常 華，段 綱，阮 謙，羅倩敏，余琬玲，劉清琦，黃翠琴，項 勛

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，昆明 650201；2.龍巖學(xué)院福建省家畜傳染病防治與生物技術(shù)重點實驗室，龍巖 364012)

紅嘴鷗是分布于歐亞大陸和北美洲東部沿海的一種候鳥，每年冬天大量的紅嘴鷗從北方西伯利亞地區(qū)遷徙到中國南方越冬，其越冬地分布廣泛。從1985年秋季至今30余年在昆明翠湖從未間斷，且種群數(shù)量呈增加趨勢。野生鳥類的遷徙與多種流行性疾病存在密切聯(lián)系，受到獸醫(yī)公共衛(wèi)生的關(guān)注，對于野生鳥類機體的免疫機制研究尤為關(guān)鍵。對紅嘴鷗行為模式研究發(fā)現(xiàn)，在整個越冬期間其以補充、積累能量為主；日間存在明顯的“上午覓食+中午休息+下午覓食”的行為模式，一天中最主要的行為是覓食。 而且它們熟悉昆明翠湖及周邊環(huán)境，在沒有人為傷害的情況下，對游客十分親近[1]。這些行為均極大地增加紅嘴鷗所攜帶病原體的傳播風(fēng)險。2014年檢測發(fā)現(xiàn)，紅嘴鷗在遷徙過程中感染禽流感[2]；2020年檢測發(fā)現(xiàn)紅嘴鷗可持續(xù)攜帶單增李斯特菌[3]。

天然免疫系統(tǒng)是機體防御病原體入侵的首道防線，機體中Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)是能調(diào)控機體免疫的重要模式識別受體，在機體抗病原體感染中發(fā)揮重要的作用，該家族成員有TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6、TLR11、TLR3、TLR7、TLR8和TLR9[4]。當(dāng)機體感染病毒后，TLR7可識別病毒的單鏈RNA，激活Ⅰ型干擾素IFN表達來啟動不同的信號傳導(dǎo)途徑發(fā)揮抗病毒感染[5-6]。人感染流感病毒后TLR7/8介導(dǎo)的IFN-α蛋白分泌水平有明顯的上調(diào)作用[7]，豬肺泡巨噬細胞感染豬繁殖與呼吸綜合征病毒后，TLR7顯著誘導(dǎo)β-干擾素(IFN-β)和γ-干擾素(IFN-γ)[8]。相較于人和其他哺乳動物TLR7而言，禽類TLR7研究主要集中在鴨、鵝、雞、鴿，鴨感染新城疫強毒后TLR7在骨髓和法氏囊內(nèi)表達上調(diào)[9]；鵝感染低致病性禽流感H9N2后TLR7在肺組織中相對表達量顯著升高[10]；在腎型傳染性支氣管炎病毒(NIBV)誘導(dǎo)的雞痛風(fēng)中，NIBV激活TLR4和TLR7信號通路并引起mRNA表達量的變化，促進機體炎癥發(fā)生，引起腎臟損傷[11]。鴿感染新城疫病毒后TLR7與髓樣分化因子MyD88基因結(jié)合后激活干擾素調(diào)節(jié)因子信號通路，促進α-干擾素(IFN-α)和白細胞介素6(IL-6)、白細胞介素12(IL-12)等炎性因子的產(chǎn)生，從而介導(dǎo)免疫應(yīng)答[12]。相較于家禽TLR7基因功能研究，野生禽類紅嘴鷗TLR7基因鮮見報道。 本研究用cDNA末端快速擴增技術(shù)(rapid amplification of cDNA ends，RACE)擴增紅嘴鷗TLR7基因序列，并對其進行生物信息學(xué)分析，以期為后期深入研究TLR7蛋白抗病毒作用機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

Tks GflexTMDNA Polymerase(R060A)PCR試劑盒、DL2000 DNA Marker(3427A)、pMD19-T Vector(6013)、RNAiso Plus(9109)RNA提取試劑盒、PrimeScriptTMⅣ 1st Strand cDNA Synthesis Mix(6215A)反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SMARTer RACE 5′/3′Kit(634858)、大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；膠回收試劑盒(DP209)、小量質(zhì)粒提取試劑盒(DP103)、SYBR Premix ExTaqTM(FP205)熒光定量試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司。

