莫紅芳，揭 凱，陳 鑫，文 威，劉文強，陳煥春，錢 平，李祥敏

(1.華中農(nóng)業(yè)大學,農(nóng)業(yè)微生物學國家重點實驗室，武漢 430070；2.廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術大學，南寧 530007)

豬塞尼卡谷病毒(SenecaValleyvirus，SVV)是小RNA病毒科(Picornaviridae)塞尼卡病毒屬(Senecavirus)的唯一成員[1]，基因組序列大小約為7.2 kb，包含1個開放閱讀框(ORF)，編碼含2 181個氨基酸的多聚蛋白[2-3]，編碼1個先導蛋白質L和3個前體蛋白(P1、P2和P3)[4]。P1前體蛋白編碼結構蛋白VP0、VP1和VP3，VP0成熟后裂解成VP2和VP4，構成病毒衣殼；P2和P3前體蛋白編碼7個非結構蛋白(2A～2C和3A～3D)，與病毒毒力密切相關，共同參與病毒復制[4]。SVV衣殼與宿主細胞膜受體相結合，已作為其參與天然免疫的依據(jù)[5]。 目前，關于SVV疫苗和免疫診斷研究的報道相對較少，但由于SVV與口蹄疫病毒(FMDV)屬于同科病毒，基因和蛋白質結構比相似，因此，SVV疫苗類型和免疫診斷產(chǎn)品與FMDV相似[6]。

自2007年有國家發(fā)現(xiàn)豬群感染SVV后，美國、巴西、加拿大等國家也陸續(xù)報道了該病[7]。2015年以來，中國廣東、湖北、廣西、安徽、河南、遼寧等地區(qū)陸續(xù)出現(xiàn)了豬感染SVV的報道[8]。至此，SVV在中國豬群中明確存在且有蔓延趨勢[6]，應引起國內(nèi)養(yǎng)豬行業(yè)的高度關注[9]。由于豬塞尼卡谷病毒病具有與口蹄疫(FMD)、豬水皰性疹(VES)、豬水皰病(SVD)和水皰性口炎(VS)等嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)的疫病相似的臨床癥狀[4]，因此需借助實驗室手段進行確診。當前，用于SVV診斷的實驗室方法主要為病毒分離、免疫熒光抗體檢測、病毒中和試驗(VNT)、免疫組化(IHC)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、反轉錄PCR、新型RNA原位雜交技術等,其中ELISA方法用于常規(guī)篩查，其余方法用于進一步確診[9]。

