朱玉青 楊莎莎 栗曉冉 陳桂萍 萬(wàn)錫銘 河南省醫(yī)療器械檢驗(yàn)所；國(guó)家藥監(jiān)局體外診斷試劑質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 （河南 鄭州 450018）

內(nèi)容提要：目的：評(píng)價(jià)兩廠家的熒光免疫層析法肌鈣蛋白I（cTnI）檢測(cè)試劑質(zhì)量性能的一致性。方法：檢測(cè)樣本為企業(yè)參考品，采用Origin 2019軟件對(duì)其質(zhì)量控制的關(guān)鍵技術(shù)性能的一致性進(jìn)行分析。結(jié)果：Kolmagorov-Smirnov檢驗(yàn)分析顯示，在0.05水平下，其最低檢測(cè)限、重復(fù)性（25ng/mL）、批間差（25ng/mL）存在顯著不同，其重復(fù)性（1ng/mL）、準(zhǔn)確度、特異性、批間差（1ng/mL）不存在顯著不同；函數(shù)擬合分析顯示，其線性方程Spearman相關(guān)系數(shù)r=1，相關(guān)性高。結(jié)論：其最低檢測(cè)限、重復(fù)性（25ng/mL）、批間差（25ng/mL）不一致；其重復(fù)性（1ng/mL）、準(zhǔn)確度、特異性、批間差（1ng/mL）一致性良好，線性相關(guān)性良好；綜合分析認(rèn)為，其cTnI檢測(cè)試劑的質(zhì)量性能不一致。根據(jù)分析結(jié)果，提出以下建議：選擇更合適的抗原抗體原材料、提高試劑生產(chǎn)工藝、應(yīng)用新興標(biāo)記材料等新技術(shù)以提高不同廠家檢測(cè)試劑的質(zhì)量性能的一致性。

心肌肌鈣蛋白I（cTnI）是心臟疾病標(biāo)志物檢測(cè)的金指標(biāo)，比肌酸激酶同工酶等其他心臟標(biāo)志物具有更高敏感性和特異性，被用于胸痛早期、急性心肌梗死、急性冠脈綜合征（ACS）的快速診斷以及輔助ACS危險(xiǎn)分層和預(yù)后等判斷參考中[1-3]。熒光免疫層析技術(shù)作為一種POCT定量檢測(cè)技術(shù)被越來(lái)越多地應(yīng)用于疾病快速篩查和檢測(cè)中。免疫層析法檢測(cè)試劑（盒）技術(shù)審評(píng)規(guī)范（2017版）對(duì)cTnI定性免疫層析試劑的質(zhì)量性能做了技術(shù)審評(píng)規(guī)范，但不同試劑廠家的原輔材料和生產(chǎn)工藝不完全相同，各企業(yè)參考品也不完全相同，那么不同廠家的試劑質(zhì)量性能是否完全一致呢？基于此，本文對(duì)不同廠家的cTnI熒光免疫層析檢測(cè)試劑的質(zhì)量性能的一致性進(jìn)行評(píng)價(jià)研究，具體是對(duì)控制試劑質(zhì)量性能的幾個(gè)關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)進(jìn)行Origin 2019軟件分析和評(píng)價(jià)，并分析發(fā)生原因和提出合理化建議。

1.材料與方法

1.1 一般材料

檢測(cè)樣本：檢測(cè)樣本為企業(yè)參考品。廠家1共130例：最低檢測(cè)限20例、重復(fù)性20例（其中1ng/mL、25ng/mL各10例）、準(zhǔn)確度3例、線性18例、特異性9例、批間差60例（其中1ng/mL、25ng/mL各30例）；廠家2共75例：最低檢測(cè)限20例、重復(fù)性16例（其中1ng/mL、25ng/mL各8例）、準(zhǔn)確度3例、線性15例、特異性3例、批間差18例（包括1ng/mL、25ng/mL各9例）。

儀器設(shè)備：廠家1：自產(chǎn)Virion-1800熒光免疫分析儀，廠家2：自產(chǎn)干式熒光免疫分析儀。

檢測(cè)試劑：廠家1的3批批號(hào)為20170001、20170002、20170003，廠家2的3批批號(hào)為201802001、201802002、201802003，于2017年11月開始，經(jīng)歷四個(gè)月左右的準(zhǔn)備及實(shí)驗(yàn)，2018年3月進(jìn)行結(jié)果分析，試劑質(zhì)量性能符合2017版免疫層析法檢測(cè)試劑技術(shù)審評(píng)規(guī)范、符合各自企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 方法

方法學(xué)性能評(píng)價(jià)：通過(guò)對(duì)兩廠家cTnI檢測(cè)試劑質(zhì)量性能的關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)的檢測(cè)對(duì)比，對(duì)其一致性進(jìn)行評(píng)價(jià)研究。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Origin 2019軟件對(duì)兩廠家cTnI檢測(cè)試劑的最低檢測(cè)限、重復(fù)性、準(zhǔn)確度、特異性、線性和相關(guān)性、批間差等技術(shù)指標(biāo)進(jìn)行對(duì)比分析，采用Pearson相關(guān)系數(shù)r進(jìn)行相關(guān)性分析，P＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 最低檢測(cè)限、重復(fù)性（1ng/mL和25ng/mL）和準(zhǔn)確度

