亓玉卓,梁 琳,韓 坤,梁瑞英,賈亞雄,

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)學(xué)研究所,北京100193；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)北京科學(xué)觀測實驗站，北京100193)

鴿圓環(huán)病毒(Pigeon circovirus,PiCV)是單鏈環(huán)狀無囊膜DNA病毒，屬于圓環(huán)病毒科(Circoviridae)圓環(huán)病毒屬(Circovirus)成員[1]，基因組長度約2 000 bp[2]。PiCV的基因組包含2個主要的開放閱讀框(open reading frame，ORF)[3]，分別編碼復(fù)制酶蛋白(replicatedassociated protein，Rep)和核衣殼蛋白(putative capsid protein，Cap)[4]。編碼Cap蛋白的起始密碼子有ATG/ATA 兩種，不同的起始密碼子可能與編碼蛋白大小及毒株的遺傳進化有關(guān)。自1993年首次被發(fā)現(xiàn)[5]以來，PiCV陸續(xù)在世界各地被報道[6-7]，2009年中國報道了第1例鴿圓環(huán)病毒病[8]，隨后2011—2017年陸續(xù)在福建和東部地區(qū)被報道檢出，并且該病原被懷疑與幼鴿疾病綜合征有關(guān)[9]，目前該病原多在南方的鴿群中被檢出，在報道中缺乏北京地區(qū)的PiCV基因組信息，從而缺少對該病原的診斷和認識。與其他動物圓環(huán)病毒類似，PiCV主要引起機體免疫抑制[10]，影響青年鴿的發(fā)育，被感染鴿常出現(xiàn)消瘦、困倦、精神萎靡、腹瀉等特征，嚴重影響賽鴿的競翔能力。 PiCV與其他病毒、細菌、支原體等病原體混合感染后常加重病情，顯示其他致病原的臨床癥狀，混合感染或繼發(fā)感染的情況下死亡率最高可達100%。PiCV與同屬的雞貧血病毒只感染雞不同，它還可以感染其他鳥類，如金絲雀等。隨著國內(nèi)養(yǎng)鴿數(shù)量的增加，疾病的防控工作尤為重要，作為免疫抑制病原PiCV的檢測應(yīng)該引起重視，由于PiCV還無法培養(yǎng)，無論是鴿養(yǎng)殖者還是研究人員對該病原的認識都較少，關(guān)于PiCV病原學(xué)、流行病學(xué)及防控等多方面亟待研究。

2019年，北京市某鴿場發(fā)現(xiàn)有部分青年鴿發(fā)生精神萎靡、競翔能力差的癥狀，疑似PiCV感染。為了解北京地區(qū)PiCV的遺傳變異情況，掌握本地區(qū)PiCV的流行情況，本研究對該疑似患病鴿進行了檢測，成功獲得了1株P(guān)iCV的全基因組序列，并進行了遺傳進化分析，以期了解毒株的遺傳進化規(guī)律，為該病的防控及疫苗的研制提供思路，也為該病致病機理的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

2×Lamp PCR MasterMix購自南京諾維贊生物科技有限公司；病毒基因組DNA提取試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司；Trans2K DNA Marker、pEASY?Blunt克隆載體及大腸桿菌Trans T1感受態(tài)細胞均購自全式金生物科技有限公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒純化試劑盒均購自O(shè)mega。T100?Thermal Cycler PCR儀購自Bio-Rad公司；Tanon-1600凝膠成像分析系統(tǒng)購自上海天能科技有限公司；PowerPac?電泳儀購自Bio-Rad公司；NanoDrop2000微量核酸測定儀購自賽默飛世爾科技公司。

1.2 樣品處理

自北京市某賽鴿場無菌條件下采集3只10日齡發(fā)病鴿的肝臟和脾臟組織,用生理鹽水沖洗后，用無菌剪刀剪取約1 cm3大小，放入15 mL離心管中，再加入等體積的無菌PBS(pH 7.4)，使用手持電動勻漿機勻漿后，迅速置于液氮中。提取組織基因組DNA/RNA前，在-80 ℃反復(fù)凍融3次。使用病毒基因組DNA提取試劑盒提取病毒基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病料PCR檢測