作為豬的新發(fā)傳染病，目前尚無有效的SVV商品化疫苗和診斷試劑，使得豬塞尼卡谷病毒病的防控面臨巨大的挑戰(zhàn)[10]。近年來，SVV單克隆抗體被廣泛應用于免疫組化及競爭ELISA檢測[11]。SVV結構蛋白VP1～VP4較保守，其中VP1和VP2是主要的抗原表位區(qū)域[12]，VP1包含多個中和結構域、相對保守，是衣殼蛋白中免疫原性最強的，已被用于確定多種小RNA病毒的血清型，能與宿主細胞結合產(chǎn)生特異性免疫應答[13-15]，為SVV診斷提供了重要保障[16]。本研究擬在SVV-CH-HB2016病毒顆?；A上制備其結構蛋白的單克隆抗體，以期為血清學檢測方法的建立提供生物學材料，也為SVV抗體診斷試劑盒、疫苗的研發(fā)及結構蛋白的功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株、質粒、細胞及試驗動物 SVV-CH-HB2016、SVV CH/GXI09/2016、SVV AH01-2017毒株、真核質粒pTRIP-3Flag-SVV-CH-HB2016-VP1/VP2/VP3、倉鼠腎細胞(BHK-21)、小鼠骨髓瘤細胞(SP2/0)、人源腎上皮細胞(293T)均由華中農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)微生物學國家重點實驗室保存提供。6周齡SPF級雌性BALB/c小鼠購自華中農(nóng)業(yè)大學實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑 SVV-CH-HB2016 VP1兔源多克隆抗體由華中農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)微生物學國家重點實驗室制備；FITC羊抗小鼠IgG購自ABclonal公司；羊抗兔IgG-HRP酶標二抗、羊抗小鼠IgG-HRP酶標二抗均購自武漢安特捷生物技術有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購自HyClone公司；Sucrose、50% PEG4000、HAT/HT培養(yǎng)基干粉、Hisopaque-1083淋巴細胞分離液、弗氏完全佐劑及弗氏不完全佐劑均購自Sigma公司；ELISA顯色液及終止液均購自武漢科前生物股份有限公司；SuperSignal Chemiluminescent Substrates顯色液、Pierce?Rapid ELISA Mouse mAb Isotying Kit均購自Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 SVV純化與鑒定 參照彭成成等[17]方法制備、濃縮與純化病毒，參照楊文靜等[18]Western blotting方法鑒定病毒特異性。將SVV-CH-HB2016毒株接種BHK-21細胞進行增殖，室溫反復凍融3次后，于4 ℃、10 000 r/min離心30 min以除去細胞碎片，超高速離心和蔗糖密度梯度離心方法濃縮、純化SVV全病毒顆粒，脫糖處理后通過12% SDS-PAGE檢測純化后目的蛋白純度。依次以SVV-CH-HB2016 VP1兔源多克隆抗體、羊抗兔IgG-HRP酶標二抗孵育后，Western blotting方法鑒定病毒顆粒特異性，再利用實時熒光定量PCR檢測病毒拷貝數(shù)，最終以純度好、拷貝數(shù)高的病毒顆粒免疫BALB/c小鼠。

1.2.2 動物免疫 參照周曼莉等[19]方法進行小鼠免疫。將30 μg純化的SVV-CH-HB2016病毒顆粒與等體積弗氏完全佐劑乳化，用頸背部皮下兩點注射法對6周齡SPF級雌性BALB/c小鼠進行首次免疫。分別于2和4周后更換為弗氏不完全佐劑以同樣劑量和方法進行第2、3次免疫。三免10 d后進行斷尾采血，檢測血清抗體效價及其特異性，以判斷是否需進行第4次免疫。細胞融合前3～5 d進行加強免疫，即腹腔注射與前幾次免疫等劑量的病毒顆粒。

1.2.3 間接ELISA檢測方法的建立 參照趙月龍等[20]方法，通過方陣滴定法確定抗原的最佳包被濃度及血清最佳稀釋倍數(shù)。

1.2.4 免疫小鼠血清效價檢測 采用間接ELISA方法檢測免疫血清效價。按抗原最佳包被濃度包被純化的SVV-CH-HB2016病毒顆粒，4 ℃孵育過夜。將分離得到的待檢陽性及空白小鼠陰性血清從1∶200倍開始稀釋，依次2倍倍比稀釋至1∶25 600作為一抗，用1.2.3建立的間接ELISA方法檢測免疫小鼠的血清效價。當待檢血清與陰性血清的D630 nm比值(P/N)≥2.1，且待檢血清的D630 nm值≥0.4時的最大稀釋倍數(shù)為該免疫小鼠的血清效價。

1.2.5 細胞融合及亞克隆 參照項自來等[21]方法進行細胞融合及篩選。取800 μL 50% PEG4000誘導免疫脾細胞(1×108)與SP2/0骨髓瘤細胞(1×107～2×107)進行物理性融合。融合后用含2% HAT、20% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸，并與飼養(yǎng)細胞混合培養(yǎng)，第5天更換為2% HT培養(yǎng)基，培養(yǎng)至11 d采用間接ELISA結合間接免疫熒光試驗(IFA)方法篩選陽性雜交瘤細胞。將陽性雜交瘤細胞利用有限稀釋法進行3次亞克隆，直至細胞培養(yǎng)上清陽性率100%，將細胞擴大培養(yǎng)并凍存。

