楊秀容, 孟海濤, 李強(qiáng)明, 羅建平

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601)

安徽霍山主產(chǎn)霍山石斛(Dendrobiumhuoshanense)、鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)、細(xì)莖石斛(Dendrobiummoniliforme)3種石斛,均為蘭科石斛屬草本植物[1-2]?！侗静菥V目拾遺》中記載石斛“清胃除虛熱,生津已勞損”[3],石斛可用于陰傷津虧、口干煩渴、食少干嘔、病后虛熱、目暗不明,是一種名貴的中藥材,莖是石斛主要藥用部位[4-6]。石斛主要有多糖、生物堿、黃酮類、氨基酸、微量元素等多種活性成分[7-11],正是這些組分使其可以發(fā)揮保肝、降血糖、抗氧化、抗腫瘤等作用,但3種石斛的功效卻有明顯差異,其中霍山石斛最佳[12-17]。3種石斛的形態(tài)在新鮮莖上有差異,干燥后的楓斗制品形態(tài)相似,不易區(qū)分,因此市場(chǎng)上常出現(xiàn)使用鐵皮石斛、細(xì)莖石斛來(lái)冒充霍山石斛進(jìn)行銷售的現(xiàn)象。為更好地區(qū)分3種霍山產(chǎn)石斛,本研究通過(guò)對(duì)全年12個(gè)月的3種霍山產(chǎn)石斛莖的甲醇提取物進(jìn)行高效液相色譜儀(high performance liquid chromatography,HPLC)分析以建立指紋圖譜,通過(guò)對(duì)HPLC指紋圖譜進(jìn)行對(duì)比研究以發(fā)現(xiàn)3種霍山產(chǎn)石斛莖的化學(xué)成分變化規(guī)律及差異,為區(qū)分和鑒別3種霍山產(chǎn)石斛提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀(配有可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器、柱溫箱、四元泵),JK-300DVB型三頻數(shù)控超聲波清洗器(合肥金尼克機(jī)械制造有限公司),AL104電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司),VAPML旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó)Heidolph公司),XT5118-OV140電熱鼓風(fēng)干燥箱。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

3種石斛采收于霍山縣太平畈鄉(xiāng)王家店村霍山石斛種植基地,由合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院羅建平教授鑒定,從1—12月份每月采收1次,霍山石斛樣品記為A1～A12,鐵皮石斛樣品記為B1～B12,細(xì)莖石斛樣品記為C1～C12。

色譜級(jí)乙腈、色譜級(jí)甲醇(美國(guó) TEDIA 試劑公司),色譜級(jí)乙酸(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司),超純水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 供試品溶液的制備

稱取不同月份3種石斛莖粉末(過(guò)80目篩)0.400 0 g,置于100 mL三角瓶中,加入 20 mL甲醇超聲溶解,上清液濃縮蒸干,加入甲醇溶解定容至 2 mL,搖勻過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜,備用。

1.3.2 色譜條件

色譜條件參考文獻(xiàn)[18],具體如下:色譜柱為Agilent C18(150×4.6 mm,5 μm),流動(dòng)相為乙腈、0.1%乙酸,洗脫梯度(0～10 min、30%乙腈;10～20 min、35%乙腈; 20～40 min、55%乙腈;40～45 min、70%乙腈;45～90 min、100%乙腈);檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm;流速為0.8 mL/min;柱溫為35 ℃;上樣量為20 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種石斛指紋圖譜的建立

將石斛樣品A1～A12、B1～B12、C1～C12按供試品溶液的制備方法制備,將制成的供試品進(jìn)行色譜檢測(cè)分析,提取樣品在270 nm處的色譜圖。可以得到霍山石斛、鐵皮石斛、細(xì)莖石斛3種石斛12個(gè)月的石斛莖指紋圖譜,如圖1所示。

圖1 3種石斛莖的12個(gè)月指紋圖譜比較

根據(jù)各樣品指紋圖譜中各色譜峰的保留時(shí)間,選取峰形較好且分離度較高的17個(gè)峰作為研究色譜的指紋峰。這17個(gè)峰在3種石斛相應(yīng)位置均有出現(xiàn),各色譜峰的平均保留時(shí)間見表1所列。

