石雅倩, 耿夢(mèng)麗, 李紅娜, 黃思源, 李麗霞, 黃 怡, 鐘一真, 歐葉濤

(1 桂林醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 廣西 桂林 541004; 2 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 河南 新鄉(xiāng) 453003)

三陰乳腺癌是一種雌激素(ER)、 孕激素(PR)以及人表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER-2)表達(dá)均呈陰性的乳腺癌的特殊亞型,具有高侵襲性、 高轉(zhuǎn)移潛能、 易復(fù)發(fā)、 預(yù)后差的特點(diǎn), 一直是乳腺癌臨床治療中的重點(diǎn)和難點(diǎn), 目前仍十分缺乏有效的治療手段和藥物[1]。 天然植物抗腫瘤具有靶點(diǎn)多樣、 毒副作用小的明顯優(yōu)勢(shì)[2]。 星毛冠蓋藤(Pileostegia Tomentella Hand. -Mazz.), 又名腫瘤藤、 消瘤藤[3], 是一味傳統(tǒng)的瑤族常用中草藥, 具有顯著的抗癌作用, 而目前十分缺乏對(duì)其藥理機(jī)制的報(bào)道。 本研究探討星毛冠蓋藤乙酸乙酯提取物(ethyl acetate extract of Pileostegia tomentella, PTE)對(duì)三陰乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響, 以細(xì)胞MDA-MB-231 為研究對(duì)象, 運(yùn)用MTT 方法檢測(cè)并計(jì)算PTE 抑制細(xì)胞增殖的最佳作用時(shí)間和IC50, 選取合適的時(shí)間和劑量處理細(xì)胞后, 臺(tái)盼藍(lán)染色法明確PTE 的殺傷作用, TUNEL 方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況, Western blot 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。 綜合評(píng)價(jià)PTE 的抗三陰乳腺癌效果, 為星毛冠蓋藤的開發(fā)利用提供理論依據(jù), 促進(jìn)民族醫(yī)藥的發(fā)展。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材 料

(1)試驗(yàn)藥物: 星毛冠蓋藤采于廣西金秀地區(qū)(金秀縣羅香鄉(xiāng)白牛村, 北緯23.958411 度, 東經(jīng)110.225487 度, 定位 K 碼8vqs4kdch, 海拔高度547 米), 經(jīng)廣西壯族自治區(qū)中國(guó)科學(xué)院植物研究所黃俞淞研究員鑒定為藥用星毛冠蓋藤全草。

(2)人三陰乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞, 美國(guó) ATCC 細(xì)胞庫(kù); 四氮唑藍(lán)(MTT)、 臺(tái)盼藍(lán)染液, 碧云天生物技術(shù)公司;TUNEL 試劑盒, 江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司; Caspase-3抗體, CST 公司; 環(huán)磷酰胺, MCE 公司; 真空冷凍干燥機(jī), 寧波新芝生物科技股份有限公司; 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀, 德國(guó)IKA 公司;多功能酶標(biāo)儀, TECAN 公司; 正置、 倒置熒光顯微鏡, 德國(guó)徠卡有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 藥物提取

取星毛冠蓋藤的藤莖, 陰干后粉碎, 過(guò)50 目篩, 取藥材粉末300 g, 分別用75%、 85%、 95%、 95%、 95%乙醇各超聲提取一次, 液料比(mL/g)8∶1, 40 kHz, 40 min/次。 0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾, 合并濾液, 濃縮得總提物, 留樣后用水混懸,乙酸乙酯(分析純)萃取, 合并濾液后濃縮得乙酸乙酯部位提取物(PTE), 冷凍干燥機(jī)凍干后, 4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 四氮唑藍(lán)(MTT)比色實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞增殖率檢測(cè): 乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 以3×103/孔接種于96 孔板中, 不同劑量的PTE 處理細(xì)胞, 2.8 mg/mL 的環(huán)磷酰胺處理為陽(yáng)性對(duì)照, 陰性對(duì)照組不加藥, 空白組只加培養(yǎng)液(不種細(xì)胞), 每組6 個(gè)重復(fù)孔。 繼續(xù)培養(yǎng)24 h、 48 h、 72 h后加MTT, 孵育箱內(nèi)避光培養(yǎng)4 h 后, 多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)各組在490 nm 處的吸光度, 計(jì)算細(xì)胞增殖活性。 藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率=1-(實(shí)驗(yàn)-空白)/(陰性-空白)×100%。

