王興蘭, 王麗麗, 程 飛, 樊玲玲,3, 張吉泉,3, 湯 磊,,3

(1 貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院, 貴州 貴陽(yáng) 550025; 2 貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥衛(wèi)生管理學(xué)院, 貴州 貴陽(yáng) 550025;3 貴州省化學(xué)合成藥物研發(fā)利用工程技術(shù)研究中心, 貴州 貴陽(yáng) 550004)

植物病原菌對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)有著非常重要的影響[1-2], 不僅可以感染植物任何生長(zhǎng)階段的任何組織, 還存在一種植物感染多種病原菌的情況, 導(dǎo)致農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)急劇下降, 往往會(huì)造成重大的經(jīng)濟(jì)和生產(chǎn)損失[3-5]。 目前, 防治植物病原菌的主要方法是化學(xué)防治, 而化學(xué)殺菌劑在長(zhǎng)期使用中也相繼出現(xiàn)了藥物殘留[6]、 抗藥性[7]以及環(huán)境污染等問(wèn)題[8]。 因此, 急需研發(fā)高效、 低毒、 無(wú)殘留的新型殺菌劑。

喹啉類(lèi)化合物是一類(lèi)重要的含氮雜環(huán)化合物, 在醫(yī)藥、 農(nóng)藥產(chǎn)品方面廣泛應(yīng)用。 如6-甲基-2,3-二巰喹啉基環(huán)-S,S-二硫碳酸酯(滅螨猛)作為一種同時(shí)兼有殺菌功能的選擇性的殺螨劑[9], 用于防治葉螨、 白粉病; 二氰蒽醌幾乎可以防治所有果樹(shù)病害如葉斑病、 銹病、 炭疽病、 霜霉病、 褐腐病等[10]; 8-羥基喹啉銅作為毒性小和殘留性較低的殺菌劑[11], 用于防治蘋(píng)果樹(shù)輪紋病; 丙氧喹啉(Proquinazid)由杜邦公司開(kāi)發(fā), 主要用于防治植物白粉病[12]。 異喹啉酮類(lèi)化合物由喹啉結(jié)構(gòu)衍生而來(lái), 文獻(xiàn)報(bào)道異喹啉酮骨架化合物及其衍生物是含氮雜環(huán)化合物的重要組成部分[13], 具有多種生物活性, 如舒張血管[14]、降血壓[15]、 抗糖尿病[16]和抗腫瘤等[17], 在藥物合成以及材料科學(xué)方面多有應(yīng)用, 但在抗植物病原菌活性方面未見(jiàn)詳細(xì)報(bào)道。

磺酰基結(jié)構(gòu)穩(wěn)定, 極性較大, 具有較強(qiáng)的吸電子性質(zhì), 在藥物化學(xué)[18]、 合成材料[19]、 農(nóng)藥[20]、 除草劑[21]等多有應(yīng)用。課題組在前期研究中開(kāi)發(fā)了一種以空氣為唯一氧化劑, 亞磺酸鹽為磺化劑, 碘化鈉為碘源, AcOH/DMSO 為混合溶劑, 在無(wú)過(guò)渡金屬催化下綠色、 高效合成異喹啉-1,3-(2H, 4H)-二酮的C-4 磺?；a(chǎn)物的新方法[22]。 本文參照該方法合成18 個(gè)2-苯基-4-(苯磺?；?異喹啉-1,3(2H, 4H)-二酮衍生物, 對(duì)目標(biāo)衍生物進(jìn)行抗菌活性研究及構(gòu)效關(guān)系分析, 為后續(xù)合成殺菌劑提供參考。

圖1 目標(biāo)化合物合成路線Fig.1 The synthetic route of target compounds

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

Waters G2-XSQ-Tof 質(zhì)譜儀。

2-苯基異喹啉-1,3(2H, 4H)-二酮類(lèi)化合物, 取代亞磺酸鈉鹽(分析純), 上海阿拉丁生化科技股份有限公司; 碘化鈉(分析純), 上海阿拉丁生化科技股份有限公司; 乙酸(分析純), 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司; 二甲基亞砜(分析純), 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司; 其它所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純, 購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 供試材料