最低檢測(cè)限、重復(fù)性（1ng/mL和25ng/mL）和準(zhǔn)確度的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、檢測(cè)樣本個(gè)數(shù)及各樣本間的關(guān)系通過(guò)Origin 2019統(tǒng)計(jì)分析顯示見圖1。采用Kolmagorov-Smirnov檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示，對(duì)于最低檢測(cè)限，P＜0.05，兩者最低檢測(cè)限顯著不同，廠家1明顯大于廠家2；對(duì)于重復(fù)性（1ng/mL），P＞0.05，兩者不存在顯著不同；對(duì)于重復(fù)性（25ng/mL）P＜0.05，兩者顯著不同，廠家1明顯小于廠家2；對(duì)于準(zhǔn)確度，用回收率（R）表示，檢測(cè)樣本廠家1稀釋方案：高濃度cTnI：低濃度cTnI（40:0.15=1:9），廠家2稀釋方案：高濃度cTnI：低濃度cTnI（50:0.2=1:9），分析顯示P＞0.05，兩者準(zhǔn)確度不存在顯著不同。

圖1.兩廠家的最低檢測(cè)限、重復(fù)性、準(zhǔn)確度檢測(cè)結(jié)果（注：1a.最低檢測(cè)限；1b.重復(fù)性；1c.準(zhǔn)確度檢測(cè)結(jié)果）

2.2 線性和相關(guān)性、特異性檢測(cè)

線性和相關(guān)性檢測(cè)中，廠家1有6個(gè)檢測(cè)樣本：50ng/mL、25ng/mL、10ng/mL、2ng/mL、0.5ng/mL、0.1ng/mL；廠家2有5個(gè)檢測(cè)樣本：50ng/mL、25ng/mL、5ng/mL、1ng/mL、0.2ng/mL；其中每個(gè)樣本做3個(gè)重復(fù)，取平均值進(jìn)行函數(shù)擬合。Origin 2019 Spearman相關(guān)性分析和和雙尾顯著檢驗(yàn)相關(guān)性分析結(jié)果（圖2a）顯示，Spearman相關(guān)系數(shù)r=1，兩者相關(guān)性高。

圖2.兩廠家檢測(cè)樣本的函數(shù)擬合、特異性檢測(cè)結(jié)果（注：2a.函數(shù)擬合檢測(cè)結(jié)果；2b.特異性檢測(cè)結(jié)果）

特異性檢測(cè)中，其檢測(cè)樣本、及各樣本間的數(shù)值關(guān)系通過(guò)Origin 2019散點(diǎn)統(tǒng)計(jì)圖進(jìn)行分析（圖2b），Kolmagorov-Smirnov檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示，P＞0.05，兩者特異性不存在顯著不同。

2.3 批間差（1ng/mL和25ng/mL）檢測(cè)

批間差（1ng/mL和25ng/mL）檢測(cè)中，其平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、檢測(cè)樣本個(gè)數(shù)及各樣本間的數(shù)值關(guān)系通過(guò)Origin 2019統(tǒng)計(jì)分析顯示如下（圖3）。Kolmagorov-Smirnov檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示，對(duì)于批間差（1ng/mL），P＞0.05，兩者不存在顯著不同；對(duì)于批間差（25ng/mL），P＜0.05，兩者顯著不同，廠家1明顯小于廠家2。

圖3.兩廠家的1ng/mL和25ng/mL檢測(cè)樣品批間差檢測(cè)結(jié)果（3a.1ng/mL檢測(cè)樣品；3b.25ng/mL檢測(cè)樣品）

3.討論

從以上結(jié)果可知，對(duì)于試劑的質(zhì)量性能指標(biāo)，兩廠家的最低檢測(cè)限、重復(fù)性（25ng/mL）、批間差（25ng/mL）不一致，重復(fù)性（1ng/mL）、準(zhǔn)確度、特異性、批間差（1ng/mL）、線性一致性好，且兩者線性相關(guān)性良好。本研究綜合分析認(rèn)為，兩廠家cTnI檢測(cè)試劑的質(zhì)量性能不一致。