1.2.6 單克隆抗體Western blotting檢測 參照林偉東等[22]方法,利用Western blotting檢測單克隆抗體與SVV結構蛋白的反應性。以真核質粒pTRIP-3Flag-SVV-CH-HB2016-VP1/VP2/VP3表達的3種重組結構蛋白作為抗原，置于5%脫脂牛奶中室溫封閉2 h，陽性雜交瘤細胞上清為一抗室溫孵育1 h，再用羊抗小鼠IgG-HRP酶標二抗(1∶5 000稀釋)室溫孵育1 h，加入SuperSignal Chemiluminescent Substrates顯色液(1∶1)在Bio-Rad照膜儀上進行避光顯色讀取反應結果。

1.2.7 抗體亞型鑒定 采用Pierce Rapid ELISA Mouse mAb Isotyping Kit進行單克隆抗體的亞型鑒定，具體操作方法按照試劑盒說明書進行。

1.2.8 雜交瘤細胞染色體計數(shù) 將建立細胞株后的陽性雜交瘤細胞接種至24孔細胞板，細胞生長至對數(shù)期時在培養(yǎng)基中添加終濃度為0.6 μg/mL的秋水仙素，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱連續(xù)培養(yǎng)3 h。輕輕吹下雜交瘤細胞，1 000 r/min離心10 min收集細胞沉淀，加入37 ℃預熱的0.075 mol/L KCl低滲溶液1 mL，重懸細胞沉淀，于37 ℃恒溫箱靜置30 min。 加入新配制的固定液(甲醇∶冰醋酸=1∶3)處理細胞，吸取50 μL細胞懸液滴至4 ℃預冷的載玻片上，使液面均勻展開，并于室溫下自然干燥，取10% Giemsa染色液染色10～15 min，ddH2O沖洗染色液后自然晾干。光學顯微鏡下初步觀察確定染色體位置，轉換油鏡頭再觀察染色體的形態(tài)和數(shù)目。

1.2.9 單克隆抗體的IFA鑒定 待BHK-21細胞長至匯合度為80%～90%時，以感染復數(shù)(multiplicity of infection,MOI)為0.1的劑量接種SVV-CH-HB2016病毒液，設置不接種病毒的細胞對照組，于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 h。加入固定液(甲醇∶丙酮=1∶1)100 μL/孔，于-20 ℃固定30 min；每孔加入含2% BSA的PBS緩沖液100 μL，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱封閉1 h；加入陽性雜交瘤細胞上清作一抗，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱與抗原結合1 h；避光加入Cy3 Goat Anti-Mouse IgG二抗(1∶2 000稀釋) 100 μL/孔，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱反應1 h，在倒置熒光顯微鏡下進行觀察和拍照。

1.2.10 單克隆抗體的病毒中和試驗 為觀察制備的單克隆抗體對SVV的中和效應，取雜交瘤細胞培養(yǎng)上清50 μL依次作2倍倍比稀釋至1∶28，分別接入SVV-CH-HB2016、SVV CH/GXI09/2016和SVV AH01-2017毒株，接種劑量為200 TCID50/100 μL，孵育1 h后感染BHK-21細胞。每株雜交瘤細胞作4排重復孔，設立病毒和細胞對照孔，24 h后觀察細胞病變情況并記錄結果。

1.2.11 病毒吸附試驗 為探究中和單克隆抗體是否通過影響SVV-CH-HB2016毒株吸附過程來抑制病毒增殖，通過實時熒光定量PCR和空斑試驗檢測其在293T細胞的吸附情況。首先測定具有中和作用的單克隆抗體培養(yǎng)基上清的IgG濃度，取IgG含量為2 mg的上清與2×106TCID50的SVV-CH-HB2016毒株于37 ℃感作1 h，加入4×106個293T細胞于4 ℃轉盤上反應1 h，4 ℃低速離心棄掉上清，用預冷的PBS洗滌4次，分別加入100 μL無血清DMEM反復凍融，收集病毒進行空斑檢測，加入1 mL Trizol裂解細胞進行實時熒光定量PCR檢測，設立IgG對照組。

