黃寶瑩，佘之蘊，李沅鎂，金佳佳，張娟

（廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，廣東 佛山 528000）

沙門氏菌是一種常見的食源性致病菌，種類繁多，目前已檢測出2 500多種沙門氏菌血清型[1-2]。沙門氏菌歸于腸桿菌科沙門氏菌屬，分為6個亞屬[3]，是革蘭氏陰性短小桿菌，無莢膜，無芽胞，多數(shù)有鞭毛，有動力。引起食物中毒最常見的沙門氏菌為鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌等[4-5]，可導致腸熱癥、慢性腸炎、食物中毒等。沙門氏菌的傳播媒介多為肉、蛋、乳類食品。根據(jù)歐洲食品安全局（European Food Safety Agency，EFSA）統(tǒng)計，歐洲每年有超過10萬例的人類沙門氏菌病[6-7]。沙門氏菌是細菌性食物中毒中最常見的致病菌[8-9]。因此沙門氏菌檢測具有重要的衛(wèi)生安全意義。

速凍調(diào)制食品是指以谷物或豆類或薯類及其制品、畜禽肉及其制品、水產(chǎn)品及其制品、植物蛋白及其制品、果蔬及其制品、蛋及其制品、食用菌及其制品等為主要原料，配以輔料（含食品添加劑），經(jīng)調(diào)味制作加工，采用速凍工藝（產(chǎn)品熱中心溫度≤-18℃），在低溫狀態(tài)下貯存、運輸和銷售的預包裝食品，可分為花色面米制品、裹面制品、調(diào)味水產(chǎn)品、肉糜類制品、菜肴制品、湯料制品等[10]。速凍調(diào)制食品品種繁多，基質(zhì)復雜，尤其是生制速凍調(diào)制食品，未經(jīng)高溫或其他殺菌處理，存在大量非沙門氏菌屬雜菌，對沙門氏菌分離和鑒定造成一定難度。傳統(tǒng)檢驗方法操作繁瑣，受到檢測人員自身影響很大，倘若檢測人員經(jīng)驗不足，容易造成假陰性結(jié)果[11-12]。因此，選擇性平板分離和初篩試驗對目標菌和干擾菌的準確判斷，是整個檢測過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。為提高速凍調(diào)制食品中沙門氏菌的檢驗能力和準確度，本文對速凍調(diào)制食品中沙門氏菌及其干擾菌進行分離和鑒定，有助于分析其污染情況，為企業(yè)生產(chǎn)加工過程食源性致病菌的來源與控制、日常檢測提供參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 標準菌株

甲型副傷寒沙門氏菌CMCC（B）50093：廣東省食品微生物安全工程技術(shù)研究開發(fā)中心。

1.2 培養(yǎng)基和試劑

氯化鈉（分析純）：西隴科學股份有限公司；緩沖蛋白胨水（buffered peptone water，BPW）、四硫磺酸鈉煌綠增菌液（tetrathionate broth base，TTB）、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（selenite cystine broth，SC）、亞硫酸鉍瓊脂（bismuth sulfite agar，BS）、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基、三糖鐵瓊脂（triple sugar iron agar，TSI）、賴氨酸脫羧酶生化鑒定試劑盒、氨基酸脫羧酶對照生化鑒定試劑盒、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（nutrient agar，NA）：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；革蘭氏陰性桿菌鑒定（gram-negative identification card，GN）卡：生物梅里埃公司。

1.3 儀器和設(shè)備

HVA-85高壓滅菌鍋：日本HIRAYAMA公司；GHP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；Bagmixer 400SW拍打式均質(zhì)器、DiluFlow全自動電子稀釋儀：法國Interscience公司；1300 SERIES A2生物安全柜：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；VITEK 2 COMPACT全自動微生物鑒定系統(tǒng)：法國生物梅里埃股份有限公司。

1.4 樣品

速凍調(diào)制食品樣品共307批次，分為6類，由廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院提供，其分類和數(shù)量情況見表1。

表1 樣品分類和數(shù)量Table 1 Categories and number of samples

1.5 試驗方法

參照GB 4789.4—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗》[13]對307批次速凍調(diào)制食品進行沙門氏菌檢測。檢驗過程以甲型副傷寒沙門氏菌CMCC（B）50093作為陽性對照菌株。

1.5.1 預增菌

稱取25 g樣品置于無菌均質(zhì)袋，使用全自動電子稀釋儀加入225 mL BPW，用拍打式均質(zhì)器拍打2 min，于36℃培養(yǎng)18 h。

1.5.2 增菌

輕輕搖動培養(yǎng)過的樣品混合物，移取1 mL，轉(zhuǎn)種于10 mL SC內(nèi)，于36℃培養(yǎng)24 h。同時，另取1 mL，轉(zhuǎn)種于10 mL TTB內(nèi)，于42℃培養(yǎng)24 h。

1.5.3 分離

使用接種環(huán)分別從SC和TTB中取增菌液1環(huán)，劃線接種于BS瓊脂平板和沙門氏菌顯色培養(yǎng)基平板，于36℃分別培養(yǎng)48 h（BS瓊脂平板）和24 h（沙門氏菌顯色培養(yǎng)基），觀察各個平板上生長的菌落。