1.2.3 臺(tái)盼藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞死亡率檢測(cè): MDA-MB-231 細(xì)胞PTE 處理后48 h 收集細(xì)胞, 調(diào)整至適當(dāng)濃度, 臺(tái)盼藍(lán)染色3 min, 細(xì)胞計(jì)數(shù)板上觀察, 拍照、 計(jì)數(shù)、 計(jì)算細(xì)胞死亡率。 細(xì)胞死亡率=死細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.4 TUNEL 法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 以2×104/孔接種于24 孔板細(xì)胞爬片上(多聚賴氨酸包被), PTE 處理后 48 h 檢測(cè)。 根據(jù)TUNEL 試劑說(shuō)明書處理樣本, 固定、 通透、 TdT 酶標(biāo)記、Streptavidin-Fluorescein 標(biāo)記、 DAPI 復(fù)染、 封片觀察。

1.2.5 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá)

乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 以90×104/皿接種于10cm 滅菌培養(yǎng)皿中, 次日加藥PTE 500 μg/mL, 48 h 后提取總蛋白。 運(yùn)用12%的SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白; 200 mA, 1.5 h 轉(zhuǎn)膜至0.22 μm 的PVDF 膜上, 5%脫脂奶粉封閉, 一抗(1∶1000)孵育過(guò)夜(4 ℃, 約16 h); 次日回收抗體, 二抗(1∶10000)孵育1 h, 洗膜成像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件處理數(shù)據(jù), 不同劑量給藥組間抑瘤率比較采用單因素方差分析, 兩組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn), 當(dāng)p<0.05 時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 藥物提取

300 g 藥材粉末, 超聲乙醇提取, 濃縮后得總提物22 g; 乙酸乙酯萃取, 濃縮后得乙酸乙酯提取物5.4 g。

2.2 PTE 對(duì)乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞增殖的影響

MTT 結(jié)果顯示, 經(jīng)PTE 處理后24 h, 細(xì)胞增殖活性有一定降低; 加藥后48 h, 細(xì)胞密度明顯下降, 形態(tài)明顯異常, 增殖活性降低, 且呈明顯的劑量依賴性; 加藥后72 h, 細(xì)胞增殖依然被抑制, 但與加藥后48 h 的抑制效果差異不大(見圖1、圖2)。 由此表明: PTE 對(duì)MDA-MB-231 具有明顯的抑增殖作用, 48 h 時(shí)抑制作用已接近平臺(tái)期, 此時(shí)的IC50為503.4060±4.9686 μg/mL。 因此, 本實(shí)驗(yàn)選取 500 μg/mL、 48 h 為處理?xiàng)l件, 繼續(xù)下一步的研究(詳細(xì)IC50見表1)。

圖1 PTE 對(duì)MDA-MB-231 增殖的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of PTE on proliferation of MDA-MB-231

圖2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察Fig.2 Cell morphology

表1 星毛冠蓋藤乙酸乙酯提取物對(duì)乳腺癌細(xì)胞的IC50Table 1 IC50 of ethyl acetate extract of Pileostegia tomentella on breast cancer cells

2.3 PTE 對(duì)乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞的殺傷效果

PTE 500 μg/mL 處理細(xì)胞, 48 h 后進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色。 結(jié)果顯示: 每個(gè)樣本, 即4 個(gè)計(jì)數(shù)大格細(xì)胞總數(shù)約600 ~800 個(gè), 其中陰性組死細(xì)胞約40 ~50 個(gè), PTE 組死細(xì)胞約300 ~350 個(gè),陰性組死亡率3.87%, PTE 組細(xì)胞死亡率42.99%(見圖3),提示PTE 對(duì)乳腺癌細(xì)胞具有明顯的殺傷作用。

圖3 臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果Fig.3 Results of Trypan blue staining

2.4 PTE 對(duì)乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞凋亡的影響

PTE 500 μg/mL 處理細(xì)胞, 以2.8 mg/mL 的環(huán)磷酰胺處理做陽(yáng)性對(duì)照, 陰性對(duì)照組不做任何處理, 48 h 后進(jìn)行TUNEL染色。 結(jié)果顯示, 陰性對(duì)照組未出現(xiàn)綠色熒光, PTE 組和環(huán)磷酰胺組檢測(cè)到明顯綠色熒光顆粒。 結(jié)果提示: PTE 可以誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡(見圖4)。

圖4 TUNEL 染色結(jié)果Fig.4 Results of TUNEL

2.5 PTE 對(duì)乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞中Caspapse-3 表達(dá)的影響

PTE 500 μg/mL 處理細(xì)胞, 48 h 后提蛋白檢測(cè)。 結(jié)果顯示,PTE 顯著激活了Caspase-3(見圖5), 這表明Caspase-3 參與了PTE 誘導(dǎo)MDA-MB-231 細(xì)胞凋亡的過(guò)程。