1.2.12 抗體相加試驗 參照裴超[23]方法進行抗體相加試驗。采用間接ELISA法進行相加試驗，計算相加指數(shù)(AI)來分析抗原表位。分別用純化的VP1、VP2和VP3蛋白包被酶標板，然后每孔加入各種單克隆抗體培養(yǎng)上清各100 μL，以及兩兩組合各50 μL，37 ℃孵育1 h，以羊抗小鼠IgG-HRP作為二抗進行ELISA檢測，用酶標儀讀取D630 nm值，記錄并根據(jù)下列公式計算AI。

AI=(A1+2-A1)/A2

式中，A1、A2分別為各株單克隆抗體單獨反應后的A值；A1+2為兩兩組合的混合單克隆抗體反應后的A值；AI>10%表示兩株單克隆抗體細胞株針對不同的抗原表位，具有相加效應；AI<10%則表示兩株單克隆抗體細胞株針對的抗原表位相同或相近。

1.2.13 小鼠腹水制備與純化 采用小鼠體內(nèi)誘生腹水法來進行單克隆抗體的大量制備。選取8～10周齡的雌性BALB/c小鼠20只，通過腹腔注射0.5 mL弗氏不完全佐劑的方式進行刺激，5～7 d后收集擴大培養(yǎng)的陽性雜交瘤細胞(105～106個)注射到小鼠腹腔內(nèi)，7～10 d后待小鼠腹腔變得極度腫脹，用注射器無菌抽取腹水，經(jīng)1 000 r/min離心10 min分離的上清即為單克隆抗體腹水，再利用辛酸-硫酸銨沉淀方法純化腹水及SDS-PAGE方法檢測純化效果。 將純化好的單克隆抗體置于10 mmol/L Tris-HCl (pH 9.0)緩沖液中透析72 h，透析結束后與甘油按1∶1比例混合，于-20 ℃保存。

1.2.14 小鼠腹水效價的測定 采用間接ELISA方法檢測抗體效價。用濃度為1 μg/mL的SVV-CH-HB2016病毒顆粒包被酶標板，將小鼠腹水從1∶200倍開始2倍倍比稀釋至1∶25 600作為一抗，設立SP2/0培養(yǎng)上清對照組。以羊抗小鼠IgG-HRP作為二抗，以630 nm處吸光度的P/N值>2時的腹水最大稀釋倍數(shù)為其抗體效價。

1.2.15 統(tǒng)計分析 病毒吸附試驗各組樣本的差異均采用雙樣本等方差t檢驗進行處理，使用生物軟件GraphPad Prism進行顯著性分析，P>0.05表示差異不顯著，P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 SVV純化與鑒定

將SVV-CH-HB2016毒株接種BHK-21細胞，利用蔗糖密度梯度超速離心法進行病毒的濃縮與純化，結果顯示在蔗糖梯度20%～35%(W/V)、35%～45%(W/V)和45%～60%(W/V)之間均有一條明顯的病毒帶(圖1)。SDS-PAGE檢測結果顯示，蔗糖梯度35%～45%之間有3條明顯的條帶，大小分別為39、37和34 ku，與SVV-CH-HB2016毒株的結構蛋白VP2、VP1和VP3大小一致(圖2)。以SVV-CH-HB2016 VP1兔源多克隆抗體為一抗進行Western blotting鑒定，結果顯示有一條大小為37 ku的特異性條帶(圖3)，與VP1蛋白大小一致。經(jīng)實時熒光定量PCR檢測，蔗糖梯度35%～45%之間病毒含量為1.7×1012拷貝/mL，測定蛋白濃度達400 μg/mL，以此作為抗原免疫BALB/c小鼠。

