蔣亞君，陳世鈺，鑫 婷，郭曉宇，王召陽，劉雪婷，崔 帥，王 洋，朱鴻飛，賈 紅

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；2.華南農(nóng)業(yè)大學，廣州 510630)

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的急性、熱性動物傳染病，是目前對家豬影響最大的疾病之一，具有高度傳染性和致死性。1921年，Montgomery將其鑒定為不同于經(jīng)典豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)的一種病毒[1]，在肯尼亞短暫流行后傳入南非和安哥拉，在撒哈拉以南非洲國家、馬達加斯加、撒丁島形成大流行[2]，自2007年以來，東歐國家及部分亞洲國家報道了大量ASF疫情[3]，2018年8月中國首次報道，隨后蒙古國、越南、日本、菲律賓、韓國、南非等均報道了相關(guān)疫情[4-5]。由于病毒本身復(fù)雜、基因多樣性、與宿主互作機制不明等原因[6]，目前仍缺乏特異性治療方法和有效的商業(yè)疫苗，主要通過早期檢測、嚴格的生物安全措施、撲殺感染動物等方法進行防控,對全球養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。

ASFV是具有囊膜的雙鏈DNA病毒，是非洲豬瘟病毒科、非洲豬瘟病毒屬的成員[7]。根據(jù)毒株不同，病毒基因組長度為170～194 kb，可編碼眾多蛋白[8]。 ASFV Georgia 2007/1株多基因家族(MGF)360家族有15個成員，分布于基因組的兩端，攜帶MGF多個拷貝的ASFV毒株基因組更大，毒力更強[9]。在穩(wěn)定的細胞系中培養(yǎng)，基因組左側(cè)的MGF360及其他病毒基因部分缺失，可導(dǎo)致毒力下降[10]。其中，12L基因位于基因組左側(cè)末端的重復(fù)區(qū)域，可通過阻斷importinα和NF-κB的信號通路，抑制IFN-Ⅰ的產(chǎn)生，可能是ASFV逃避宿主先天免疫的新策略[11]，但其免疫調(diào)控機制仍需進一步研究?；诖耍狙芯繑M構(gòu)建12L基因的原核表達系統(tǒng)，優(yōu)化其誘導(dǎo)表達溫度，純化獲得重組蛋白，并制備鼠源多克隆抗體，以期為后續(xù)該蛋白的進一步生物學功能研究、血清學診斷方法的建立提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

pET-28a(+)載體、pEGFP-N1載體、HEK 293T細胞均由北京畜牧獸醫(yī)研究所獸醫(yī)公共衛(wèi)生安全與管理創(chuàng)新團隊保存；BamHⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶均購自TaKaRa公司；T4 DNA連接酶購自NEB公司；2×RapidTaqMax Master Mix、大腸桿菌BL21(DE3)和DH5α感受態(tài)細胞均購自南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司；DNA Marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準(26616)購自Thermo公司；辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG、Alexa Flour 594-Conjugated Goat anti-Mouse IgG(H+L)均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑均購自Sigma公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、Western blotting發(fā)光液均購自天根生化科技(北京)有限公司；考馬斯亮藍購自BBI公司；Ni Bestarose FF、DEAE Bestarose FF、BXK26/100層析柱、BXK16/20層析柱均購自博格隆公司；Omega質(zhì)粒提取試劑盒、Omega膠回收試劑盒均購自寶林可(北京)生物科技有限公司；碳酸纖維素膜(NC膜)購自寶生物工程(大連)有限公司；SDS-PAGE預(yù)制膠及其緩沖液均購自南京金斯瑞生物科技股份有限公司。6周齡雌性BALB/c小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.2 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank ASFV參考序列(登錄號：NC_044959.2)合成MGF 360-12L基因，合成基因全長1 053 bp；根據(jù)參考序列用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，并在上、下游引物中分別加入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點及其保護性堿基，引物序列為：上游引物ASFV-12L-F：5′-CGCGGATCCATGTT-GCCTTCCCTGCAA-3′；下游引物ASFV-12L-R：5′-CCGCTCGAGTCATCTTAAATCATAGG-3′，下劃線處分別為BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點，目的基因及引物均送由生工生物工程(上海)股份有限公司進行合成。