圖5 Western blot 檢測(cè) MDA-MB-231 加藥 48 h 后Caspase-3 的表達(dá)情況Fig.5 MDA-MB-231 Cells were treated withPTE (500 μg/mL)for 48 h, the expressions of Pro-Casp-3were deteted by Western blot

3 結(jié) 論

星毛冠蓋藤, 是虎耳草科冠蓋藤屬植物[4], 主要化學(xué)成分包括黃酮類、 苷類、 香豆素類、 萜類、 芳香類等[5], 具有抗氧化、 抗腫瘤的生物活性[6]。 目前, 關(guān)于星毛冠蓋藤的研究?jī)H有少數(shù)幾篇文獻(xiàn)報(bào)道, 且大多集中于化學(xué)成分的研究以及提取技術(shù)的優(yōu)化, 缺乏對(duì)其抗腫瘤藥理的報(bào)道。 此外, 由于三陰乳腺癌中缺乏ER、 PR、 HER-2 的表達(dá), 其對(duì)內(nèi)分泌治療和HER-2靶向治療并不敏感, 目前十分缺乏科學(xué)有效的治療手段。 因此, 本研究選取三陰乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 作為研究對(duì)象,探究星毛冠蓋藤乙酸乙酯部位對(duì)其增殖及凋亡的影響。

MTT 比色法是常用的細(xì)胞活性檢測(cè)技術(shù), 一般用于大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選[7], 但其只能反映細(xì)胞的存活狀態(tài), 無(wú)法鑒別細(xì)胞的增殖抑制與死亡。 因此, 本研究運(yùn)用MTT 與經(jīng)典的臺(tái)盼藍(lán)染色技術(shù)相結(jié)合的方法[8], 對(duì)PTE 的作用進(jìn)行雙向驗(yàn)證,結(jié)果發(fā)現(xiàn): PTE 對(duì)三陰乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞的增殖活性具有顯著的劑量依賴性抑制作用。 明場(chǎng)顯微鏡下觀察可見: 與陰性組相比, 藥物處理后的細(xì)胞密度明顯下降, 形態(tài)不再是平滑的梭形, 而呈異常的球形, 明顯皺縮, 細(xì)胞間連接減少。 同時(shí), 臺(tái)盼藍(lán)結(jié)果顯示, 加藥后的細(xì)胞死亡率顯著增高。 由此可見, PTE 對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞具有抑增殖、 促死亡的雙重作用。 與我們的研究結(jié)果一致, 王云卿[9]、 謝金攀[10]等人報(bào)道,星毛冠蓋藤總提取物和石油醚、 乙酸乙酯、 正丁醇等部位萃提物可有效抑制肝癌、 宮頸癌細(xì)胞的增殖活性, 都肯定了星毛冠蓋藤的抗癌效果。

凋亡是細(xì)胞程序性死亡的主要方式, 與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[11]。 本實(shí)驗(yàn)對(duì)三陰乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 進(jìn)行了凋亡相關(guān)的研究。 運(yùn)用TUNEL 染色法對(duì)加藥后的細(xì)胞樣本進(jìn)行了檢測(cè), 結(jié)果發(fā)現(xiàn): PTE 組樣本中可見明亮的綠色熒光顆粒,提示細(xì)胞發(fā)生了凋亡。 同時(shí), PTE 加藥后48 h, Caspase-3 前體表達(dá)降低, 提示PTE 可以導(dǎo)致MDA-MB-231 細(xì)胞中Caspase-3的激活。 由此可見, PTE 能顯著抑制三陰乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 的增殖活性并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡, 其生理機(jī)制與Caspase-3的激活有關(guān)。 Caspase-3 是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行蛋白, 在藥物誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡的過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[12], 有研究表明, 星毛冠蓋藤乙酸乙酯萃取物可以通過(guò)介導(dǎo)ROS 的產(chǎn)生來(lái)誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞H1299 發(fā)生Caspase 依賴的凋亡, 從而發(fā)揮抗癌作用[13]; 總香豆素部位可以顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29 的增殖、 克隆、 遷移和侵襲能力, 還能顯著下調(diào)細(xì)胞中Bcl-2 和NF-κB 的蛋白表達(dá), 激活 Caspase-3 , 促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14]。 這提示我們, 在PTE 激活Caspase-3, 誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡的過(guò)程中, 可能會(huì)有 ROS、 Bcl-2、 NF-κB 以及 Caspase-3 等分子的參與, 具體的分子生物學(xué)機(jī)制尚需進(jìn)一步的深入探討。