全自動凝膠成像系統(tǒng)(5000Proll)購自廣州博鷺騰生物科技有限公司；臺式離心機(Microfuge 20)和PCR儀(SimpliAmp Thermo Scientific)購自伯樂公司。

1.2 方法

1.2.1 紅嘴鷗外周血淋巴細胞RNA提取 2019年10月在云南昆明翠湖采集3只紅嘴鷗血樣后分離淋巴細胞，在無菌EP管內(nèi)加入3 mL外周血和3 mL分離液，1 500 r/min離心20 min；吸取云霧狀層至無菌EP管并加入1 mL洗液，經(jīng)離心留沉淀，用2 mL RPMI 1640培養(yǎng)基吹打混勻，放在6孔板中培養(yǎng)，將培養(yǎng)8、12、24 h的淋巴細胞用細胞刮刮下，用RNAiso Plus提取RNA，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。

1.2.2 引物設(shè)計及合成 根據(jù)GenBank中雞(登錄號：FJ915562.1)、鴨(登錄號：MK986726.1)TLR7基因序列設(shè)計第1對引物F1和R1擴增紅嘴鷗TLR7基因的部分片段；根據(jù)TLR7基因部分片段的測序序列設(shè)計第2對引物的上游引物F2，與RACE試劑盒中3′-RACE引物(作為下游引物R2)擴增TLR7基因的3′-RACE片段；根據(jù)3′-RACE片段的測序序列和鴨(登錄號：MK986726.1)TLR7基因序列設(shè)計第3對引物(F3/R3)，擴增TLR7基因的全序列,引物序列見表1。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物信息

1.2.3TLR7基因的克隆與測序 用 PrimeScriptTMⅣ 1st Strand cDNA Synthesis Mix 將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用引物F1/R1擴增TLR7基因部分片段；用引物F2/R2擴增TLR7基因3′-RACE片段；用引物F3/R3擴增TLR7全基因。PCR擴增體系25 μL：上、下游引物各1 μL，MgCl21.5 μL，dNTPs 2 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，TaqDNA聚合酶0.25 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O補至25 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃變性50 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min，共25個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，經(jīng)過TA克隆至pMD19-T載體，連接體系為Solution Ⅰ 4 μL、pMD19-T載體1 μL，目的片段5 μL，放入16 ℃恒溫箱過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，并在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)16 h。挑取單克隆后，將其置于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，挑取陽性菌落進行擴大培養(yǎng)，通過菌液PCR驗證后，將陽性菌落送至寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司進行測序。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 用DNAStar軟件中的MegAlign程序分析GenBank中原雞(登錄號：FJ915562.1)、紅腹角雉(登錄號：MK697329.1)、鵪鶉(登錄號：MK697327.1)、綠頭鴨(登錄號：XM_013108249.4)、黑天鵝(登錄號：XM_035542207.1)、山雀(登錄號：XM_033512663.1)、白鷺(登錄號：XM_009646337.2)、帝企鵝(登錄號：XM_009278529.2)、紅喉潛鳥(登錄號：XM_009813692.1)、巴布亞企鵝(登錄號：MN313017.1)與紅嘴鷗TLR7基因序列的相似性，并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹；采用ProtParam程序分析TLR7蛋白理化性質(zhì)；分別采用NetNGlyc1.0和NetPhos3.1程序預(yù)測蛋白糖基化位點和磷酸化位點；分別采用ProtScale、SignalP v3.0和TMHMM Server 2.0程序分析蛋白的親/疏水性、信號肽切割位點和跨膜區(qū)；用在線軟件RARE CODON CALTOR(http:∥people.mbi.ucla.edu/sumchan/caltor.html)預(yù)測蛋白的稀有密碼子；采用PSORTⅡ Prediction在線軟件(https:∥psort.hgc.jp/form2.html)進行亞細胞定位;利用SOPMA程序(https:∥npsa-prabi.ibcp.fr/)預(yù)測蛋白二級結(jié)構(gòu)；利用SWISS-MODEL在線軟件(https:∥swissmodel.expasy.org/)預(yù)測蛋白三級結(jié)構(gòu)。