1.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以合成的pCMV-3×Flag-12L為模板，利用設(shè)計的引物擴增目的片段。PCR擴增體系50 μL:2×RapidTaqMaster Mix 25 μL，引物ASFV-12L F/R各2 μL，陽性質(zhì)粒模板 1 μL，ddH2O 20 μL；PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸8 min。將 pET-28a(+)載體和pEGFP-N1質(zhì)粒分別雙酶切，回收的目的基因DNA片段分別與線性化的pET-28a(+)質(zhì)粒、pEGFP-N1質(zhì)粒過夜連接，將連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)和DH5α感受態(tài)細胞，涂布于LB固體平板(含卡那霉素50 μg/mL)，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取單克隆接種于LB液體培養(yǎng)基(含卡那霉素50 μg/mL)，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)，并由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測序，將測序結(jié)果正確的重組菌命名為pET-28a-12L/BL21和pEGFP-N1-12L/DH5α，提取的重組質(zhì)粒進行雙酶切鑒定。

1.4 12L重組蛋白的誘導(dǎo)表達及可溶性分析

將重組菌pET-28a-12L/BL21培養(yǎng)至D600 nm值為0.6～0.8時，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG；分別于37和16 ℃進行誘導(dǎo)表達，每2 h取樣一次，收集菌體，煮沸裂解，10% SDS-PAGE分析不同溫度下重組菌的表達情況，取表達量較高的樣品組，超聲破碎，4 ℃、10 000×g離心10 min，收集上清及沉淀，SDS-PAGE對表達產(chǎn)物進行可溶性分析。

1.5 12L重組蛋白的純化

根據(jù)1.4操作方法對重組菌pET-28a-12L/BL21進行誘導(dǎo)表達，37 ℃ 6 h后以8 000 ×g離心10 min收集菌體，超聲破碎后離心收集沉淀，包涵體經(jīng)變性、復(fù)性過程[12]，復(fù)性蛋白經(jīng)Ni柱親和層析進行純化；采用梯度洗脫方式，先用平衡緩沖液(20 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl+300 mmol/L NaCl+30 mmol/L咪唑)平衡柱子；再用洗滌緩沖液(20 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl+500 mmol/L NaCl+60 mmol/L 咪唑)洗脫雜蛋白；最后用洗脫緩沖液(20 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl+300 mmol/L 咪唑)洗脫目的蛋白,將純化后的蛋白命名為12L重組蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒進行定量，SDS-PAGE鑒定其純度。

1.6 鼠抗12L重組蛋白多克隆抗體制備及12L重組蛋白鑒定

取50 μg 12L重組蛋白與等量弗氏完全佐劑混勻、乳化，采用腹部多點皮下注射方式免疫6～8周齡雌性BALB/c小鼠，對照組注射等體積的PBS，在首次免疫后2、4周時，將蛋白與等量弗氏不完全佐劑混勻乳化后加強免疫，三免后1周采血，收集血清。

取純化的12L重組蛋白進行Wertern blotting鑒定，10% SDS-PAGE后轉(zhuǎn)膜(NC膜)，經(jīng)5%脫脂乳37 ℃封閉1 h后，加入稀釋的小鼠血清(1∶1 000稀釋)為一抗，辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠IgG(1∶5 000稀釋)為二抗，鑒定蛋白反應(yīng)原性。

