-2、AS-1等8個工廠化栽培菌株和輻照誘變菌株，第3類包括茶園2號、AS-1神2個野生菌株和航天誘變菌株，第4類包括茶5、茶5-800、白茶、白茶700等4個工廠化栽培菌株和輻照誘變菌株，第5類為茶園1號野生菌株，第6類為茶3神航天誘變菌株。

圖3 茶樹菇酯酶同工酶聚類分析樹

2.3 ISSR分子標(biāo)記試驗分析

2.3.1 引物篩選結(jié)果 以菌株茶園1號、茶園2號、楊樹洞1號、楊樹上2號和白茶為模板，篩選出20條擴(kuò)增條帶清晰、穩(wěn)定、多態(tài)性高的引物（表2）。

2.3.2 ISSR分析 20條引物共產(chǎn)生164條DNA片段，多態(tài)性條帶數(shù)為133個，平均每個引物產(chǎn)生DNA片段數(shù)為8.2個，平均多態(tài)性比例為81.1%。引物P1的擴(kuò)增效果較好，共產(chǎn)生11條DNA片段，每個菌株產(chǎn)生DNA片段數(shù)為2～7個，平均為4個（圖4）。當(dāng)相似系數(shù)在0.47時，所有菌株聚為一個群。當(dāng)相似系數(shù)達(dá)到0.828時，所有菌株聚為6個群（圖5）[4,24,30-31]。類群I包括茶園1號和茶園2號，類群II包括楊樹洞1號和楊樹上2號，白茶單獨聚為類群III，AS-1單獨聚為類群V，類群IV包括茶5、白茶700、茶5-800和AS-1神，其余 8 株聚為類群 VI。其中，AS-2、古 1、古 2、Cha3和茶3-800相異系數(shù)為0，說明各菌株間遺傳差異小或為同一菌株。茶3與茶3神，AS-2與AS-2-600，AS-1與AS-1神、AS-1-700分別聚在了不同的遺傳分支，說明這7株茶樹菇可能在輻照或航天誘變后產(chǎn)生ISSR標(biāo)記多態(tài)性的種內(nèi)變異[11]。系統(tǒng)發(fā)育分析中18個菌株聚為6個分支，應(yīng)視為6個遺傳株系，分支間遺傳距離較大，可在遺傳分支間挑選親本菌株進(jìn)行雜交育種，以充分發(fā)揮雜交后代遺傳互補(bǔ)優(yōu)勢[32]。

圖4 引物P1的ISSR電泳圖譜

圖5 茶樹菇供試菌株的ISSR聚類樹

2.4 茶樹菇菌株的子實體農(nóng)藝性狀

供試菌株子實體階段性狀比較結(jié)果見表4。菌蓋厚度最厚的是茶5，菌蓋直徑最大的是AS-1，菌柄長度最長的是AS-2，菌柄直徑最大的是茶5；菌株茶5、AS-1、茶3、白茶、茶園1號和楊樹洞1號生育期較短；菌株茶3、AS-1、白茶、茶5、茶園1號和楊樹洞1號產(chǎn)量較高。綜合比較初步篩選出較優(yōu)菌株茶園1號、楊樹洞1號、AS-1、茶3、白茶和茶5，可作為工廠化生產(chǎn)茶樹菇菌種，其出菇照片如圖6所示。

表4 18個茶樹菇菌株的子實體農(nóng)藝性狀

3 結(jié)論與討論

茶樹菇集食用、保健和藥用價值于一身，是目前國內(nèi)重要的栽培食用菌之一，近年來，茶樹菇在國內(nèi)發(fā)展迅速，已成為國內(nèi)第九大類栽培食用菌類，年產(chǎn)量約為65.6萬t，占全國比例達(dá)50.36%[33-34]。但因為地域、標(biāo)準(zhǔn)、來源等原因，茶樹菇分類及命名混亂。因此，為了保證菌株的可持續(xù)栽培，建立一個可靠的茶樹菇遺傳多樣性評價方法顯得尤為重要[24]。