2 結(jié) 果

2.1 TLR7全基因克隆及序列分析

利用F1/R1引物進行PCR擴增，結(jié)果表明，PCR產(chǎn)物大小約300 bp(圖1A)，測序后比對，與預(yù)期相符，該片段為TLR7基因的部分片段。3′-RACE PCR擴增條帶大小約700 bp(圖1B)，測序結(jié)果顯示成功獲得3′-RACE序列。F3/R3引物PCR擴增條帶為1 720 bp (圖1C)，與預(yù)期一致。PCR產(chǎn)物回收后與pMD19-T載體連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化挑菌鑒定發(fā)現(xiàn)，試驗成功克隆了紅嘴鷗TLR7基因。測序結(jié)果表明，紅嘴鷗TLR7基因全序列長度為1 720 bp。紅嘴鷗TLR7基因存在39個稀有密碼子，包括9個AGG、4個CGA、4個CGG、4個GGA、4個CUA、4個CCC、3個AGA、3個AUA、2個GGG、2個ACG，且含有8個連續(xù)的稀有密碼子CCCCGA、CGACUA、GGGAGG、AGGCUA。序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫，獲得GenBank登錄號為：MZ668652。

A，TLR7基因部分片段PCR擴增;B，TLR7基因的3′-RACE序列擴增;C，TLR7基因全序列PCR擴增A，PCR amplification of partial sequence of TLR7 gene；B，PCR amplification of TLR7 gene by 3′-RACE；C，PCR amplification of full sequence of TLR7 gene圖1 紅嘴鷗TLR7基因PCR擴增Fig.1 PCR amplification of TLR7 gene in Larus ridibundus

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1TLR7基因相似性比對及系統(tǒng)進化樹構(gòu)建 紅嘴鷗TLR7基因序列與GenBank中已公布的原雞、紅腹角雉、鵪鶉、綠頭鴨、黑天鵝、山雀、白鷺、帝企鵝、紅喉潛鳥和巴布亞企鵝的TLR7基因相似性分別為85.7%、84.9%、85.4%、87.0%、87.8%、86.8%、91.0%、93.1%、93.1%和93.1%(圖2)，其中與帝企鵝、紅喉潛鳥和巴布亞企鵝TLR7基因相似性都較高。利用DNAStar軟件分析并繪制進化樹，發(fā)現(xiàn)紅嘴鷗與鳥綱鷺科白鷺進化關(guān)系較近，與家禽(原雞、鵪鶉、綠頭鴨)的親緣關(guān)系較遠(圖3)。

圖2 不同物種間TLR7基因核苷酸序列相似性比對Fig.2 Similarity alignment of nucleotide sequences of TLR7 gene in different species

圖3 TLR7基因系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of TLR7 gene

2.2.2TLR7基因編碼蛋白的基本理化性質(zhì) 測序獲得的TLR7基因全序列長度為1 720 bp，編碼區(qū)長度為1 182 bp，共編碼393個氨基酸，TLR7蛋白分子質(zhì)量約為63 ku。 分子式 C2080H3256N556O567S19，原子總數(shù)為6 478。蛋白質(zhì)理論等電點為9.25。氨基酸組成中Leu含量(15.0%)最高，其次是Asn(7.4%)和Thr(6.4%)，His(2.0%)、Met(2.0%)和Trp(2.5%)含量均較少(表2)。

表2 紅嘴鷗TLR7氨基酸組成

2.2.3 TLR7蛋白跨膜區(qū)和信號肽位點預(yù)測 TLR7蛋白多肽鏈的預(yù)測值為0，推測TLR7蛋白沒有跨膜區(qū)(圖4)。SignalP V3.0程序分析結(jié)果顯示，TLR7蛋白沒有信號肽切割位點(圖5)。

圖4 紅嘴鷗TLR7蛋白跨膜區(qū)預(yù)測Fig.4 Transmembrane prediction of TLR7 protein in Larus ridibundus

圖5 紅嘴鷗TLR7蛋白信號肽切割位點預(yù)測Fig.5 Signal peptide cleavage site prediction of TLR7 protein in Larus ridibundus