1.7 12L重組蛋白多克隆抗體效價檢測

采用方陣滴定法將純化的12L重組蛋白倍比稀釋后包被酶標板，4 ℃過夜孵育；PBST洗板(5 min/次，3次)后加入5%脫脂乳(PBS配制)于37 ℃封閉2 h；PBST再次洗滌3次，加入倍比稀釋的免疫后小鼠血清為一抗，37 ℃ 孵育1 h，PBST洗滌3次；以加入辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠IgG(1∶5 000稀釋)為二抗，37 ℃孵育1 h，PBST洗滌后，加入TMB顯色 20 min，用2 mmol/L HCl終止反應(yīng)后讀取D450 nm值。根據(jù)方陣結(jié)果篩選最佳包被濃度和反應(yīng)條件，建立12L重組蛋白抗體間接ELISA方法，采用該方法測定免疫小鼠多克隆抗體的效價。

1.8 12L重組蛋白多克隆抗體的間接免疫熒光試驗(IFA)鑒定

將HEK 293T細胞鋪于24孔板，待細胞長至匯合度為70%～80%時，將pEGFP-N1-12L、pEGFP-N1分別轉(zhuǎn)染至HEK 293T細胞(1 μg/mL質(zhì)粒DNA)，48 h后于熒光顯微鏡中觀察。棄去上清，用PBS洗滌3次后，用預(yù)冷的無水乙醇固定30 min，PBS洗滌3次，加入0.1% Triton X-100 室溫靜置10 min，PBS清洗3次，1% BSA溶液封閉，以12L重組蛋白免疫的小鼠血清和PBS免疫的小鼠血清(1∶100稀釋)為一抗，Alexa Flour 594-Conjugated Goat anti-Mouse IgG(H+L)(1∶50稀釋)為二抗，37 ℃避光孵育 1 h；PBS洗滌5次后于熒光顯微鏡下觀察熒光。

2 結(jié) 果

2.1 12L基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

以合成的質(zhì)粒為模板，擴增到約1 053 bp的目的片段(圖1)，經(jīng)膠回收、酶切、連接、轉(zhuǎn)化后，構(gòu)建重組質(zhì)粒，構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET-28a-12L和重組質(zhì)粒pEGFP-N1-12L進行BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，結(jié)果顯示，獲得大小分別約為5 000 bp的載體條帶和1 053 bp的目的條帶(圖2A、2B)。陽性質(zhì)粒測序顯示，與ASFV參考株Georgia 2007/1的12L基因100%同源，表明重組質(zhì)粒pET-28a-12L和pEGFP-N1-12L構(gòu)建正確。

2.2 12L重組蛋白的誘導(dǎo)表達及可溶性分析

測序正確的重組菌pET-28a-12L/BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE鑒定，結(jié)果顯示，37 ℃誘導(dǎo) 6 h后表達量較高，表達產(chǎn)物在54.7 ku處出現(xiàn)目標條帶(圖3)，與預(yù)期大小相符，表明重組蛋白誘導(dǎo)表達成功。

①A，16 ℃誘導(dǎo)重組蛋白的表達；B，37 ℃誘導(dǎo)重組蛋白的表達。②M，Thermo26616預(yù)染Marker；1，pET-28a/BL21；2，未誘導(dǎo)的pET-28a-12L/BL21；3～10，分別為誘導(dǎo)2、4、6、8、10、12、14和16 h樣品①A,Expression of recombinant protein at 16 ℃;B,Expression of recombinant protein at 37 ℃.②M,Thermo26616 pre-dyed Marker;1,pET-28a/BL21 empty vector;2,pET-28a-12L/BL21 without induction;3-10,Samples collected at 2,4,6,8,10,12,14 and 16 h after induction,respectively圖3 不同溫度條件下12L重組蛋白誘導(dǎo)表達情況Fig.3 Expression of recombinant protein 12L at different temperature conditions