1.5.4 初篩試驗

自選擇性瓊脂平板上分別挑取2個以上典型或可疑菌落，接種TSI，先在斜面劃線，再于底層穿刺；同時接種賴氨酸脫羧酶生化鑒定管和氨基酸脫羧酶對照生化鑒定管，并加滅菌液體石蠟5滴覆蓋培養(yǎng)基表面。于36℃培養(yǎng)24 h，必要時可延長至48 h。根據(jù)表2進行初步判定。

表2 沙門氏菌屬在三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基的反應結(jié)果Table 2 The reaction results of Salmonella in TSI and lysine decarboxylase test medium

1.5.5 純化與革蘭氏染色

初步判斷為可疑沙門氏菌的樣品，劃線接種于NA，于36℃培養(yǎng)24 h后，進行革蘭氏染色。

1.5.6 生化鑒定

革蘭氏染色結(jié)果為陰性的樣品，從NA上挑取可疑菌落，使用VITEK 2 COMPACT進行鑒定。用0.45%鹽水制備麥氏比濁度為0.5～0.63的菌懸液，填充到GN卡內(nèi)，放入孵育倉，儀器每隔15 min自動閱讀孵育倉內(nèi)所有卡片，并將數(shù)據(jù)傳入電腦，4 h～12 h后自動打印結(jié)果[14]。VITEK 2 COMPACT以現(xiàn)有的生化鑒定方法為基礎(chǔ)，同時開發(fā)了新的底物用來檢測碳源利用的同化試驗，可以使用更多類型的底物，也就是可以利用更多的鑒定反應。其檢測原理是儀器透過光學原件檢測光穿過64個含有菌液的孔后相應的光強度變化值，對多種顏色變化進行檢測（430、568、660 nm 3種波長）。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離結(jié)果

沙門氏菌屬在BS瓊脂平板上菌落為黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色，菌落周圍培養(yǎng)基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰綠色的菌落，周圍培養(yǎng)基不變。在沙門氏菌顯色培養(yǎng)基平板上菌落為品紅色。選擇性瓊脂平板上可疑或典型沙門氏菌分布情況如表3所示。

表3 選擇性瓊脂平板上可疑或典型沙門氏菌分布情況Table 3 Distribution of suspicious or typical Salmonella in selective agar plate

表3顯示，有可疑或典型菌落生長的樣品共128批次，可疑率為41.69%。

2.2 初篩試驗結(jié)果

對上述128批次可疑樣品進行三糖鐵和賴氨酸脫羧酶初篩試驗，分布情況見表4。

表4 初篩試驗結(jié)果分布情況Table 4 Distribution of preliminary screening test results

由表4可知，初步判定為可疑沙門氏菌屬的樣品共50批次，可疑率為16.29%。

2.3 生化鑒定結(jié)果

對50批次可疑樣品進行生化鑒定，結(jié)果如表5所示。

表5 生化鑒定結(jié)果Table 5 Results of physiological and biochemical identification

續(xù)表5 生化鑒定結(jié)果Continue table 5 Results of physiological and biochemical identification

由表5可知，檢出沙門氏菌3批次，檢出率為0.98%。檢出干擾菌47批次，其中Aeromonas hydrophila/caviae（嗜水氣單胞菌/豚鼠氣單胞菌）、Aeromonas sobria（溫和氣單胞菌）、Escherichia coli（大腸埃希菌）、Escherichia fergusonii（弗格森埃希菌）、Klebsiella pneumoniae ozaenae（肺炎克雷伯菌臭鼻亞種）、Providencia rettgeri（雷氏普羅威登斯菌）、Pseudomonas aeruginosa（銅綠假單胞菌）、Pseudomonas luteola（淺黃假單胞菌）、Raoultella ornithinolytica（解鳥氨酸拉烏爾菌）、Serratia liquefaciens group（液化沙雷菌群）各檢出1批次，檢出率為0.33%。Citrobacter amalonaticus（無丙二酸檸檬酸桿菌）、Cronobacter sakazakii group（克羅諾桿菌屬）、Enterobacter cloacae complex（陰溝腸桿菌群）、Klebsiella oxytoca（產(chǎn)酸克雷伯菌）、Pantoea spp（泛菌屬）檢出2批次，檢出率為0.65%。Morganella morganii ssp morganii（摩氏摩根菌摩根亞種）、Serratia marcescens（粘質(zhì)沙雷菌）檢出3批次，檢出率為0.98%。Proteus miralbilis（奇異變形桿菌）檢出4批次，檢出率為1.31%。Klebsiella pneumoniae ssp pneumoniae（肺炎克雷伯菌肺炎亞種）檢出17批次，檢出率為5.54%。

3 討論與結(jié)論

BPW是非選擇性培養(yǎng)基，能使處于瀕死狀態(tài)的細菌恢復活力，用于修復受損傷的沙門氏菌，但由于其不具有選擇性，因此增菌時間過長會導致雜菌生長過多，干擾鑒定結(jié)果，故建議最好控制在8 h～18 h。