2.2.4 TLR7蛋白N-糖基化位點和磷酸化位點預(yù)測 預(yù)測結(jié)果顯示，TLR7蛋白含有6個N-糖基化位點，分別位于第13、25、64、143、286、380位氨基酸處(圖6)。TLR7蛋白含有33個磷酸化位點，其中16個絲氨酸磷酸化位點分別位于12、33、63、109、110、168、182、190、192、229、288、294、308、342、354、355位氨基酸處；4個酪氨酸磷酸化位點分別位于95、305、316、344位氨基酸處；13個蘇氨酸磷酸化位點分別位于27、57、83、145、176、193、201、203、254、297、302、314、382位氨基酸處(圖7)。

圖6 紅嘴鷗TLR7蛋白N-糖基化位點預(yù)測Fig.6 N-glycosylation site prediction of TLR7 protein in Larus ridibundus

圖7 紅嘴鷗TLR7蛋白磷酸化位點預(yù)測Fig.7 Phosphorylation site prediction of TLR7 protein in Larus ridibundus

2.2.5 TLR7蛋白親疏水性分析 TLR7蛋白含有9個疏水區(qū)域，其最小值為-2.367，最大值為3.044。 疏水區(qū)主要集中在5-7、119-120、135-141、149-160、170-173、185-208、236-238、297-303和329-337位氨基酸處；親水區(qū)位于14-18、28-41、74-88、163-168、224-248、243-248、259-278、306-318、340-352、361-368和383-389位氨基酸處，該多肽鏈中親水區(qū)域多于疏水區(qū)域，說明該蛋白為親水性蛋白(圖8)。

圖8 紅嘴鷗TLR7蛋白親/疏水性預(yù)測Fig.8 Hydrophilicity and hydrophobicity prediction of TLR7 protein in Larus ridibundus

2.2.6TLR7蛋白亞細胞定位 蛋白亞細胞定位預(yù)測結(jié)果表明，紅嘴鷗TLR7蛋白主要存在于細胞質(zhì)(39.1%)、線粒體(17.4%)和細胞核(17.4%)中。

2.2.7 二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 利用SOPMA程序預(yù)測紅嘴鷗TLR7蛋白的二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該蛋白中α-螺旋、無規(guī)則卷曲、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角分別占48.09%、32.06%、13.23%、6.62%(圖9)；使用SWISS-MODEL在線軟件預(yù)測紅嘴鷗TLR7蛋白的三級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，紅嘴鷗TLR7蛋白主要以α-螺旋為主，與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果一致，且與模型蛋白人TLR7蛋白相似性為68.78%(圖10)。

①h,α-螺旋;e,延伸鏈;t,β-轉(zhuǎn)角;c,無規(guī)則卷曲.②線條按照從長到短的依次代表α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲①h,Alpha helix;e,Extended chain;t,Beta turn;c,Random coil.② The lines represent alpha helix,extended chain,beta turn and random coil,by the length,respectively圖9 紅嘴鷗TLR7蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.9 Secondary structure predicition of TLR7 protein in Larus ridibundus

圖10 紅嘴鷗TLR7蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.10 Tertiary structure prediction of TLR7 protein in Larus ridibundus

3 討 論

紅嘴鷗在遷徙過程中會攜帶大量病原，其中不乏會有能導(dǎo)致人獸共患疾病的病原。為此，深入研究紅嘴鷗自身抗病毒的機制尤為關(guān)鍵。野生鳥類基因序列與已報道的家禽基因雖有相似性，但保守區(qū)片段都非常短，此外紅嘴鷗是野生保護動物，每次采血量不能過多，導(dǎo)致核酸獲得難度加大，試驗設(shè)計引物時，要比對多個物種，尋找相似性非常高的區(qū)域進行擴增。 本試驗設(shè)計同源序列引物，最終獲得紅嘴鷗TLR7基因的全序列，為后續(xù)基因分析奠定基礎(chǔ)。

