明瑤，張露丹，周敏，溫翠娟，霍朝勇，呂曉華*

（1.四川大學 華西公共衛(wèi)生學院/華西第四醫(yī)院，四川 成都 610041；2.成都雨瑞藍果果農業(yè)科技有限公司，四川 成都 610200）

藍莓原產(chǎn)美洲，目前在國內廣泛種植。藍莓果實含有豐富的維生素C，硒含量高于一般水果，花青素含量高居水果之首，還含有超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、熊果苷、類黃酮、鞣花酸等活性成分[1-2]，有助于改善視力、預防心血管疾病、改善記憶力[3-4]。隨著藍莓產(chǎn)量增加，鮮果貯藏期短等問題日漸凸顯，以及消費者對水果的食用、感官、營養(yǎng)等多方面需求，藍莓的深加工和綜合開發(fā)利用備受關注[5-7]。其中藍莓發(fā)酵制品不僅能延長藍莓的保質期，改善其風味，還能提供多種小分子活性物質，更有利于人體吸收。本文通過動物實驗觀察藍莓發(fā)酵制品對免疫功能的影響，為藍莓的綜合開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

藍莓發(fā)酵原漿凍干粉：成都雨瑞藍果果農業(yè)科技有限公司提供，人體推薦劑量為4.5 g/d（75 mg/kg bw），實驗前樣品用純水配制成所需濃度。綿羊紅細胞（sheep red blood cell，SRBC）：采自健康綿羊頸靜脈；雞紅細胞（chicken red blood cell，CRBC）：采自健康公雞心臟；刀豆蛋白 A（ConA）、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽 [3-（4，5）-dimethylthiahiazo（-z-y1）-3，5-di-phenytetrazoliumromide，MTT]、氧化型輔酶Ⅰ：美國Sigma公司；RPMI1640培養(yǎng)基：美國Gibco公司；AC-1細胞：中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫；墨汁：北京一得閣工貿公司產(chǎn)品；補體：由健康豚鼠血清制得；小牛血清：浙江天杭生物科技股份有限公司；乳酸鋰：國藥集團化學試劑有限公司；乙基苯基聚乙二醇（nonidet P-40，NP-40）、吩嗪二甲酯硫酸鹽：Biosharp公司；含雙抗的RPMI1640培養(yǎng)液：成都哈里生物科技有限公司。

1.2 實驗動物

SPF級雄性Balb/c小鼠 [許可證號：SCXK（京）2019-0008]，6 周齡～8 周齡，18 g～22 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。飼養(yǎng)于屏障系統(tǒng)SPF級動物房[許可證號：四川省實驗動物管理委員會SYXK（川）2018-011]，溫度20℃～26℃，相對濕度40%～70%。飼料由成都達碩實驗動物有限公司提供，飲水為純水，實驗期間動物自由攝食和飲水。

1.3 儀器與設備

BSA223S電子天平：德國賽多利斯股份公司；數(shù)顯游標卡尺：桂林廣陸數(shù)字測控股份有限公司；Multiskan GO全波長多功能酶標儀：Thermo公司；MCO-15AC CO2培養(yǎng)箱：三洋電機國際貿易有限公司；、UV8100B紫外可見分光光度計：北京萊伯泰科儀器股份有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 功效成分檢測

藍莓發(fā)酵原漿中的熊果酸含量檢測參照文獻[8]，鞣花酸含量測定參照DB32/T 1879—2011《黑莓中鞣花酸含量的測定高效液相色譜法》，花青素（包含飛燕草色素、矢車菊色素、矮牽牛色素、錦葵色素）含量測定參照NY/T 2640—2014《植物源性食品中花青素的測定高效液相色譜法》，多糖含量檢測參照文獻[9]，SOD含量測定參照GB/T 5009.171—2003《保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定》，低聚肽含量測定參照GB/T 22729—2008《海洋魚低聚肽粉》。

1.4.2 增強免疫力功能實驗

實驗動物適應性喂養(yǎng)3 d后，隨機分為空白對照組和3個藍莓發(fā)酵原漿凍干粉實驗組。參照文獻[10]方法，確定受試物劑量分別為0.75 g/kg bw（低劑量組）、1.50 g/kg bw（中劑量組）和 2.25 g/kg bw（高劑量組）（分別相當于人體推薦攝入量的10、20、30倍）。實驗動物按20 mL/kg bw灌胃?？瞻讓φ战M動物以純水灌胃，每日1次。每周稱1次實驗動物體質量，調節(jié)灌胃體積，連續(xù)灌胃30 d后進行指標檢測。