圖1 SVV-CH-HB2016蔗糖密度梯度離心Fig.1 Sucrose density gradient centrifugation of SVV-CH-HB2016

M，蛋白質分子質量標準；1，濃縮前；2，濃縮上層；3，濃縮下層；4，超高速離心最上層；5～7，蔗糖密度梯度分別為20%～35%、35%～45%和45%～60%M,Protein Marker；1,Before concentration；2,Concentrated upper layer；3,Concentrated lower layer；4,Super-detached top layer；5-7,Sucrose density gradient were 20%-35%,35%-45% and 45%-60%,respectively圖2 SVV-CH-HB2016蔗糖密度梯度離心SDS-PAGE檢測Fig.2 SDS-PAGE detection of sucrose density gradient centrifuged of SVV-CH-HB2016

1，BHK-21細胞；2，濃縮前；3，濃縮上層；4，濃縮下層；5，超高速離心最上層；6～8，蔗糖密度梯度分別為20%～35%、35%～45%和45%～60%；M，蛋白質分子質量標準1,BHK-21 cells；2,Before concentration；3,Concentrated upper layer；4,Concentrated lower layer；5,Super-detached uppermost layer；6-8,Sucrose density gradient were 20%-35%,35%-45% and 45%-60%,respectively；M,Protein Marker圖3 SVV-CH-HB2016蔗糖密度梯度離心Western blotting鑒定Fig.3 Western blotting detection of sucrose density gradient centrifuged of SVV-CH-HB2016

2.2 免疫小鼠血清效價檢測

3次免疫完成后，對小鼠進行斷尾采血，通過間接ELISA方法檢測血清抗體效價水平。結果顯示，SVV-CH-HB2016病毒顆粒免疫的3只小鼠血清抗體效價均達到了1∶12 800，其中2號小鼠免疫效果最佳(圖4)，故首先選擇其進行細胞融合試驗。

A，1號小鼠血清；B，2號小鼠血清；C，3號小鼠血清；D，陰性血清A,Serum of No.1 mouse；B,Serum of No.2 mouse；C,Serum of No.3 mouse；D,Negative serum圖4 間接ELISA檢測免疫小鼠血清效價Fig.4 Detection of serum titer of immunized mice by indirect ELISA

2.3 陽性雜交瘤細胞篩選結果

用純化的SVV-CH-HB2016病毒顆粒作為包被原，通過方陣滴定法確定抗原最佳包被濃度為1 μg/mL，以此濃度包被酶標板，利用間接ELISA結合IFA方法篩選陽性雜交瘤細胞，采用有限稀釋法進行3次亞克隆直至陽性率達到100%，最終篩選出17株能穩(wěn)定分泌特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞株，分別命名為1A3、1A5、1C2、1E7、1F5、1C12、2A5、2B9、2E1、2G6、3D1、3E2、3F2、4A3、4B8、4C11和4F11。

2.4 單克隆抗體的Western blotting分析

Western blotting檢測結果顯示，14株雜交瘤細胞分泌的抗體分別能與SVV 3種重組結構蛋白發(fā)生特異性作用，其中1C2、1E7、1F5、2E1、2G6和4C11株單克隆抗體能與VP1蛋白特異性結合，1A3、1C12、3E2、3F2、4B8和4F11株單克隆抗體能與VP2蛋白特異性作用，1A5和2A5株單克隆抗體能與VP3蛋白特異性反應。Western blotting部分結果見圖5。

①A～I，分別以1A5、1C12、1E7、1F5、2A5、2G6、3E2、4C11和4F11株單克隆抗體為一抗。②M，蛋白質分子質量標準；1～3，分別為重組蛋白VP1、VP2和VP3①A-I,Monoclonal antibody of 1A5,1C12,1E7,1F5,2A5,2G6,3E2,4C11,4F11 strain as first antibody,respectively.②M,Protein Marker；1-3,Recombinant protein VP1,VP2 and VP3,respectively圖5 單克隆抗體Western blotting分析Fig.5 Western blotting analysis of monoclonal antibodies