供試菌株: 油菜菌核病菌(Sclerotinia scleotiorum) 、 蘋(píng)果腐爛病菌(Valsa mali)、 小麥赤霉病菌(Fusarium graminearum)、白菜黑斑病菌(Alternaria brassicae)和煙草赤星病菌(Alternaria alternata), 均由貴州省化學(xué)合成藥物研發(fā)利用工程技術(shù)研究中心提供。

供試培養(yǎng)基: 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)。

供試藥劑: 98.0%噁霉靈(購(gòu)自衡州潤(rùn)東化工有限公司);目標(biāo)化合物 3a-3f、 3h-3k、 3m-3t 和 3w-3x, 參照文獻(xiàn)合成[22], 采用高效液相色譜儀進(jìn)行純度測(cè)定, 純度值為97% ~99%。

1.3 測(cè)定方法

采用菌絲生長(zhǎng)速率法[23-24]測(cè)定目標(biāo)化合物對(duì)5 種常見(jiàn)之物病原菌抑菌活性。 將馬鈴薯: 葡萄糖: 瓊脂按10∶1∶1 的比例制備成馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)且進(jìn)行高壓滅菌, 測(cè)試藥劑用1 mL 丙酮溶解, 加入經(jīng)滅菌并冷卻至約60 ℃的培養(yǎng)基中混勻, 倒入培養(yǎng)皿中, 待丙酮揮發(fā)后制成含藥濃度為50 μg/mL 的平板。 并設(shè)置相應(yīng)丙酮處理的空白對(duì)照, 每個(gè)處理設(shè)3 個(gè)重復(fù)。 在含藥培養(yǎng)基平板中心分別接一供試病菌的新鮮菌絲塊菌碟, 菌絲朝下, (28 ± 1)℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育4 天,十字交叉法測(cè)量菌落直徑, 計(jì)算抑菌率。 根據(jù)初篩結(jié)果將3h、3m、 3r 配置5 個(gè)質(zhì)量濃度梯度, 按照上述測(cè)定方法對(duì)抑制有效中濃度(EC50)測(cè)定, 通過(guò)公式計(jì)算藥劑對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制率:

將生長(zhǎng)抑菌率換成抑制機(jī)率值并作為縱坐標(biāo), 藥劑質(zhì)量濃度轉(zhuǎn)化為對(duì)數(shù)值作為橫坐標(biāo), 根據(jù)抑菌率進(jìn)行機(jī)率值(y)與質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)(x)之間的線性回歸關(guān)系, 求毒力回歸方程和相關(guān)系數(shù), 并計(jì)算 EC50值[25]。

2 結(jié)果與討論

2.1 目標(biāo)化合物抑菌活性的初篩

目標(biāo)化合物對(duì)五種植物性病原真菌的抑菌活性測(cè)定, 結(jié)果如表1 所示。

由表1 可見(jiàn), 待測(cè)化合物對(duì)5 種常見(jiàn)植物病原菌表現(xiàn)出不同程度的抑菌活性。 在初始濃度為50 μg/mL 時(shí), 該類(lèi)化合物對(duì)煙草赤星病菌表現(xiàn)出較高的抑菌活性, 抑菌率在30% ~90%之間; 對(duì)白菜黑斑病菌、 油菜菌核病菌抑菌活性中等, 抑菌率分別在20% ~83%、 20% ~80%之間; 對(duì)蘋(píng)果腐爛病菌抑制活性較弱, 抑菌率在10% ~80%之間, 對(duì)小麥赤霉病菌抑菌率低于60%, 可見(jiàn)上述化合物在抑菌方面選擇性較強(qiáng)。 其中, 化合物3h、 3m、 3q、 3r 對(duì)煙草赤星病菌的抑菌率分別為88.5%、88.5%、 84.6%、 80.1%, 顯著優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥噁霉靈(66.0%)。 表明當(dāng)目標(biāo)化合物母體結(jié)構(gòu)中N-2 位上為烷基取代或R2為給電子基取代及引入鹵素原子時(shí)對(duì)煙草赤星病菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌效果。