1.4.2.1 臟器指數(shù)測定

實驗結束后處死小鼠，取胸腺、脾臟稱重，計算臟器指數(shù)。

1.4.2.2 脾淋巴細胞轉化實驗

處死小鼠后無菌取脾，制成單個細胞懸液，調整細胞濃度為3×106個/mL。按照MTT法[10]在570 nm波長處測OD值，用ConA孔的OD值與不加ConA孔的OD值的差值表示淋巴細胞的增殖能力。

1.4.2.3 遲發(fā)型變態(tài)反應實驗

采用足跖增厚法進行遲發(fā)型變態(tài)反應實驗。小鼠腹腔注射0.2 mL 2%SRBC進行免疫，4 d后測量左后足跖部厚度，再在測量部位皮下注射20 μL 20%SRBC，24 h后測量左后足趾部厚度，測量3次，取平均值。計算攻擊前后足跖厚度差值。足跖腫脹程度可反映遲發(fā)型變態(tài)反應程度。

1.4.2.4 血清溶血素測定

采用血凝法進行血清溶血素測定實驗，免疫方法同1.4.2.3。5 d后于小鼠眼球取血，收集血清。將血清用生理鹽水按照所需濃度稀釋，將其分別置于血凝實驗板內，加入等量SRBC懸液，置于37℃CO2培養(yǎng)箱3 h，觀察血球凝集程度，并計算抗體積數(shù)，抗體積數(shù)越大，表示血清溶血素（抗體）水平越高。

式中：1、2、3……n代表血清稀釋的指數(shù)；S代表凝集程度的級別。

1.4.2.5 抗體生成細胞檢測

抗體生成細胞檢測的免疫方法同1.4.2.3。5 d后處死小鼠，無菌取脾制成單個細胞懸液，調整細胞濃度為5×106個/mL。按照Jerne改良玻片法，計數(shù)溶血空斑數(shù)。

1.4.2.6 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗

采用半體內法進行小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗。小鼠腹腔注射1 mL 20%雞紅細胞懸液，0.5 h后處死，固定于鼠板，剪開腹壁皮膚，注射2 mL生理鹽水，轉動鼠板1 min，吸出腹腔洗液1 mL，平均分滴于載玻片上，置于37℃CO2培養(yǎng)箱30 min。用生理鹽水漂洗晾干，在油鏡下計數(shù)吞噬細胞，計算吞噬率和吞噬指數(shù)。吞噬率或吞噬指數(shù)表示小鼠巨噬細胞的吞噬能力。

1.4.2.7 碳廓清實驗

小鼠尾靜脈注射稀釋的墨汁，2 min（t1）和10 min（t2）后分別從內眥靜脈叢取血20 μL，將其加入Na2CO3溶液中，以Na2CO3溶液作空白對照，在600 nm波長處測光密度值，以吞噬指數(shù)a表示小鼠碳廓清的能力。

式中：K為碳廓清指數(shù)；OD1和OD2分別為2 min和10 min所取血樣的光密度值。

1.4.2.8 NK細胞活性測定

處死小鼠后無菌取脾，制成單個細胞懸液，按乳酸脫氫酶法[10]，用酶標儀在490 nm處測OD值，計算NK細胞活性。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

數(shù)據(jù)結果以平均值±標準差表示，以便結果與分析使用。實驗數(shù)據(jù)用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件進行方差分析，方差不齊者用秩和檢驗。

2 結果與分析

2.1 藍莓鮮果及發(fā)酵原漿凍干粉功效成分含量

藍莓鮮果及發(fā)酵原漿凍干粉中功效成分含量見表1。

2.2 藍莓發(fā)酵原漿凍干粉對小鼠臟器指數(shù)的影響

藍莓發(fā)酵原漿凍干粉對小鼠臟器指數(shù)的影響見表2。

表2 藍莓發(fā)酵原漿凍干粉對小鼠臟器指數(shù)的影響Table 2 Effect of freeze-dried blueberry fermented pulp powder on organ index of mice

如表2所示，藍莓發(fā)酵原漿凍干粉3個劑量組小鼠的脾指數(shù)和胸腺指數(shù)與空白對照組相比無顯著性差異。表明藍莓發(fā)酵原漿凍干粉對小鼠免疫器官的質量無明顯影響。