2.5 單克隆抗體亞型鑒定

SVV-CH-HB2016單克隆抗體細胞株亞型鑒定結果顯示,1A3、1C2、1E7、1C12、2A5、2E1、2G6、3D1、4A3、4B8、4C11和4F11株單克隆抗體亞型均為IgG/Kappa，1A5、1F5、2B9、3E2和3F2株單克隆抗體亞型均為IgM/Kappa。

2.6 雜交瘤細胞染色體計數(shù)

染色體計數(shù)結果顯示，17株雜交瘤細胞染色體數(shù)目均在90～110對之間，表明這17株雜交瘤細胞的染色體數(shù)目約為脾細胞與SP2/0細胞染色體數(shù)目之和，是融合成功的細胞株。

2.7 單克隆抗體的IFA鑒定

IFA結果顯示，17株單克隆抗體均能與SVV不同毒株發(fā)生反應，具有較強的熒光信號，而陰性對照則無任何熒光信號，表明該17株雜交瘤細胞均是特異性針對SVV的單克隆抗體。IFA部分結果見圖6。

A～K，分別以1C2、1E7、1F5、1C12、2A5、2G6、3D1、4A3、4B8、4C11和4F11株單克隆抗體為一抗；L，BHK-21細胞對照A-K，Monoclonal antibody of 1C2,1E7,1F5,1C12,2A5,2G6,3D1,4A3,4B8,4C11,4F11 strain as first antibody respectively；L，BHK-21 cell control圖6 單克隆抗體IFA鑒定(20×)Fig.6 IFA identification of monoclonal antibodies (20×)

2.8 單克隆抗體的病毒中和試驗結果

中和試驗48 h后，觀察病毒對照組BHK-21細胞出現(xiàn)明顯變圓、皺縮及脫落等病變，試驗組中SVV CH/GXI09/2016、SVV AH01-2017毒株感染的單克隆抗體處理組的細胞均呈現(xiàn)典型細胞病變現(xiàn)象，而僅有SVV-CH-HB2016感染的單克隆抗體處理組細胞無病變或僅少數(shù)孔出現(xiàn)病變。結果表明，2G6、4C11、4A3 3株單克隆抗體對SVV-CH-HB2016毒株感染的細胞具有明顯中和保護效果，而對SVV CH/GXI09/2016和SVV AH01-2017毒株無保護效果(表1)。

表1 單克隆抗體對不同SVV毒株的中和效價測定

2.9 病毒吸附試驗結果

實時熒光定量PCR試驗結果顯示，2G6、4C11、4A3 3株具有中和作用的單克隆抗體可極顯著抑制SVV-CH-HB2016毒株吸附293T細胞的過程(P<0.01)，其中2G6單克隆抗體株的抑制吸附效果最好(圖7)。

①A，IgG對照；B～D，分別為2G6、4C11和4A3株單克隆抗體。 ②與對照組相比，**,差異極顯著(P<0.01)。 圖8同A,IgG as control；B-D,Monoclonal antibody of 2G6,4C11 and 4A3 strains,respectively.②Compared with control group,**,Extremely significant difference (P<0.01).The same as fig.8圖7 實時熒光定量PCR檢測SVV-CH-HB2016毒株的吸附效果Fig.7 Adsorption effect of SVV-CH-HB2016 strain detected by Real-time PCR

空斑試驗結果顯示，2G6、4C11和4A3 3株中和性單克隆抗體可極顯著抑制SVV-CH-HB2016毒株對293T細胞的吸附(P<0.01),其中2G6單克隆抗體株的抑制吸附效果最好(圖8)。

