張藝繽，王百通，呂志國，張冬梅，徐 鵬，吳 桐，劉 淼，吳 雷，陳助明，王 健*

（1.長春中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，長春 130117；2.長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，長春 130021）

重癥肌無力（myasthenia gravis，MG）是一種典型的由自身抗體介導引起的發(fā)生在神經肌肉接頭處（neuromuscular junction，NMJ）的自身免疫性疾病，臨床表現(xiàn)為骨骼肌肌肉無力和易疲勞，其特點是晨輕暮重，活動后加重、休息后可減輕[1]。一項大型研究報告指出發(fā)病率1.55/10萬，流行率3.66/10萬[2]，發(fā)病高峰出現(xiàn)在年輕的成年女性和老年男性[3]。

在發(fā)病機制上，乙酰膽堿受體（AChR）抗體陽性占據(jù)大多數(shù)，大約80%的MG患者中發(fā)現(xiàn)AChR抗體呈陽性。且在這類患者中AChR-α亞基陽性＞50%[4]。大約7%～10%的MG患者和高達40%的AChR抗體陰性的全身性MG患者中發(fā)現(xiàn)了肌肉特異性受體酪氨酸激酶（MuSK）抗體[5]。2%～50%的雙血清陰性MG患者中低密度脂蛋白受體相關蛋白（Lrp4）抗體呈陽性[6]。

目前，MG的治療仍以膽堿酯酶抑制劑、糖皮質激素、免疫抑制劑為主，近年來靶向生物制劑逐漸興起，被行業(yè)內所認可，靜脈注射免疫球蛋白、血漿置換以及胸腺切除以其治療成本高及創(chuàng)傷大等原因很少被廣泛應用于臨床[7]。然西醫(yī)的治療多是對癥治療，治標而不治本，且多有毒副作用，治療后患者多反復，研究表明，中醫(yī)藥不僅對本病有較好的療效,而且已形成自己的鮮明特色，并能較好地在實踐中應用[8]。近年來，中醫(yī)藥治療MG作用機制的研究成為熱點，回顧總結中醫(yī)藥對實驗性自身免疫性重癥肌無力（EAMG）作用機制的研究進展，為治療MG中藥新藥的開發(fā)及實驗設計提供思路，為中醫(yī)藥治療MG臨床應用提供更可靠的理論依據(jù)。

1 實驗性自身免疫性重癥肌無力（EAMG）動物模型制備方法

回顧總結近10年中英文文獻，在造模動物種屬選擇上都選的是大鼠或小鼠，品系C57BL/6小鼠和Lewis大鼠，性別都是選用雌性。在納入的研究中造模制備方法共有四種：1）采用人工合成鼠源性AchR-α亞基97-116肽段通過構建EAMG模型應用最多。每200 μL含AchR-α亞基97-116肽段50 μg、結核分枝桿菌H37Ra干粉1 mg，多點皮下注射于造模鼠的肩背部、尾基部、足墊部，第2、3次加強免疫將與不完全弗氏佐劑（IFA）充分混勻含AchR-α亞基 97-116肽段 50 μg、結核分枝桿菌H37Ra干粉1 mg，在相同部位注射強化免疫。2）采用將人工合成AchRα1（129-145）多肽片段按照1/2的比例與CFA完全乳化，配比按照200 μL溶液內含有50 μg多肽片段，皮下注射。3）利用免疫親和層析技術從美國加州電鰩（torpedo of Californica）的電器官中提取、純化乙酰膽堿受體（acetylcholine receptor，AchR），并將純化的AchR與完全福氏佐劑（CFA）以50 μg:200 μL的比例混合，制備成免疫原，在動物的背部、后足趾、尾根部選擇多個注射點分2～3次免疫小鼠。4）收集初診或近一個月內未服用過激素類藥物的MG患者血液，將分離出的血清每次0.8 mL注入免疫小鼠，連續(xù)7 d，制備MG患者血清被動轉移模型。

2 改善T淋巴細胞免疫失衡機制的研究

雷公藤用于各種自身免疫性疾病的治療已得到廣泛認可，劉蘭濤等[9]在研究雷公藤多苷時發(fā)現(xiàn)可降低EAMG模型大鼠胸腺T細胞受體（T-cell receptor，TCR）BVmRNA的表達，從而緩解EAMG癥狀。陳偉[10]研究人參皂苷Rb1（G-rb1）對EAMG模型大鼠影響發(fā)現(xiàn)其可通過上調CD4+CD25+T細胞及CD4+CD25+Foxp3+T細胞數(shù)量來緩解癥狀。朱潔等[11]研究表明升陷湯可能通過升高EAMG大鼠CD4+T淋巴細胞含量，降低CD4+/CD8+的比例，而起到治療作用。吳周燁等[12]采用益氣升提法治療EAMG模型大鼠，發(fā)現(xiàn)其可提高CD4+CD25+Foxp3+Treg比例，降低IFN-γ、IL-17含量，以減少神經肌肉接頭處AchR損害。張運克等[13]研究顯示補脾益腎起痿湯通過影響輔助性T細胞平衡，拮抗炎癥反應，減輕肌無力癥狀的作用。徐鵬[14]根據(jù)王健教授提出的健脾益氣補髓方進行EAMG動物實驗，結果表明健脾益氣補髓方可抑制EAMG大鼠CD4+T細胞、Th17細胞、Thl細胞分化數(shù)量，上調Th2細胞、Treg細胞分化數(shù)量，改善了Thl/Th2/Thl7細胞免疫失衡。