2.3 藍莓發(fā)酵原漿凍干粉對ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉化的影響

藍莓發(fā)酵原漿凍干粉對ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉化的影響見表3。

表3 藍莓發(fā)酵原漿凍干粉對ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉化的影響Table 3 Effect of freeze-dried blueberry fermented pulp powder on ConA-induced transformation of splenic lymphocytes in mice

如表3所示，藍莓發(fā)酵原漿凍干粉3個劑量組的OD差值與空白對照組相比無顯著性差異。說明藍莓發(fā)酵原漿凍干粉對小鼠的淋巴細胞增殖能力無明顯影響。

2.4 藍莓發(fā)酵原漿凍干粉對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應的影響

藍莓發(fā)酵原漿凍干粉對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應的影響見表4。

表4 藍莓發(fā)酵原漿凍干粉對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應的影響Table 4 Effect of freeze-dried blueberry fermented pulp powder on delayed type hypersensitivity in mice

如表4所示，藍莓發(fā)酵原漿凍干粉1.50 g/kg bw和2.25 g/kg bw劑量組小鼠足跖增厚程度顯著高于空白對照組（P＜0.05）。說明藍莓發(fā)酵原漿凍干粉可顯著提高小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應程度。

2.5 藍莓發(fā)酵原漿凍干粉對小鼠血清溶血素產(chǎn)生的影響

藍莓發(fā)酵原漿凍干粉對小鼠血清溶血素產(chǎn)生的影響見表5。

表5 藍莓發(fā)酵原漿凍干粉對小鼠血清溶血素產(chǎn)生的影響Table 5 Effect of freeze-dried blueberry fermented pulp powder on the production of serum hemolysin in mice

如表5所示，藍莓發(fā)酵原漿凍干粉3個劑量組的小鼠抗體積數(shù)均顯著高于空白對照組（P＜0.05）。說明藍莓發(fā)酵原漿凍干粉能明顯提高小鼠血清溶血素水平。

2.6 藍莓發(fā)酵原漿凍干粉對小鼠抗體生成細胞產(chǎn)生的影響

藍莓發(fā)酵原漿凍干粉對小鼠抗體生成細胞產(chǎn)生的影響見表6。

如表6所示，藍莓發(fā)酵原漿凍干粉1.50 g/kg bw和2.25 g/kg bw劑量組的小鼠溶血空斑數(shù)顯著高于空白對照組（P＜0.05）。溶血空斑數(shù)反映抗體生成細胞數(shù)，結果表明藍莓發(fā)酵原漿凍干粉對小鼠抗體生成細胞增殖有明顯作用。

表6 藍莓發(fā)酵原漿凍干粉對小鼠抗體生成細胞產(chǎn)生的影響Table 6 Effect of freeze-dried blueberry fermented pulp powder on antibody-producing cells in mice

2.7 藍莓發(fā)酵原漿凍干粉對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力的影響

藍莓發(fā)酵原漿凍干粉對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力的影響見表7。

表7 藍莓發(fā)酵原漿凍干粉對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力的影響Table 7 Effect of freeze-dried blueberry fermented pulp powder on phagocytosis of chicken red blood cells by peritoneal macrophages in mice

如表7所示，藍莓發(fā)酵原漿凍干粉3個劑量組的小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的吞噬率和吞噬指數(shù)與空白對照組相比無顯著性差異。說明藍莓發(fā)酵原漿凍干粉對小鼠巨噬細胞的吞噬功能無明顯影響。

2.8 藍莓發(fā)酵原漿凍干粉對小鼠碳廓清的影響

藍莓發(fā)酵原漿凍干粉對小鼠碳廓清的影響見表8。

表8 藍莓發(fā)酵原漿凍干粉對小鼠碳廓清的影響Table 8 Effect of freeze-dried blueberry fermented pulp powder on carbon clearance in mice

如表8所示，藍莓發(fā)酵原漿凍干粉3個劑量組的吞噬指數(shù)a與空白對照組相比無顯著性差異。說明藍莓發(fā)酵原漿凍干粉對小鼠碳廓清能力無明顯影響。

2.9 藍莓發(fā)酵原漿凍干粉對小鼠的NK細胞活性的影響

藍莓發(fā)酵原漿凍干粉對小鼠NK細胞活性的影響見表9。

表9 藍莓發(fā)酵原漿凍干粉對小鼠NK細胞活性的影響Table 9 Effect of freeze-dried blueberry fermented pulp powder on NK cells activity in mice

如表9所示，藍莓發(fā)酵原漿凍干粉3個劑量組小鼠NK細胞活性與空白對照組相比無顯著性差異。結合其腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力實驗結果，表明藍莓發(fā)酵原漿凍干粉對機體的非特異性免疫功能無明顯影響。