大多數(shù)畜禽TLR7基因已有報道，且不同動物TLR7基因長度不同，如大鯢[13]TLR7基因全長3 747 bp，ORF為3 150 bp(編碼1 049個氨基酸)；豬[8]TLR7基因全長3 160 bp,ORF為3 153 bp(編碼1 050個氨基酸)；鴿[14]TLR7基因長3 516 bp，ORF為3 175 bp(編碼1 047個氨基酸)；雞[15]TLR7基因長6 747 bp，ORF為3 180 bp(編碼1 059個氨基酸)；鴨[16]TLR7基因全長6 747 bp，ORF為3 270 bp(編碼1 089個氨基酸)。紅嘴鷗TLR7基因序列全長1 720 bp，比雞、鴨TLR7基因片段都小。將紅嘴鷗TLR7基因與GenBank中已公布的10個物種TLR7基因進行相似性分析，雖其與帝企鵝、紅喉潛鳥和巴布亞企鵝TLR7基因相似性都較高(93.1%)，但進化樹發(fā)現(xiàn)紅嘴鷗TLR7基因與鳥綱鷺科白鷺屬白鷺進化關(guān)系較近，與家禽(原雞、鵪鶉、綠頭鴨)的親緣關(guān)系較遠，說明該基因在不同物種間保守性存在差異。

家禽病毒感染機制研究中TLR7基因是非常重要的檢測基因，在體外感染試驗中，感染禽流感病毒[17-18]、禽呼腸孤病毒[19]、禽冠狀病毒[20]、傳染性支氣管炎病毒[21]及傳染性法氏囊病毒[22]后均出現(xiàn)TLR7基因表達水平升高；鵝感染新型病毒性腸炎病毒(NGVEV)后，檢測發(fā)現(xiàn)脾臟中TLR7基因mRNA高水平表達,表明鵝TLR7在抗病毒防御中起重要作用[23]。TLR7基因在鴨先天免疫反應(yīng)中也起重要作用，poly(I:C)誘導(dǎo)刺激鴨胚成纖維細胞，檢測發(fā)現(xiàn)鴨TLR7基因過表達會促進β-干擾素(IFN-β)、干擾素調(diào)節(jié)因子7(IRF7)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子(STAT1、STAT2)的表達[16]。表明TLR7蛋白在病毒感染早期參與免疫反應(yīng)。本研究獲得了紅嘴鷗TLR7基因全長，為后期研究TLR7蛋白的抗病毒活性奠定基礎(chǔ)。

紅嘴鷗TLR7基因存在3個以上相連的稀有密碼子，體外表達量低。在一定程度上蛋白表達量降低會影響蛋白純化效率，所以后期體外表達該蛋白時要考慮選擇利于表達的載體或表達宿主菌[24-25]。紅嘴鷗TLR7蛋白不是跨膜蛋白或分泌蛋白，后期體外表達該蛋白時要優(yōu)化誘導(dǎo)表達的溫度和表達的時間提高其表達量。紅嘴鷗TLR7蛋白主要定位于細胞質(zhì)，與鵝TLR7蛋白亞細胞定位[10]有相似之處。N-糖基化的位點突變可以加強或降低細胞及體液免疫。磷酸化修飾是可逆的，參與細胞信號傳導(dǎo)、神經(jīng)活動等生理病理過程[25]。紅嘴鷗TLR7蛋白存在6個N-糖基化位點和33個磷酸化位點，推測這些修飾可能與該蛋白的生理功能有關(guān)。后期TLR7蛋白功能研究可以借助修飾位點的變化來分析其抗病毒作用。這些蛋白質(zhì)預(yù)測結(jié)果可為后期體外構(gòu)建紅嘴鷗TLR7基因原核表達載體及蛋白的表達優(yōu)化提供重要的科學(xué)數(shù)據(jù)。

4 結(jié) 論

本試驗采用RACE技術(shù)擴增獲得紅嘴鷗TLR7基因全序列，長1 720 bp，ORF大小為1 182 bp，存在39個稀有密碼子，共編碼393個氨基酸，TLR7蛋白分子質(zhì)量約為63 ku。TLR7基因系統(tǒng)進化樹結(jié)果顯示，紅嘴鷗與白鷺的親緣關(guān)系最近。TLR7蛋白沒有跨膜區(qū)和信號肽切割位點，含有6個N-糖基化位點和33個磷酸化位點，是疏水性蛋白，主要存在細胞質(zhì)中。二級結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋為主，三級結(jié)構(gòu)預(yù)測與二級結(jié)構(gòu)一致。這些數(shù)據(jù)為后期探索紅嘴鷗TLR7蛋白參與抗病毒免疫機制的深入研究提供重要依據(jù)。