結(jié)合這些結(jié)果，對(duì)cTnI檢測(cè)試劑的質(zhì)量性能及其一致性進(jìn)行進(jìn)一步分析探討。兩廠家最低檢測(cè)限不一致，原因可能為：不同試劑廠家使用的抗體原材料不同；不同心臟病類型中的cTnI半衰期不同。對(duì)于第一種原因，不同廠家可以選擇能夠識(shí)別抗體高穩(wěn)定性cTnI抗原中央?yún)^(qū)（30-100氨基酸序列）的抗體作為原材料來(lái)實(shí)現(xiàn)該項(xiàng)指標(biāo)的一致和標(biāo)準(zhǔn)化；對(duì)于第二種原因，因cTnI在循環(huán)系統(tǒng)中通常是以二元或者三元復(fù)合物形式存在，恰當(dāng)使用EDTA等Ca2+離子螯合劑可使復(fù)合物降解，從而使檢測(cè)結(jié)果保持一致。兩廠家的重復(fù)性（1ng/mL）一致性好，重復(fù)性（25ng/mL）不一致，這項(xiàng)指標(biāo)的優(yōu)劣在一定程度上反映試劑生產(chǎn)工藝的優(yōu)劣，可通過(guò)改善生產(chǎn)工藝提高試劑質(zhì)量。兩廠家準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)一致性良好，主要是考察檢測(cè)值趨近于真實(shí)值的程度，通常用回收率實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，本研究中兩廠家采用的均是稀釋回收率實(shí)驗(yàn)。準(zhǔn)確度的影響因素有血清基質(zhì)的非特異性影響，實(shí)驗(yàn)中應(yīng)盡量減少如溶血、高膽紅素血癥、風(fēng)濕因子等的影響，并選擇已純化、性能穩(wěn)定、濃度已知的高濃度抗原按一定比例稀釋成系列溶液，至少配制3個(gè)不同濃度添加到空白中，每個(gè)濃度參考品配制2份[2]。兩廠家特異性檢驗(yàn)一致性良好，本研究采用的是實(shí)際測(cè)量值方法，即對(duì)cTnI的結(jié)構(gòu)類似物：含1000ng/L的cTnC、含1000ng/L的cTnT、含1000ng/L的sTnI的樣品分別進(jìn)行實(shí)際值測(cè)量。資料顯示，自身抗體和類風(fēng)濕因子等會(huì)對(duì)試劑特異性產(chǎn)生影響，將捕獲抗體的抗原表位選擇在氨基酸N-末端和C-末端可以減少自身抗體對(duì)cTnI試劑特異性的影響[5]。另外，由于熒光標(biāo)記免疫分析技術(shù)方法本身的局限性和特點(diǎn)，試劑的最低檢測(cè)限和特異性是一對(duì)相關(guān)聯(lián)的技術(shù)指標(biāo)，因此試劑在研發(fā)生產(chǎn)中應(yīng)根據(jù)不同的臨床標(biāo)志物、特異性和靈敏度的實(shí)際情況需要進(jìn)行抗體原材料的篩選[6]。對(duì)于批間差檢測(cè)，是一種分析間精密度檢測(cè)。本研究中該項(xiàng)指標(biāo)是在同一試劑不同批次間進(jìn)行的檢測(cè)，標(biāo)準(zhǔn)要求其變異系數(shù)（CV）或者相對(duì)極差（R）不大于15%。Origin 2019分析結(jié)果顯示，兩廠家批間差（1ng/mL）一致性良好，批間差（25ng/mL）不一致。

基于以上分析，特提出一些建議，以更好地發(fā)揮cTnI試劑在心血管疾病早期診斷、危險(xiǎn)分層、預(yù)后、治療中的作用：①生產(chǎn)廠家需要進(jìn)一步提高cTnI試劑質(zhì)量。改進(jìn)措施可以有：選擇優(yōu)質(zhì)良好的抗原、抗體原材料，如捕獲抗體可選擇具有C端和N端抗原表位的抗體片段或者能夠識(shí)別高穩(wěn)定性cTnI中央?yún)^(qū)（30-100氨基酸序列）的抗體，這有助于改善各廠家cTnI試劑的最低檢測(cè)限和特異性的一致性；提高固化生產(chǎn)工藝有利于改善試劑的重復(fù)性、批間差；新興納米材料和生物傳感器的使用有助于生產(chǎn)出超靈敏、背景更小的試劑；上轉(zhuǎn)換發(fā)光、“無(wú)標(biāo)記”等技術(shù)的使用有助于生產(chǎn)出更優(yōu)質(zhì)的定量檢測(cè)試劑；血清盤結(jié)合生物標(biāo)記算法建立的統(tǒng)一校正標(biāo)準(zhǔn)品有助于生產(chǎn)出更優(yōu)質(zhì)、一致性更好的檢測(cè)試劑[7]。②試劑上市前增加對(duì)臨床樣本的檢測(cè)以對(duì)試劑質(zhì)量性能進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證評(píng)估。③避免臨床中對(duì)疾病本身無(wú)關(guān)、不必要、不合理的檢測(cè)以及對(duì)檢測(cè)結(jié)果的誤判和不正確的分析解釋等，避免在健康女性、嬰兒和新生兒體檢中cTnI升高誤判現(xiàn)象的發(fā)生，減少血清基質(zhì)中非特異性物質(zhì)（溶血、高膽紅素血癥、風(fēng)濕因子等）的影響，應(yīng)結(jié)合患者心電圖等檢測(cè)指標(biāo)和臨床癥狀對(duì)cTnI升高患者進(jìn)行綜合判斷和正確解釋[7]。④選擇心臟標(biāo)志物聯(lián)檢（如cTnI、NT-proBNP和D-Dimer聯(lián)檢或者cTnI、Myo和CK-MB聯(lián)檢）和與之相適應(yīng)的其他POCT檢測(cè)方法。