3 討論

與鮮果相比，藍莓發(fā)酵原漿中的多糖含量和SOD含量增多。發(fā)酵初期，藍莓中的單糖以碳源形式被微生物代謝分解，產(chǎn)生胞外多糖，這些胞外多糖一般是由單種或多種單糖組成的重復單元，大部分胞外多糖不再被微生物利用，進入機體后可發(fā)揮其抗氧化、免疫調節(jié)等生理功能[14-15]。生物體內SOD基因的表達調控與所處環(huán)境和細胞的新陳代謝變化有關[16]，可能是發(fā)酵環(huán)境使發(fā)酵菌株的SOD表達增加，進而藍莓發(fā)酵原漿中的SOD含量增多。鞣花酸和花青素屬于酚類化合物，發(fā)酵過程中不斷被氧化分解[17-18]，二者含量減少。這也使得藍莓發(fā)酵原漿苦澀味減少，口感更加柔和[19]。

本文設計了臟器指數(shù)測定、脾淋巴細胞轉化實驗、遲發(fā)型變態(tài)反應實驗、血清溶血素和抗體生成細胞測定、腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗、碳廓清實驗和NK細胞活性測定等實驗，觀察藍莓發(fā)酵原漿凍干粉的增強免疫力作用。胸腺和脾臟是重要的免疫器官，脾淋巴細胞轉化實驗和遲發(fā)型變態(tài)反應實驗反映機體細胞免疫水平；血清溶血素測定和抗體生成細胞檢測反映機體體液免疫水平；腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗和碳廓清實驗反映吞噬細胞功能；NK細胞活性則反映非特異性免疫功能[20-22]。結果顯示，藍莓發(fā)酵原漿凍干粉能夠增強小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應，促進小鼠抗體生成細胞產(chǎn)生，故具有增強免疫力功能。

遲發(fā)型變態(tài)反應是由致敏T細胞與相應抗原結合而引起的一種免疫應答[20]，分為識別、激活和效應3個階段。當抗原攻擊機體時，首先被識別，再誘導T細胞轉化為致敏T細胞。藍莓發(fā)酵原漿凍干粉中的營養(yǎng)成分能為T細胞的增殖提供物質基礎。此外，熊果酸、藍莓多糖、花青素具有提高機體免疫的能力。其中熊果酸和藍莓多糖已被證實能在遲發(fā)型變態(tài)反應激活階段促進細胞因子分泌[23-24]。藍莓中的花青素具有極強的抗氧化活性和自由基清除功能[25]，可間接提高機體免疫功能，但有關其特異性免疫機制目前所見報道較少。

體液免疫依靠B淋巴細胞產(chǎn)生效應B細胞和記憶細胞，效應B細胞分泌抗體清除抗原，記憶細胞不分泌抗體，參與二次免疫反應[26]。紅細胞與血清溶血素混合后，血清溶血素可與紅細胞表面的抗原結合，誘導補體系統(tǒng)激活。溶血反應程度越高，血清抗體的水平越高，機體免疫功能越高[27]?？贵w生成細胞檢測用于測定效應B細胞產(chǎn)生抗體的能力。本研究顯示血清溶血素的抗體積數(shù)和抗體生成細胞檢測的溶血空斑數(shù)顯著升高，側面反映藍莓發(fā)酵原漿凍干粉能提高B淋巴細胞的增殖分化能力和效應B細胞抗體釋放能力。具體可能是因為藍莓發(fā)酵原漿凍干粉中的多種功效成分通過免疫細胞和免疫分子兩方面提高小鼠免疫功能。關于藍莓發(fā)酵原漿凍干粉對小鼠的臟器指數(shù)、淋巴細胞增殖能力、巨噬細胞吞噬功能、碳廓清能力和NK細胞活性方面無明顯影響，目前原因尚不明確，有待進一步探究。

4 結論

藍莓發(fā)酵原漿凍干粉在中、高劑量水平上可顯著提高小鼠足跖腫脹程度，各劑量組均可顯著提高小鼠血清溶血素水平，中、高劑量水平上可顯著提高小鼠抗體生成細胞增殖能力。因此該藍莓發(fā)酵原漿凍干粉對小鼠細胞免疫和體液免疫有一定增強作用。綜上所述，藍莓發(fā)酵原漿凍干粉具有增強免疫力的功能，有望進一步開發(fā)利用。