圖6 茶園1號、楊樹洞1號、AS-1、茶3、白茶和茶5的栽培出菇照片

本研究應(yīng)用拮抗、酯酶同工酶和ISSR技術(shù)對18個不同類型的茶樹菇進(jìn)行菌株分型，3種試驗方法得出的分型結(jié)果大致相同，與筆者曾采用ITS序列對相同供試材料的分型結(jié)果基本一致[9]。與單一試驗方法的聚類結(jié)果相比較，3種試驗方法相結(jié)合能夠更真實準(zhǔn)確地顯示出菌株之間的親緣關(guān)系。ISSR、ITS和酯酶同工酶3種分析方法在研究茶樹菇的親緣關(guān)系方面較其拮抗反應(yīng)的結(jié)果更細(xì)致，因此拮抗試驗只能作為菌株分型的初步研究，更深一步的研究就需要通過現(xiàn)代分子生物學(xué)的方法[24]進(jìn)行。

AS-1、AS-2、白茶、茶5和茶3是江西茶樹菇主產(chǎn)區(qū)的主栽品種，在拮抗試驗中5株菌聚在3個分支，在酯酶同工酶分析中5株菌聚在2個分支，在ISSR標(biāo)記分析中5株菌聚在4個分支，在ITS序列分析中5株菌聚在3個分支，不同的遺傳分支系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系較遠(yuǎn)。栽培中可將不同分支菌株搭配種植，以擴(kuò)大栽培菌株間的遺傳背景，利于改良栽培品種結(jié)構(gòu)，提高茶樹菇栽培品種對環(huán)境、病蟲害等因素的適應(yīng)性[11,32]。

在酯酶同工酶、ISSR和ITS分析中，茶3與茶3神、AS-1與AS-1神分別聚在了不同的分支，說明這4株茶樹菇可能由于航天誘變同工酶譜、ISSR標(biāo)記的多態(tài)性及ITS序列發(fā)生改變。菌株經(jīng)航天誘變產(chǎn)生的變異可以改變菌株因長期栽培導(dǎo)致的菌種退化，可以選擇產(chǎn)生有利性狀的誘變菌株作為父母本進(jìn)行雜交，增強(qiáng)后代的雜種優(yōu)勢。楊樹上2號、楊樹洞1號、茶園1號、茶園2號菌株為江西境內(nèi)野生分離菌株，在拮抗試驗和ISSR分析中，4株菌單獨分支，在酯酶同工酶和ITS分析中4株菌聚為3支，4株菌與傳統(tǒng)栽培菌株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，又因其采自野生環(huán)境，具有特有的環(huán)境適應(yīng)性、抗逆性等優(yōu)良特性，可以作為優(yōu)良親本菌株在育種中應(yīng)用[11,32]。

工廠化栽培要求菌株具有菌絲生長速度快、生長周期短、產(chǎn)量高、品質(zhì)優(yōu)、耐儲運(yùn)的特性[26]。本研究綜合比較初步篩選出較優(yōu)菌株茶園1號、楊樹洞1號、AS-1、茶3、白茶和茶5，可作為工廠化生產(chǎn)茶樹菇菌種。

基于本實驗室正在開展的茶樹菇全基因組、轉(zhuǎn)錄組和重測序等關(guān)聯(lián)分析技術(shù)，下一步將通過覆蓋全基因組范圍的SSR、SNP和INDEL等分子標(biāo)記，構(gòu)建高密度遺傳連鎖圖譜，圖位克隆高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆、抗病蟲、耐高溫、耐儲運(yùn)等優(yōu)異性狀的基因，實現(xiàn)優(yōu)異基因資源定向?qū)氩铇涔降哪康?，提高特色茶樹菇精?zhǔn)鑒定和評價，發(fā)掘新的茶樹菇特色物種和篩選具有重要經(jīng)濟(jì)價值的優(yōu)異菌株，充分發(fā)揮江西省茶樹菇資源優(yōu)勢和提升茶樹菇種質(zhì)資源創(chuàng)新利用水平。