參考文獻設(shè)計引物檢測禽腺病毒[9](Fowl adenovirus，F(xiàn)AdV)、鴿Ⅰ型皰疹病毒[9](Columbid herpes virus 1，CHV-1)、PiCV[11]、鴿Ⅰ型副黏病毒(PPMV-1)[11]，引物信息見表1。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系25 μL：2×PCR MasterMix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板1 μL,加ddH2O至終體積為25 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，退火(溫度見表1)35 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 引物信息

1.4 PiCV全基因組克隆及測序

參考GenBank中PiCV基因組序列(登錄號：JX901128、AF252610、KX108795)設(shè)計引物，用于擴增病毒基因組，引物信息見表2，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。 PCR反應(yīng)體系25 μL：2×Lamp PCR MasterMix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL、DNA模板1 μL,加ddH2O至終體積為25 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，60 ℃退火35 s，72 ℃延伸100 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用膠回收試劑盒回收純化后與pEASY?-Blunt克隆載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans T1感受態(tài)細胞，隨機選取3個陽性重組質(zhì)粒送GENEWIZ生物科技有限公司測序。

表2 PiCV全基因組克隆引物

將測序結(jié)果與GenBank中登錄的相關(guān)序列通過BLAST進行比對分析，用DNAStar軟件進行序列整理和校對，然后拼接形成病毒全基因組序列。

1.5 遺傳進化分析

將獲得的病毒的全基因組序列及Cap和Rep基因分別與表3中參考序列分別進行相似性比對，利用DNAStar中的MegAlign軟件進行相似性分析，利用Mega 7.0軟件繪制系統(tǒng)進化樹，采用Bootstrap工具對進化樹的可靠性進行評價，重復(fù)1 000次。

表3 參考毒株信息

續(xù)表

2 結(jié) 果

2.1 病料PCR檢測結(jié)果

經(jīng)PCR檢測，3只病鴿中有1只病鴿的肝臟和脾臟中檢測到大小為325 bp目的條帶(圖1)，經(jīng)過測序和BLAST比對，確定為PiCV陽性，并未檢出其他病毒。

1，1號鴿脾臟組織;2，1號鴿肝臟組織；3，陰性對照;M，Trans2K DNA Marker1，Spleen tissue of No.1 Pigeon；2，Liver tissue of No.1 Pigeon；3，Negative control;M，Trans2K DNA Marker圖1 鴿圓環(huán)病毒檢測Fig.1 Detected of the PiCV

2.2 全基因組克隆及序列分析

利用檢測引物對樣品進行PCR擴增，得到大小分別為947、822、1 428和441 bp的產(chǎn)物(圖2)，陽性重組質(zhì)粒測序結(jié)果表明，獲得了1株P(guān)iCV的病毒全基因序列，病毒基因組全長為2 034 bp，包括5個開放閱讀框，有2個主要開放閱讀框，GC含量為55%，命名為PiCV BJ。 序列提交GenBank后，獲得登錄號：MW289588。 PiCV BJ株ORF-V1(48-995 bp)編碼復(fù)制Rep蛋白，ORF-C1(1 981-1 166 bp)編碼Cap蛋白。

M，Trans2K DNA Marker;1～4，依次為引物3、1、2和4的PCR產(chǎn)物M，Trans2K DNA Marker;；1-4，The PCR products of primers 3,1,2 and 4,respectively圖2 病毒全基因組分段擴增產(chǎn)物Fig.2 Segmented amplification product of the virus whole genome