圖8 空斑試驗檢測SVV-CH-HB2016毒株的吸附效果Fig.8 Adsorption effect of SVV-CH-HB2016 strain detected by plaque assay

采用以上2種研究方法檢測2G6、4C11和4A3 3株中和性單克隆抗體對SVV-CH-HB2016毒株吸附293T細胞過程的抑制效果，均表明3株中和性單克隆抗體可極顯著抑制SVV-CH-HB2016毒株對細胞的吸附，其中2G6單克隆抗體株的抑制吸附效果最好。

2.10 抗體相加試驗結果

抗體相加試驗結果表明，除1F5與2E1、4B8與4F11的AI值<10%外，其余10株單克隆抗體的AI值均>10%，說明1A3、1A5、1C2、1E7、1C12、2A5、2B9、2G6、3D1、3E2、3F2、4A3和4C11 10株單克隆抗體分別針對不同的抗原表位(表2～4)。

表2 抗VP1蛋白單克隆抗體的抗體相加指數(shù)

表3 抗VP2蛋白單克隆抗體的抗體相加指數(shù)

表4 抗VP3蛋白單克隆抗體的抗體相加指數(shù)

2.11 單克隆抗體腹水制備與純化

利用SDS-PAGE方法檢測純化的單克隆抗體腹水，可見兩條大小分別為55和25 ku的明顯條帶，無任何雜帶，說明純化的單克隆抗體回收率較高、純度較好。

2.12 小鼠腹水效價測定

用間接ELISA方法檢測小鼠腹水效價，結果顯示，17株雜交瘤細胞制備的小鼠腹水抗體效價均達到了較高水平，其中2E1、3D1和4C11株腹水效價達到了1∶6 553 600。

3 討 論

SVV是一種新出現(xiàn)的動物病原，近年來發(fā)現(xiàn)其感染與豬的特發(fā)性水皰病(porcine idiopathic vesicular disease,PIVD)和流行性暫時性新生仔豬死亡(epidemic transient neonatal losses,ETNL)相關[12]。SVV主要感染豬，不同性別、年齡階段的豬均易感，但在不同的病例中表現(xiàn)的臨床癥狀有所差異[24]。感染的繁殖母豬和公豬鼻吻、冠狀帶及蹄部可觀察到病變，成年豬通常呈亞臨床感染，1～4日齡新生仔豬病死率可達30%～70%[25]。作為一種新發(fā)的家畜傳染病，豬塞內(nèi)卡病毒病的暴發(fā)與流行已給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了較大的經(jīng)濟損失[26]。隨著SVV在中國的傳播，亞臨床感染在國內(nèi)養(yǎng)豬場也頻繁發(fā)生[27]。大量亞臨床感染和商用疫苗的缺乏增加了中國對該病防控和凈化的難度[28]。

SVV感染的診斷主要依靠病原學和血清學方法[20]，目前國內(nèi)外尚無檢測該病的商品化試劑盒,常用病毒分離鑒定、RT-PCR方法進行檢測[29]，ELISA方法具有操作簡便、敏感性高、適于大規(guī)模樣品檢測的優(yōu)點，是實驗室常用的檢測方法[20]。鑒于該病在中國目前的流行態(tài)勢，迫切需要開發(fā)出SVV的快速診斷方法，單克隆抗體以其良好的特異性、準確性和敏感性在疾病診斷方面具有良好的效果[30]。SVV VP1結構蛋白有重要的抗原性，病毒衣殼底部和前部之間最明顯的差異位于VP1結構蛋白[4]，開發(fā)出基于VP1結構蛋白的單克隆抗體，在SVV診斷方面具有重要意義[30]。

