譚本仁，鄭錦坤，黃義純，徐曉梅，劉宴林

（1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬粵北人民醫(yī)院，廣東 韶關(guān) 512026；2.韶關(guān)市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東 韶關(guān) 512028）

痔清舒洗劑是汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬粵北人民醫(yī)院基于傳統(tǒng)中醫(yī)理論和臨床實(shí)效研制的中藥復(fù)方外用洗劑，已應(yīng)用于臨床多年，效果明顯，療效確切，受到患者的一致好評(píng)，該制劑具有清熱解毒、燥濕止癢、行氣活血、消腫止痛等功效，主要由大黃、蒲公英、黃柏、沒藥等多味中草藥提煉而成?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為廣東省藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)（粵ZB20111771），標(biāo)準(zhǔn)僅規(guī)定了顏色、氣味等性狀、個(gè)別藥材鑒別、相對(duì)密度和PH值等，對(duì)主要成分未有定量分析標(biāo)準(zhǔn)。前期本人僅對(duì)痔清舒洗劑中大黃素和大黃酚進(jìn)行了HPLC含量檢測(cè)[1]，本實(shí)驗(yàn)擬采用HPLC法同時(shí)測(cè)定痔清舒洗劑中的綠原酸、咖啡酸和鹽酸小檗堿三種主要水溶性成分。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀（安捷倫公司Aglient 1260），島津SHIMADZU（LC-30AD）；色譜柱：伊力特Hypersil ODS2（5 μm，250 mm×4.6 mm），Kromasil 100-5-C18（5 μm，250 mm×4.6 mm），Agilent ZORBAX RX-C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）。METTLE TOLEDO AG135電子天平（精密0.000 01g）；HT-300BQ超聲波清洗儀（濟(jì)寧恒通）。

1.2 試藥

綠原酸對(duì)照品（批號(hào)：110753-201817，純度：96.8%）、咖啡酸對(duì)照品（批號(hào)：110885-200102，純度：100%）鹽酸小檗堿對(duì)照品（批號(hào)：110713-201814，純度：86.7%）（中國(guó)食品藥品檢定研究院）；痔清舒洗劑（粵北人民醫(yī)院制劑，批號(hào)分別為：20200212，20200227，20200617）；乙腈、甲醇為色譜純，TEDIA公司，水為重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

用十八基硅烷鍵合硅膠為填充劑，經(jīng)反復(fù)多次預(yù)試驗(yàn)確定采用梯度洗脫，乙腈為流動(dòng)相A，1%磷酸為流動(dòng)相B，洗脫梯度見表1。

表1 流動(dòng)相洗脫梯度

柱溫：30℃；流速：1 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為324 nm，進(jìn)樣量10 μL。理論板數(shù)按綠原酸計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

2.2 溶液的制備

精密稱取綠原酸對(duì)照品、咖啡酸對(duì)照品和鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，加50%甲醇分別制成濃度為0.710 5 mg·mL-1、0.203 2 mg·mL-1和 0.185 2 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。精密量取痔清舒洗劑約20 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取濾液，即得供試品溶液。根據(jù)痔清舒洗劑說明書中4味藥的比例配制成缺主藥的陰性藥品作為研究對(duì)象，按照所提供4種藥物試品溶液的制備方法，制備成實(shí)驗(yàn)所需的陰性對(duì)照溶液。

2.3 線性范圍考察

分別吸取“2.2”項(xiàng)下3種對(duì)照品溶液各0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、1 mL、2 mL置5個(gè)10 mL量瓶中，將醫(yī)用甲醇溶解并稀釋至所標(biāo)注的刻度，輕輕搖勻，即得所需的稀釋后的甲醇溶液。精密吸取各10 μL，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以對(duì)照品的含量為橫坐，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得出綠原酸、咖啡酸和鹽酸小檗堿的回歸方程及相關(guān)系數(shù)分別為：y綠原酸=1.236 9×104x＋6.225 3×104（r= 0.998 3），y咖啡酸= 2.862 8×104x＋5.606 2×103（r= 1.000），y鹽酸小檗堿 =1.815 3×104x＋4.463 9×103（r= 1.000）。結(jié)果表明：綠原酸在 7.105 μg·mL-1～ 142.1 μg·mL-1、咖啡酸在 4.064 μg·mL-1～ 81.28 μg·mL-1和鹽酸小檗堿在5.556 μg·mL-1～ 111.16 μg·mL-1呈良好的線性關(guān)系。

2.4 專屬性實(shí)驗(yàn)

精密吸取陰性對(duì)照溶液適量，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)行樣測(cè)定，結(jié)果在與對(duì)照品溶液綠原酸、咖啡酸及鹽酸小檗堿出峰位置上無相應(yīng)色譜峰，表明陰性對(duì)照無干擾。見圖1、圖2、圖3。