2.3 全基因組序列相似性比對及遺傳進化分析

相似性比對結(jié)果顯示，PiCV BJ與其他PiCV的核苷酸相似性在86.0%～97.0%之間，其中PiCV BJ株與2011年分離自波蘭的PL53的相似性最高，為97.0%；與分離自比利時的的鴿源11-08304株相似性最低，為86.0%(圖3)。遺傳進化樹分析可知，PiCV BJ株與其他禽源圓環(huán)病毒不在同一分支，親緣關(guān)系較遠；與分離自波蘭的鴿源PL124株處于同一分支，親緣關(guān)系較近(圖4)；與國內(nèi)其他省市發(fā)現(xiàn)的毒株遺傳距離相對較遠，表明PiCV BJ株可能是由國外引種傳入中國，并發(fā)生了變異。

圖3 PiCV全基因組核苷酸相似性比對Fig.3 Similarity alignment of genome-wide nucleotide of PiCV

圖4 PiCV遺傳進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of PiCV

2.4 Cap及Rep基因的遺傳進化分析

將PiCV BJ的Cap和Rep基因的核苷酸和氨基酸序列分別與國內(nèi)外毒株進行相似性比對，并構(gòu)建遺傳進化樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PiCV BJ的Cap基因與分離自比利時的11-80304核苷酸和氨基酸的相似性分別高達95.8%和85.2%(圖5A和5B)，Rep基因與分離自波蘭的PL53核苷酸和氨基酸相似性分別高達94.6%和96.2%(圖6A和6B)。通過氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，PiCV BJ與國內(nèi)外其他毒株相比，Cap蛋白主要在第23位(蘇氨酸→丙氨酸)、673位(天冬氨酸→丙氨酸)、674位(脯氨酸→天冬氨酸)、802位(丙氨酸→谷氨酸)發(fā)生了氨基酸的變化。Rep蛋白氨基酸序列除因分離自比利時的11-80304株序列不全，僅有17.9%相似度以外，與其他參考毒株相似性均在93.4%以上，僅有3個位點與其他毒株有明顯的不同，除起始密碼子為ATG編碼甲硫氨酸以外，分別在30位(脯氨酸→絲氨酸)、148位(甘氨酸→精氨酸)、225位(谷氨酰胺→天冬氨酸)發(fā)生變化。遺傳進化樹顯示，PiCV BJ的Cap和Rep基因均與PL53和11-08304在同一分支，親緣關(guān)系較近(圖7)，這與相似性分析的結(jié)果一致，它們的Cap基因起始密碼子均為ATG，與起始密碼子為ATA的7050、9030株的親緣關(guān)系較遠。

圖5 PiCV Cap基因核苷酸(A)和氨基酸(B)序列相似性比對Fig.5 Similarity alignment of nucleotide (A) and amino acid (B) sequences of Cap gene of PiCV

圖6 PiCV Rep基因核苷酸(A)和氨基酸(B)序列相似性比對Fig.6 Similarity alignment of nucleotide (A) and amino acid (B) sequences of Rep gene of PiCV

圖7 PiCV Rep(A)和Cap(B)基因的遺傳進化樹Fig.7 Phylogenetic tree of Cap (A) and Rep (B) genes of PiCV

3 討 論

圓環(huán)病毒是目前已知的最小的動物DNA病毒，基因組大小只有2 kb，主要宿主是動物的淋巴細胞[12]，主要引起動物機體免疫水平下降[13]。由于目前仍沒有適宜PiCV生長的培養(yǎng)條件[14-15]，所以針對圓環(huán)病毒的致病機理及防控措施的研究較為缺乏。本試驗根據(jù)已發(fā)表的檢測方法對疑似PiCV感染的病鴿肝臟和脾臟組織進行了檢測，最終檢測到了PiCV的存在，與Santos等[16]報道一致，肝臟、脾臟這些免疫器官是最易檢出的部位。由于該病毒造成鴿的免疫抑制，故在檢測時應(yīng)多關(guān)注淋巴組織在內(nèi)的免疫器官。隨后參考NCBI已發(fā)表的國內(nèi)外PiCV序列，通過比對設(shè)計引物，利用PCR技術(shù)成功獲得了1株P(guān)iCV的全序列，命名PiCV BJ。將拼接序列與其他參考序列進行比對發(fā)現(xiàn)，PiCV BJ與其他參考序列的相似性在86.0%～97.0%之間，遺傳進化樹顯示該毒株與中國報道的其他PiCV遺傳距離較遠，與國外報道的PiCV序列親緣關(guān)系較近，尤其是與波蘭報道的PL53相似性最高，據(jù)此推測該病毒株來自國外，可能由賽鴿引種傳入中國，提示在外部引種時要做好病毒監(jiān)測[17]，在PiCV致病機制尚不清楚且沒有相應(yīng)疫苗的現(xiàn)在，對防控PiCV大流行來說至關(guān)重要。