單克隆抗體在生物學領域較多，開發(fā)出相應的單克隆抗體意義重大[30]，目前國內(nèi)極少有SVV單克隆抗體的相關報道，更無中和性單克隆抗體的研究成果。趙月龍[20，30]利用pET-32a(+)表達系統(tǒng)表達A型塞尼卡谷病毒(SVA) VP1(rVP1)，純化上清中rVP1蛋白作為包被抗原，初步建立了SVA間接ELISA抗體檢測方法，同時利用其作為免疫原制備了抗rVP1蛋白的單克隆抗體。陳露露[31]將截短的VP3片段序列插入pCold Ⅱ原核表達載體，制備能穩(wěn)定分泌針對SVA VP3蛋白的單克隆抗體雜交瘤細胞株，并進行了其抗原表位的精確鑒定。本研究制備的17株單克隆抗體穩(wěn)定性好、純度高、特異性強，經(jīng)過IFA驗證能在病變的細胞中定位病毒粒子，Western blotting檢測該單克隆抗體與SVV結構蛋白具有良好的反應性，其中14株單克隆抗體可同時識別構象表位與線性表位，3株單克隆抗體只能識別構象表位。值得一提的是，本研究在國內(nèi)首次成功篩選出3株具有中和作用的SVV單克隆抗體，經(jīng)Western blotting鑒定2G6、4C11株單克隆抗體均只與結構蛋白VP1發(fā)生特異性結合，以此驗證了VP1基因上確實存在中和結構域。這為下一步重組亞單位疫苗的研發(fā)奠定了基礎，也為基于單克隆抗體的雙抗夾心ELISA方法的建立、膠體金試紙條的開發(fā)提供了條件。

本研究第一次細胞融合發(fā)現(xiàn)原本陽性的細胞孔經(jīng)亞克隆后轉陰，可能是由于雜交瘤細胞狀態(tài)不佳，分裂過程中導致染色體丟失，進而引起抗體分泌停止，此外非分泌抗體細胞和抗體細胞之間的競爭也可能會致使陽性亞克隆丟失[30]。篩選出的5株單克隆抗體為IgM，這可能與抗原對機體的免疫調(diào)節(jié)有關，抗原量增加引起免疫耐受，進而易誘導產(chǎn)生IgM抗體[30]。本研究測定了17株單克隆抗體與SVV 3種不同毒株的中和效價，篩選得到的3株中和性單克隆抗體除了對免疫小鼠用的SVV-CH-HB2016毒株有較好的中和效果外，對其余2種毒株的中和效價均為1∶1，說明中和性單克隆抗體與SVV其他2種毒株的反應性非常弱，不具有中和保護作用，造成中和性單克隆抗體在以后應用性研究方面有較大局限性。病毒中和試驗中，由于病毒吸附細胞發(fā)生于進入細胞之前，病毒進入效率可能受吸附效率影響。 因此，根據(jù)試驗結果初步得出以下結論：中和單克隆抗體可有效抑制SVV-CH-HB2016毒株對293T細胞的吸附過程，而其對病毒進入的影響則不清楚。陳露露[31]報道了中和抗體在防止小RNA病毒感染中起關鍵作用，目前中國SVA毒株在抗原性上與其他毒株密切相關,并具有共同的中和表位。盡管存在共同的表位，但衣殼蛋白(VP1、VP2和VP3)中的氨基酸變化導致不同SVA毒株的抗原性存在差異，所以有必要在流行病學調(diào)查中監(jiān)測抗原性的變化[31]。

4 結 論

本研究成功純化了SVV-CH-HB2016毒株的病毒顆粒，免疫小鼠后制備了17株特異性針對SVV-CH-HB2016毒株結構蛋白的單克隆抗體細胞株，驗證了17株單克隆抗體均能與SVV-CH-HB2016毒株發(fā)生IFA作用及其中14株單克隆抗體能與SVV-CH-HB2016毒株重組結構蛋白發(fā)生Western blotting反應，并成功篩選出了3株對SVV-CH-HB2016毒株感染具有中和保護效果的單克隆抗體，為SVV ELISA方法的建立、膠體金試紙條的開發(fā)及病毒感染機制的研究提供了物質材料與理論依據(jù)。