2.3 12L重組蛋白的純化及鑒定結(jié)果

將誘導(dǎo)后的pET-28a-12L/BL21破碎上清及沉淀分別進行SDS-PAGE，對表達產(chǎn)物進行可溶性分析。結(jié)果顯示，該蛋白在沉淀中出現(xiàn)，顯示其為包涵體表達(圖4A)。將表達的包涵體變性、復(fù)性后再進行Ni柱親和層析純化和SDS-PAGE鑒定，由圖4B可知，在54.7 ku處出現(xiàn)目標條帶，且較單一，表明12L重組蛋白純化效果較好，純度較高。BCA測定12L重組蛋白濃度為1.71 mg/mL。 Western blotting檢測顯示，在54.7 ku處出現(xiàn)目標條帶(圖5),表明12L重組蛋白反應(yīng)原性較好。

1,pET-28a-12L/BL21 37 ℃誘導(dǎo)6 h；2，pET-28a-12L/BL21 37 ℃誘導(dǎo)6 h破碎后沉淀；3，pET-28a-12L/BL21 37 ℃誘導(dǎo)6 h破碎后上清；M，Thermo26616預(yù)染Marker；4，純化的12L重組蛋白1,Lysate of pET-28a-12L/BL21 after induced at 37 ℃ for 6 h;2,Supernatant of induced pET-28a-12L/BL21 at 37 ℃ for 6 h;3,Precipitation of induced pET-28a-12L/BL21 at 37 ℃ for 6 h;M,Thermo26616 pre-dyed Marker;4,Purified recombinant protein 12L圖4 12L重組蛋白的表達(A)及純化鑒定(B)Fig.4 Expression (A) and purification identification (B) of recombinant protein 12L

圖5 12L重組蛋白Western blotting鑒定Fig.5 Detection of recombinant protein 12L by Western blotting

2.4 重組蛋白多克隆抗體效價檢測結(jié)果

利用建立的間接ELISA方法對制備的12L重組蛋白的鼠源多克隆抗體進行效價測定，通過方陣測定法，將純化的12L重組蛋白倍比稀釋后包被酶標板，結(jié)果顯示，12L重組蛋白的最佳包被濃度為2.5 μg/mL，制備的多克隆抗體稀釋度為1∶512 000時，其陽性血清和陰性血清仍具有顯著差異，陽性血清D450 nm值大于陰性血清D450 nm值2倍以上(圖6)，表明其效價較高。

圖6 12L重組蛋白鼠源多克隆抗體的ELISA效價測定Fig.6 ELISA titer determination of mouse polyclonal antibody against recombinant protein 12L

2.5 重組蛋白的IFA檢測結(jié)果

采用IFA檢測12L重組蛋白鼠源多克隆抗體的反應(yīng)性，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染48 h后pEGFP-N1-12L和pEGFP-N1轉(zhuǎn)染后的HEK 293T細胞中均可觀察到綠色熒光(圖7A、7B)，表明12L瞬時表達成功。將轉(zhuǎn)染細胞用無水乙醇固定后經(jīng)IFA檢測，結(jié)果顯示，12L重組蛋白免疫小鼠血清可特異性識別HEK 293T細胞中表達的12L蛋白，出現(xiàn)特異性紅色熒光，而以未免疫小鼠血清為一抗的對照細胞無熒光(圖7C、7D)，表明所制備的鼠抗ASFV 12L多克隆抗體與真核表達的12L重組蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，特異性較強。

圖7 融合蛋白瞬時表達及IFA鑒定結(jié)果(100×)Fig.7 Transient expression and IFA analysis of fusion protein (100×)