表1 17個(gè)共有峰保留時(shí)間

2.2 相似度分析

本文分別將3種石斛樣品所得到的莖的色譜圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A(國(guó)家藥典委員會(huì)),結(jié)果發(fā)現(xiàn)7月份指紋圖譜峰形較好、分離度較高、且較為穩(wěn)定,因此選擇作為參照。分別以A7、B7、C7樣品色譜圖作為對(duì)照,計(jì)算相應(yīng)對(duì)照?qǐng)D譜與樣品圖譜的相似度數(shù)據(jù),霍山石斛12個(gè)月的莖指紋圖譜相似度在0.979～0.999之間,鐵皮石斛12個(gè)月的莖指紋圖譜相似度在0.986～0.999之間,細(xì)莖石斛12個(gè)月的莖指紋圖譜相似度在0.457～0.992之間。結(jié)果表明,不同采收期的霍山石斛和鐵皮石斛莖化學(xué)成分均具有比較好的穩(wěn)定性,而不同采收期的細(xì)莖石斛莖所含的化學(xué)成分和質(zhì)量有一定的區(qū)別。

2.3 3種石斛莖指紋圖譜分析

3種石斛指紋圖譜標(biāo)定了17個(gè)共有峰,為了比對(duì)3種石斛指紋圖譜在各個(gè)月份間的差異性,用色譜峰面積來(lái)表示峰強(qiáng)度,將3種石斛的17個(gè)色譜峰在各個(gè)月份間的色譜峰強(qiáng)度差異進(jìn)行比較,如圖2所示。

圖2 3種石斛莖的12個(gè)月17個(gè)共有峰的強(qiáng)弱分析

從圖2可看出,1～3月份細(xì)莖石斛的1號(hào)峰含量很低,鐵皮石斛的16號(hào)峰含量很低。在4月份,霍山石斛的6、16號(hào)峰含量相對(duì)較高,而鐵皮石斛和細(xì)莖石斛的6、16號(hào)峰含量很低。在5月份,鐵皮石斛的6、16號(hào)峰含量依然很低,霍山石斛6號(hào)峰含量大于細(xì)莖石斛。在6月份,霍山石斛的2、6號(hào)峰含量相對(duì)較高,細(xì)莖石斛的16號(hào)峰含量較高。在8月份,霍山石斛2號(hào)峰含量很高,鐵皮石斛的8號(hào)峰含量很低,同時(shí)在16.55 min處細(xì)莖石斛出現(xiàn)了明顯的特征峰。在8月份,霍山石斛的2、6、16號(hào)峰的含量均高于另外2種石斛,同時(shí)鐵皮石斛的2、6號(hào)峰含量比細(xì)莖石斛高。在9月份,細(xì)莖石斛的1、2、6號(hào)峰峰值均高于鐵皮石斛,而霍山石斛的1號(hào)峰含量較低，而2、6號(hào)峰含量則相對(duì)較高。在10月份,細(xì)莖石斛1號(hào)峰含量很高,鐵皮石斛次之,霍山石斛的1號(hào)峰含量最低;霍山石斛的6號(hào)峰含量較高,鐵皮石斛次之,而細(xì)莖石斛6號(hào)峰的含量最低。在11月份,細(xì)莖石斛在8.12 min處存在特異性色譜峰,霍山石斛的6號(hào)峰含量比鐵皮石斛和細(xì)莖石斛高,鐵皮石斛16號(hào)峰含量比霍山石斛和細(xì)莖石斛高。在12月份,在1號(hào)峰的含量上,鐵皮石斛最高,細(xì)莖石斛次之,霍山石斛最低;在6號(hào)峰的含量上,霍山石斛最高,細(xì)莖石斛次之,鐵皮石斛最低;在16號(hào)峰的含量上,霍山石斛最高,細(xì)莖石斛次之,鐵皮石斛最低。根據(jù)3種石斛莖12個(gè)月指紋圖譜中17個(gè)共有峰的峰強(qiáng)度比較發(fā)現(xiàn)，3種石斛的1、2、6、8、16號(hào)共有峰峰強(qiáng)度差異顯著,細(xì)莖石斛在8.12、16.55 min 處存在特征色譜峰。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)3種石斛莖HPLC指紋圖譜進(jìn)行對(duì)比研究,標(biāo)定了17個(gè)共有峰,相似度分析表明，不同月份的霍山石斛和鐵皮石斛莖化學(xué)成分具有比較好的穩(wěn)定性,而不同月份的細(xì)莖石斛莖所含的化學(xué)成分和質(zhì)量有一定的區(qū)別。3種石斛莖指紋圖譜存在顯著差異,主要表現(xiàn)在共有峰峰強(qiáng)度和特征色譜峰上,將1、2、6、8、16號(hào)共有峰與8.12、16.55 min 處色譜峰組合可對(duì)3種石斛進(jìn)行有效的鑒別,為3種石斛的區(qū)別和鑒定提供了新的方法和途徑。