3 改善B淋巴細胞免疫失衡機制的研究

許夢賢[15]闡述益氣升提法治療EAMG大鼠的作用機制既通過下調CD4、上調Foxp3的表達影響T淋巴細胞，減少AchR-Ab的產生，又通過上調CD19的表達，減少IL-10的表達水平，影響B(tài)淋巴細胞群，改變B淋巴細胞系的平衡。

4 調節(jié)細胞因子分泌機制的研究

金碩果等[16]研究癱痿膠囊發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，癱痿膠囊可顯著下調EAMG小鼠外周血清中高表達的白細胞介素4（IL-4）水平，使EAMG小鼠外周血清中轉化生長因子-β（TGF-β）表達水平較模型組水平升高，結果表明癱痿膠囊治療EAMG機制可能是通過下調血清中細胞因子IL-4，上調TGF-β水平，改善免疫耐受等，進一步改善EAMG小鼠的臨床癥狀。牛鳳云[17]認為MG基本病機為脾胃虛損、氣血虧虛，治療應遵循健脾補氣、升陽益損，臨床應用肌力康飲中藥復方治療MG，實驗研究[17]表明肌力康飲降低EAMG大鼠血清中AchR-Ab的水平，與模型組比較肌力康飲各劑量組中EAMG大鼠血清中TGF-β水平明顯升高，說明肌力康飲有助于TGF-β的提高，從而達到治療作用。李春紅等[18]基于溫腎活血、益氣升清的理論基礎，提出益筋方對實驗性自身免疫性重癥肌無力（EAMG）小鼠的治療作用在于可顯著降低白細胞介素2（IL-2）的表達水平，從而增加EAMG小鼠體質量，減輕癥狀。邵錦根等[19]應用復方參芪合劑干預EAMG大鼠，研究指出復方參芪合劑能改善EAMG病情，其機制可能為下調干擾素-7（IFN-7）、白細胞介素4（IL-4）的比例，上調白細胞介素10（IL-10）的比例而使T細胞分化趨于平衡。張新欣等[20]發(fā)現(xiàn)小劑量的青蒿琥酯明顯降低腫瘤壞死因子TNF-α細胞的數(shù)量，抑制TNF-α的分泌表達，延遲免疫應答的同時增強免疫耐受，已達到治療疾病的作用。王洪峰等[21]研究發(fā)現(xiàn)“溫陽補氣”針法治療EAMG機制在于降低EAMG大鼠血清IL-12和IL-18的表達水平。鄒瑩等[22]根據(jù)裘昌林教授的經驗對馬錢子膠囊治療MG作用開展大鼠實驗研究，其可能通過調節(jié)EAMG大鼠血清中TGF-β水平改變機體免疫抑制和激活的穩(wěn)態(tài)，改善EAMG大鼠的免疫功能。鄧鍇等[23]運用況時祥教授提出的補脾強力復方治療EAMG大鼠發(fā)現(xiàn)補脾強力復方能有效降低EAMG大鼠IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-17水平，升高TGF-β水平，從而糾正EAMG大鼠Th1/Th2/Th17細胞因子失衡。

5 改善骨骼肌、線粒體、神經肌肉接頭處超微結構的研究

劉友章[24]根據(jù)因地制宜、“南藥治南病”的指導思想，總結出健脾祛濕方，實驗研究表明該方不僅可使電鏡下觀察到的EAMG大鼠肌肉肌纖維稀疏、紊亂、線粒體減少的超微結構得以改善，同時健脾祛濕方還可改善EAMG大鼠神經肌肉接頭處的皺折局部紊亂、溶解、消失，突觸前膜囊泡減少等狀態(tài)。胡芳玉[25]，雷孝文[26]依據(jù)團隊“脾-線粒體”相關學說開展實驗研究，發(fā)現(xiàn)健脾益氣法治療EAMG模型大鼠后，其骨骼肌、線粒體及神經肌肉接頭處超微結構均得到明顯改善，并且可明顯調節(jié)線粒體相關通路蛋白過氧化物酶增殖激活受體γ-輔助激活因子-1α（PGC-1α）、細胞核呼吸因子1（NRF1）及線粒體轉錄因子A（Tfam）的mRNA表達，以此改善EAMG癥狀。