PiCV的基因組與其他圓環(huán)病毒相似，2個功能較為清晰的ORF分別為V1和C1[16]，ORF-V1(48-995 bp)編碼復(fù)制Rep蛋白(315個氨基酸)；ORF-C1(1 981-1 166 bp)編碼Cap蛋白(271個氨基酸)。此次得到的PiCV序列編碼5個ORFs，除功能較明確的2個主要的ORFs以外，還存在有2個可能與病毒復(fù)制有關(guān)的的基因間區(qū)，均位于ORF-V1和ORF-C1之間：其中，在1 892-196 bp的位置有一段5′→3′的區(qū)域，與報道的其他PiCV 5′-端間區(qū)長短在90～101 bp[18]之間有較大差異，該區(qū)段有339 bp，存在1個莖環(huán)結(jié)構(gòu)，編碼方向與ORF-C1一致；在293-2 001 bp的位置存在第二段編碼區(qū)，長度327 bp，編碼方向與ORF-C1一致，與ORF-V1相反。除此之外，在ORF-V1和ORF-C1之間各有1個與其編碼方向相反的ORF，其功能暫不明晰。對比其他參考序列的Rep基因可發(fā)現(xiàn)，目前已發(fā)表的PiCV全序列的Rep蛋白起始密碼子均為ATG,而編碼Cap蛋白的起始密碼子有ATA和ATG兩種[19-20]，本試驗中得到的該株P(guān)iCV全序列Cap基因的起始密碼子為ATG。Cap基因的起始密碼子分為2種，分別為ATA與ATG，之前報道中發(fā)現(xiàn)起始密碼子的不同使得在構(gòu)建遺傳進化樹時分為2個明顯的分支[18]，即起始密碼子為ATG的在同一分支，而起始密碼子為ATA的在另一分支，在本研究中沒有發(fā)現(xiàn)因起始密碼子不同在進化樹中有明顯的分群現(xiàn)象，但可以發(fā)現(xiàn)不同起始密碼子的序列在親緣關(guān)系上較遠，目前PiCV只有1種基因型，這提示Cap蛋白起始密碼子的種類可能是PiCV的分群標(biāo)準，但關(guān)于該毒株遺傳進化與Cap蛋白起始密碼子的關(guān)系還有待進一步研究。此外，本試驗中PiCV Cap和Rep蛋白與其他毒株相比均有不同程度的氨基酸變化，由于目前尚沒有對PiCV毒力的界定，故暫不清楚這些位點氨基酸的變化對毒力是否產(chǎn)生影響，以及PiCV在鴿群中的傳播是否與該病毒對鴿易感性有關(guān)系，這些都值得進一步探索。PiCV在世界各地的高檢出率已經(jīng)引起了養(yǎng)鴿行業(yè)的重視[21]，為進一步了解PiCV的遺傳進化規(guī)律，今后需獲取更多的基因組信息來明確PiCV的流行情況及地區(qū)分布規(guī)律。

4 結(jié) 論

本研究在北京地區(qū)的病鴿肝臟和腎臟組織中檢出1株P(guān)iCV(PiCV BJ株)，并克隆獲得了其基因組序列，全長為2 034 bp,共編碼5個ORFs。PiCV BJ株與2011年分離自波蘭的PL53株和分離自比利時的11-08304株親緣關(guān)系較近，這與相似性分析結(jié)果一致，說明該病毒株來自國外，可能由賽鴿引種傳入中國，提示在外部引種時要做好病毒監(jiān)測。