3 討 論

ASFV高度穩(wěn)定，可通過感染豬、污染的豬肉產(chǎn)品和飼料等多種途徑傳播[13]，具有急性、熱性、高度傳染性的特點，對家豬的致死率可達100%[14]，對全球養(yǎng)豬業(yè)和國民經(jīng)濟造成嚴重威脅。滅活苗不能提供保護，傳代培養(yǎng)的弱毒疫苗安全性不夠，因此，目前疫苗研究主要集中于開發(fā)靶向基因缺失或亞單位改良活病毒上[15]。其中，MGF家族是基因缺失疫苗中常用的靶點之一，研究顯示，在Benin 97/1和Georgia株中敲除MGF家族基因可提供同源保護[16-19]，但關(guān)于多基因家族和其他已知基因無序列相似性,關(guān)于其基因功能研究較少[17]。 ASFV 12L全長蛋白可顯著抑制IRF9和IFN-β刺激介導(dǎo)的ISRE啟動子活化，從而抑制IFN-β介導(dǎo)的免疫應(yīng)答和抗病毒作用[20]，可能是ASFV免疫逃逸策略之一。

目前大腸桿菌表達系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于各類病原微生物蛋白的表達，是研究最為成熟的表達系統(tǒng)，易獲得大量的高純度蛋白及特異性高的抗體,該方法操作簡單、高效。目前ASFV多種蛋白如CP204[21]、p30[22]、B438L[23]和EP153R[24]等均構(gòu)建了原核表達系統(tǒng)。原核表達蛋白可用于血清學檢測方法的建立，隨著ASF疫情發(fā)展，抗體檢測具有顯著優(yōu)勢，可檢出核酸檢測中漏掉的樣本，為疫情提供更全面的監(jiān)測[25]。目前ASFV原核表達蛋白如p72、EP364R和pA104R等[26-28]均已建立ELISA檢測方法。但關(guān)于ASFV 12L蛋白相關(guān)系統(tǒng)報道較少，因此,本研究選擇在原核表達系統(tǒng)中誘導(dǎo)表達12L蛋白，并制備其鼠源多克隆抗體，以期為之后血清學診斷方法開發(fā)及360-12L基因功能研究提供生物材料。

本研究合成ASFV Georgia 2007/1株的360-12L基因，將其連接至pET-28a(+)和pEGFP-N1 2個載體，成功構(gòu)建了12L基因的原核表達系統(tǒng)和真核表達系統(tǒng)，對比其他文獻顯示，這類高分子質(zhì)量和低水溶性蛋白在原核表達過程中易聚集生成包涵體[29]。有研究人員將ASFV K205R和B602L蛋白與類彈性蛋白多肽(ELP)融合表達獲得了可溶性表達，通過相變循環(huán)純化，簡單高效，且后期可切除ELP標簽，避免了與帶標簽的亞單位疫苗檢測的交叉反應(yīng)[30-31]，值得參考?？赡苡捎诘鞍妆磉_量較高，缺少充足的時間進行蛋白折疊，在本試驗中獲得的蛋白也為包涵體蛋白，本試驗通過降低誘導(dǎo)溫度仍未獲得可溶性表達產(chǎn)物，后期可嘗試其他載體和標簽方式構(gòu)建表達系統(tǒng)。此次經(jīng)變性復(fù)性后獲得的12L重組蛋白，經(jīng)試驗證明具有良好的免疫原性，純度較高，反應(yīng)原性較好，表明純化的重組蛋白具有一定的生物活性和應(yīng)用潛力。同時，本試驗所制備的鼠源多克隆抗體效價>1∶512 000，且具有較高的特異性，可用于后續(xù)試驗。本研究構(gòu)建的真核表達系統(tǒng)有助于進一步研究12L基因在病毒中的功能，可通過免疫共沉淀、酵母雙雜交等試驗篩選互作蛋白，進行蛋白生物學功能研究及病毒相關(guān)免疫保護性研究，進一步研究病毒復(fù)雜的致病機制。

4 結(jié) 論

本試驗利用原核表達系統(tǒng)成功表達12L重組蛋白，篩選其最佳誘導(dǎo)溫度并分析其在大腸桿菌中的表達情況，并制備了鼠抗ASFV 12L蛋白多克隆抗體，為進一步研究12L蛋白結(jié)構(gòu)、生物學功能、ASFV疫苗研制及診斷方法開發(fā)提供生物材料。