6 小結與展望

中醫(yī)藥治療EAMG機制的研究，最多的是從調節(jié)促炎或抑炎細胞因子分泌的角度出發(fā)，包括可降低促炎因子 IL-2、IL-4、IL-17、IFN-γ、TNF-α 等的表達水平，升高抑炎因子TGF-β、IL-10的分泌。而這些促炎或抑炎細胞因子都是由T細胞不同亞群分泌的，故有研究從調節(jié)Thl/Th2/Thl7/Treg細胞免疫平衡方向探究中醫(yī)藥的作用機制。重癥肌無力是由T細胞介導和B細胞依賴，細胞和體液免疫均參與的自身免疫性疾病[27]，自身抗體應答主要由CD4+T細胞分泌的細胞因子調節(jié)B細胞產生抗體。CD4+T細胞可分化不同T輔助（Th）細胞亞群，包括Th1，Th2，Th17，T濾泡輔助（Tfh）細胞和調節(jié)性T（Treg）細胞，這些均已被證明參與MG和EAMG的發(fā)病[28]。在不同的Th細胞亞型中，Th1細胞分泌IFN-γ、IL-2、TNF-α、TNF-β，促進細胞介導的免疫應答，Th2細胞主要產生IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10，激活和維持體液免疫應答。Th17細胞產生IL-17、IL-18、IL-21、IL-22，在自身免疫性疾病的開始和發(fā)展中起關鍵作用[29]，Treg細胞通過抑制自體活性細胞的激活和增殖來調節(jié)Th和B細胞的免疫反應，因此對免疫平衡至關重要[30]。這四種Th細胞亞群的失衡被認為是導致MG和EAMG發(fā)病基本原因，而調節(jié)這些Th細胞亞群的分化及其分泌的細胞因子是治療這種自身免疫性疾病的一個中藥切入點，所以大部分中醫(yī)藥治療EAMG動物模型的機制研究大多集中探討調節(jié)細胞因子分泌，糾正Th1/Th2/Th17/ Treg之間的免疫失衡。

B細胞有雙向調節(jié)作用，一些細胞因子如TGF-β、IL-10由B細胞分泌而來，TGF-β能抑制Th1、Th2細胞亞群分泌細胞因子，IL-10可抑制CD4+T細胞向下分化，進而調節(jié)自身免疫反應。CD19 是一種主要表達于B淋巴細胞膜上的跨膜蛋白，有助于B細胞抗原受體識別特異性抗原并激活B淋巴細胞，在已知研究中CD19+B細胞亞群可促進MG的發(fā)生發(fā)展[31]。現(xiàn)有的大部分中醫(yī)藥干預EAMG模型動物的研究大都局限在CD4+T淋巴細胞亞群分化平衡及細胞因子分泌抑制和促進上，僅有1項研究[15]在探討中醫(yī)藥干預B淋巴細胞分化改善EAMG。MG是由自身抗原特異性B細胞產生的自身抗體引起的[32]。B細胞可呈遞抗原，并分泌免疫調節(jié)細胞因子，從而在抗原特異性T細胞反應的調節(jié)中發(fā)揮重要作用，表現(xiàn)出深刻的免疫抑制能力[33]。B細胞和漿細胞還可以通過產生細胞因子，如IL-10、TGF-β或IL-35來抑制自身免疫性炎癥[34]。誘導免疫抑制B細胞的分化可能是未來治療MG的一個方向。

中醫(yī)治療重癥肌無力一直遵循“治痿獨取陽明”原則，脾弱則肉虛，脾是后天養(yǎng)護之根本，故現(xiàn)代醫(yī)家皆從補脾，益脾，健脾為基本進行立法處方。依據(jù)“脾胃為氣血生化之源”生理特點，有研究者從改善肌肉超微結構角度上闡述其治療EAMG的作用機制，現(xiàn)代生物學上線粒體是能量代謝的始動環(huán)節(jié)，故從增加線粒體產生上研究中醫(yī)藥治療EAMG的作用機制。“線粒體—脾”相關學說更貼近于中醫(yī)基本理論源流，很好的將分子生物學機制與中醫(yī)基礎理論結合在一起闡述MG的發(fā)生發(fā)展及治療靶向。

綜上，大多中醫(yī)藥治療實驗性自身免疫性重癥肌無力機制研究皆從調整免疫細胞分化平衡上立足，尤以改善Th1/Th2/Th17/Treg之間平衡最多，或在B細胞活化機制上，控制B細胞激活和增殖分化上進行機制研究。如何將中醫(yī)特色理論充分地結合到分子生物學上闡述研究機制，將是我們中醫(yī)學者思考和研究的方向。