圖1 對(duì)照品圖譜

圖2 供試品圖譜

圖3 陰性對(duì)照品圖譜

2.5 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的供試品溶液共18份，分別置10 mL量瓶中，并精密加入適量的3種對(duì)照品溶液，加70%甲醇定容至刻度，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣10 μL，測(cè)定，計(jì)算回收率及RSD，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

痔清舒洗劑是由大黃、蒲公英、黃柏、沒藥等多味中草藥組成，大黃性味苦寒，具有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)、利濕退黃的功效[2]。大黃具有廣泛的藥理活性，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化應(yīng)激、抗腫瘤、抗纖維化、止血、調(diào)脂、降糖、調(diào)節(jié)免疫力等藥理作用[3-4]，臨床用于治療實(shí)熱積滯便秘、血熱吐衄、目赤咽腫、牙齦腫痛、臃腫疔瘡、腸癰腹痛、燒燙傷等[2]。蒲公英具有清熱解毒、消腫散結(jié)、利尿通淋的功效[2]，針對(duì)蒲公英提取物和單體活性成分的研究，其藥理上具有抑菌和抗病毒的作用，具有廣譜抑菌作用，對(duì)革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、真菌和病毒均有不同程度的抑制作用，蒲公英具有抗氧化、抗腫瘤、抗疲勞、免疫抑制、抗突變、胃腸黏膜保護(hù)、保護(hù)心肌細(xì)胞、降血糖、利尿等作用[5-6]。黃柏性苦味寒，具有清熱燥濕、瀉火解毒、除蒸療瘡的功效[2]，臨床廣泛用于治療濕熱痢疾、泄瀉、黃疸、骨蒸勞熱、濕疹濕瘡、瘡瘍腫毒等病癥[7]。抗菌、抗炎、解熱、抗癌、抗細(xì)胞凋亡、抗氧化、抗病毒、抗感染、滋陰、降血糖等作用，對(duì)免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)均有一定的影響[8-9]。沒藥性味辛苦平，具有散瘀定痛、消腫生肌的功效[2]。該藥具有抗炎、鎮(zhèn)痛和抗血脂的作用，臨床用于治療折傷馬墜，跌打損傷，骨節(jié)疼痛，金瘡杖瘡，惡瘡痔漏，平產(chǎn)后血刺，癰疽腫痛、瘡瘍潰后久不收口及多種瘀滯痛癥，兼墜胎孕，除目中障翳，心虛膽怯，肝血不足等癥[10-11]。該方中諸藥配伍合理，具有清熱解毒、燥濕止癢、行氣活血、消腫止痛的功效,主治炎性外痔、痔嵌頓，術(shù)后肛緣水腫等癥。所測(cè)定的3種有效成分具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、降血脂、降血糖和免疫調(diào)節(jié)等多方面的藥理作用[12-14]，與痔清舒洗劑所含的有效成分的藥理作用相似。

中藥復(fù)方制劑為多體系組分復(fù)雜，常具有水溶性及脂溶性主要成分，在痔清舒洗劑水溶性主要成分的質(zhì)量控制中，參考了2015年版《中國(guó)藥典》和相關(guān)文獻(xiàn)[15-19]，經(jīng)過反復(fù)的試驗(yàn)，采用以甲醇、乙腈和1%磷酸溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫，綠原酸、咖啡酸及鹽酸小檗堿三種成分的色譜峰峰形對(duì)稱，得到的分離效果最佳，陰性溶液對(duì)照無干擾，參照的系統(tǒng)適應(yīng)性較佳，所采用的HPLC含量測(cè)定方法能較好地測(cè)定綠原酸、咖啡酸及鹽酸小檗堿3種成分的含量，試驗(yàn)結(jié)果提示該測(cè)定方法可行性強(qiáng)，重復(fù)性好，基于前期對(duì)痔清舒洗劑中大黃素和大黃酚含量測(cè)定的試驗(yàn)基礎(chǔ)，該測(cè)定方法和測(cè)定目標(biāo)的選定用于痔清舒洗劑的質(zhì)量控制及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)完善具有積極的意義。

綜上所述，所建立的痔清舒洗劑含有多種藥理活性，具有抗菌、抗炎、抗病毒、免疫抑制、抗?jié)兊茸饔?，既為合理用藥提供依?jù)，又是臨床用藥安全提供保證[20]。所含有的綠原酸、咖啡酸及鹽酸小檗堿從色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)、溶液的制備、線性范圍考察、加樣回收率試驗(yàn)等方面所測(cè)定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，解決了其質(zhì)量控制的難點(diǎn)，客觀地評(píng)價(jià)了痔清舒洗劑質(zhì)量的穩(wěn)定性、有效性，能夠?yàn)槠滟|(zhì)量控制提供參考依據(jù)。