表1 目標(biāo)化合物對(duì)5 種植物病原真菌的抑菌活性Table 1 Antifungal activity of target compounds against 5 kinds of plant pathogens

初步構(gòu)效關(guān)系表明: 目標(biāo)化合物母體結(jié)構(gòu)中N-2 位為烷基取代時(shí), 測(cè)試化合物對(duì)5 種常見(jiàn)病原菌均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性(3h), 對(duì)煙草赤星的抑菌率高達(dá)88.5%, 優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥噁霉靈。 但烷基取代基的大小對(duì)不同病菌的抑菌活性略有差異;R2為供電子基團(tuán)時(shí)抑菌活性顯著高于吸電子基團(tuán)(3q、 3r、 3s、3t), 表明苯環(huán)4 位供電子基團(tuán)取代是抑制煙草赤星病菌是必要的; R2為4-Cl 原子取代時(shí), 化合物的抑菌活性大幅度提高,例如化合物3m 對(duì)煙草赤星病菌的抑菌率高達(dá)88.5%, 表明4位氯原子取代是抑制煙草赤星病菌必要活性基團(tuán)。

2.2 化合物3h、 3m 和3r 對(duì)煙草赤星病菌EC50 測(cè)定

由表2 可知, 3h、 3m、 3r 對(duì)煙草赤星病菌的 EC50值都低于殺菌劑噁霉靈(EC50= 26.99 μg/mL), 其中化合物3h 的EC50值最低, 進(jìn)一步說(shuō)明該化合物的抑菌效果強(qiáng)于其他化合物和陽(yáng)性對(duì)照噁霉靈。

表2 化合物3h、 3m、 3r 對(duì)煙草赤星病菌EC50 的測(cè)試Table 2 EC50 values against Alternaria alternata of compounds 3h, 3m and 3r

圖2 化合物3h、 3m、 3r 對(duì)煙草赤星病菌EC50 的測(cè)試Fig.2 EC50 values against Alternaria alternata of 3h, 3m and 3r

3 結(jié) 論

本文參考課題組前期研究[22]以空氣為唯一氧化劑, 亞磺酸鈉鹽為磺化劑, NaI 為碘源, AcOH/DMSO 為混合溶劑合成異喹啉二酮C-4 位磺酰化衍生物18 個(gè)。 在對(duì)5 種常見(jiàn)并具有代表性的植物病原真菌抑菌活性的測(cè)定中, 篩選出3h、 3m、 3r對(duì)煙草赤星病菌有較強(qiáng)的抑菌活性, 抑菌率顯著優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥噁霉靈(66.0%)。 3h、 3m、 3r 對(duì)煙草赤星病菌的 EC50值測(cè)定結(jié)果表明, 化合物3h 的EC50值最低, 為3.76 μg/mL, 優(yōu)于其他化合物及噁霉靈(26.99 μg/mL)。 構(gòu)效關(guān)系分析顯示異喹啉二酮N-2 位和R2上取代基對(duì)活性影響較大, 其中N-2 位異丙基取代和R2上引入鹵素原子、 給電子基會(huì)大大增強(qiáng)化合物的抑菌活性, 推測(cè)該類(lèi)結(jié)構(gòu)化合物對(duì)煙草赤星病菌能夠顯示出較強(qiáng)的抑菌活性, 可作為先導(dǎo)化合物進(jìn)一步進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化。 綜上所述, 本文首次介紹了異喹啉二酮C-4 位磺酰化產(chǎn)物在抗植物病原菌方面的活性, 可為該類(lèi)化合物在抗植物病原菌方面的應(yīng)用以及農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)奠定理論依據(jù), 同時(shí)可為后續(xù)合成小分子農(nóng)藥提供思路和參考。