SC和TTB是選擇性增菌液，能使沙門氏菌優(yōu)勢繁殖，其它細菌受到抑制[15]。SC中的亞硒酸氫鈉抑制革蘭氏陽性菌和非沙門氏菌的大多數(shù)革蘭氏陰性腸道菌，胱氨酸能促進沙門氏菌屬生長，適合傷寒沙門氏菌和甲型副傷寒沙門氏菌生長，最適培養(yǎng)溫度為36℃。TTB中硫代硫酸鈉和四硫磺酸鈉結(jié)合可抑制腸道共生菌，而具有四硫磺酸鈉還原酶的細菌能在此培養(yǎng)基中繁殖；膽鹽和煌綠可抑制大腸群菌和其它革蘭氏陽性細菌，適合其他沙門氏菌生長，最適培養(yǎng)溫度為42℃。為防漏檢宜同時采用SC和TTB進行選擇性增菌。

BS中的亞硫酸鉍指示劑抑制革蘭氏陽性菌和大腸菌群，硫酸亞鐵用于產(chǎn)生硫化氫，并與鐵產(chǎn)生沉淀，使陽性培養(yǎng)物為具有金屬光澤的棕色到黑色菌落，可延長培養(yǎng)時間以免沙門氏菌生長被抑制，適合沙門氏菌特別是傷寒沙門氏菌的選擇性分離培養(yǎng)。沙門氏菌顯色培養(yǎng)基中的膽鹽抑制革蘭氏陽性菌，混合色素分別與沙門氏菌和大腸菌群所對應的酶發(fā)生特異性反應，水解底物，釋放出顯色基團，在淡黃色平板上沙門氏菌產(chǎn)生品紅色的菌落，大腸菌群產(chǎn)生藍綠色的菌落。沙門氏菌顯色培養(yǎng)基靈敏度高，選擇性強，可排除多數(shù)干擾菌，減少大量的鑒定工作，提高檢測效率，BS選擇性較差，但可提高檢測準確度，減少誤判。采用BS搭配沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基進行分離，互補防漏檢。

三糖鐵瓊脂用于鑒別細菌發(fā)酵蔗糖、乳糖、葡萄糖及產(chǎn)生硫化氫的生化反應。乳糖、葡萄糖、蔗糖為可發(fā)酵糖類，其產(chǎn)酸時通過酚紅指示劑測出，酸性呈黃色，堿性呈紅色；硫代硫酸鈉可被某些細菌還原為硫化氫，與硫酸亞鐵銨中的鐵鹽生成黑色硫化鐵。若細菌可發(fā)酵3種糖產(chǎn)酸，酚紅指示劑變黃，則試管斜面和底層均變黃。若細菌只能發(fā)酵葡萄糖，則斜面少量的葡萄糖被分解完后，細菌繼續(xù)利用蛋白胨產(chǎn)堿，且產(chǎn)堿量大于產(chǎn)酸量，最終由黃變?yōu)樯罴t，底層無氧，細菌緩慢分解葡萄糖而產(chǎn)酸變黃。若細菌只能發(fā)酵葡萄糖和乳糖，或者只能發(fā)酵葡萄糖和蔗糖，由于乳糖或蔗糖量大，故斜面和底層均產(chǎn)酸變黃。若分解糖類產(chǎn)氣則可見氣泡或裂縫。沙門氏菌一般生化特性是利用葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，產(chǎn)H2S，不發(fā)酵乳糖和蔗糖[16]。故選擇性培養(yǎng)基就是加入乳糖、酸堿指示劑兩個指針來判斷可疑菌落。但這些一般生化特性并不是沙門氏菌的特異性生化特性，如本次試驗中粘質(zhì)沙雷菌、奇異變形桿菌、肺炎克雷伯菌肺炎亞種等干擾菌在三糖鐵瓊脂和選擇性培養(yǎng)基上生化結(jié)果與菌落形態(tài)與沙門氏菌相似。

速凍調(diào)制食品基質(zhì)多樣復雜，存在大量營養(yǎng)要求和生化反應相似的非沙門氏菌干擾菌，而沙門氏菌血清型高達2 500多個，不同血清型的沙門氏菌其營養(yǎng)要求和生化反應差異較大，增菌和分離既要考慮選擇性，又要兼顧特異性，因此對檢驗人員的操作水平和經(jīng)驗有著較高的要求。本次試驗在選擇性瓊脂平板上的可疑率為41.69%。初篩試驗后可疑率為16.29%。沙門氏菌檢出率為0.98%。結(jié)果表明，速凍調(diào)制食品中存在大量非沙門氏菌干擾菌。使用VITEK 2 COMPACT對可疑菌落進行生化鑒定，共鑒定19種干擾菌。其中嗜水氣單胞菌/豚鼠氣單胞菌、溫和氣單胞菌是多種水生動物的原發(fā)性致病菌[17-18]；銅綠假單胞菌[19]、克羅諾桿菌屬[20]是食源性致病菌；其余均為條件致病菌，應引起重視并進行深入的致病性研究。