蔣磊 陳漢玉 彭旭玲 胡周靜 羅茜 張永紅 蘭培敏

(十堰市太和醫(yī)院慢性病1病區(qū)，湖北 十堰 442099)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種慢性自身免疫性疾病，患者具有極高致殘率且嚴(yán)重降低生存質(zhì)量，研究表明類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎與細(xì)胞內(nèi)因子及蛋白表達(dá)異常有關(guān)〔1,2〕。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者滑膜成纖維細(xì)胞(SFs)可為關(guān)節(jié)腔及其周圍組織提供營養(yǎng)，但SFs異?；罨纱龠M(jìn)白細(xì)胞介素(IL)-1等炎癥因子釋放進(jìn)而破壞關(guān)節(jié)組織〔3〕。因而尋找SFs活化相關(guān)基因并探究其可能作用機(jī)制對治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎具有重要意義。研究表明微小RNA(miRNA)可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長及發(fā)育等過程，miRNA表達(dá)異常與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)，但仍有部分miRNA在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)生過程中的分子機(jī)制尚未完全闡明〔4〕。研究發(fā)現(xiàn)miR-18a在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)成纖維樣滑膜細(xì)胞中表達(dá)降低，其可能通過調(diào)控炎性細(xì)胞因子分泌而參與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制〔5〕。但miR-18a-5p對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞遷移、侵襲及炎癥反應(yīng)的影響及其機(jī)制尚未可知。靶基因預(yù)測顯示銀屑病易感基因 1 候選基因(PSORS1C)1可能為miR-18a-5p的靶基因，研究發(fā)現(xiàn)PSORS1C1在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者滑膜組織中上調(diào)表達(dá)，PSORS1C1可能參與滑膜組織的病變，但關(guān)于其是否通過其他途徑影響類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)生或發(fā)展尚未闡明〔6,7〕。因此，本研究分析miR-18a-5p對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)成纖維樣滑膜細(xì)胞遷移、侵襲及炎癥反應(yīng)的影響，探究其是否可調(diào)控PSORS1C1表達(dá)及其可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 MH7A購自廣州吉妮歐生物科技有限公司；正常人關(guān)節(jié)成纖維樣滑膜細(xì)胞HFLS購自江蘇無錫菩禾生物技術(shù)有限公司；10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；RNA提取試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；miR-18a-5p mimics及陰性對照均購自北京英格恩生物科技有限公司；miR-18a-5p抑制物(anti-miR-18a-5p)及其陰性對照(anti-miR-NC)、siRNA PSORS1C1(si-PSORS1C1)及其陰性對照(si-NC)均購自廣州銳博生物科技有限公司；兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、鈣黏附蛋白-E(E-cadherin)、PSORS1C1抗體與辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗均購自美國CST公司；Transwell小室購自北京萌壯科技有限公司；基質(zhì)膠購自美國BD公司；蛋白提取試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；IL-1、IL-2檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒及qRT-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染及實(shí)驗(yàn)分組 收集對數(shù)生長期MH7A細(xì)胞，待細(xì)胞生長融合至50%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，細(xì)胞隨機(jī)分為miR-18a-5p組(轉(zhuǎn)染miR-18a-5p mimics)、miR-NC組(轉(zhuǎn)染陰性對照)、si-PSORS1C1組(轉(zhuǎn)染siRNA PSORS1C1)、si-NC組(轉(zhuǎn)染陰性對照si-NC)、miR-18a-5p+pcDNA3.1-PSORS1C1組(轉(zhuǎn)染miR-18a-5p mimics后再轉(zhuǎn)染PSORS1C1過表達(dá)質(zhì)粒)、miR-18a-5p+pcDNA3.1組(轉(zhuǎn)染miR-18a-5p mimics后再轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒)，轉(zhuǎn)染后6 h更換DMEM完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，將轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2qRT-PCR檢測細(xì)胞中miR-18a-5p表達(dá)水平 按照RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成第1鏈cDNA，qRT-PCR體系：染科法實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒10 μl，cDNA 2 μl，上下游引物各0.8 μl，熒光定量PCR多比染料0.4 μl，ddH2O 補(bǔ)足體系至20 μl。qRT-PCR條件：95℃預(yù)變性3 min循環(huán)1次，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s(共循環(huán)40次)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-18a-5p的相對表達(dá)量。

1.2.3Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移及侵襲 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：取對數(shù)生長期各組MH7A細(xì)胞，加入無血清DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×108個/L，用孔徑8 μm的聚碳酸酯微膜孔將其分隔為上室與下室，小室的上室平鋪稀釋基質(zhì)膠，取500 μl含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基加入洗掃灰的下室，取300 μl細(xì)胞懸液加入小室的上室，放入37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取出聚碳酸酯微膜，使用棉簽擦去內(nèi)層細(xì)胞，PBS洗滌，多聚甲醛固定20 min，結(jié)晶紫溶液染色20 min，顯微鏡下隨機(jī)選取10個視野觀察計(jì)數(shù)。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：小室的上室不用平鋪稀釋基質(zhì)膠，其余步驟同細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)。

1.2.4熒光素酶報(bào)告基因檢測 構(gòu)建含有miR-18a-5p與PSORS1C1結(jié)合位點(diǎn)及其突變位點(diǎn)的熒光素酶報(bào)告基因載體，分別為野生型WT-PSORS1C1、突變型MUT-PSORS1C1，將WT-PSORS1C1、MUT-PSORS1C1分別與miR-18a-5p mimics、miR-NC共轉(zhuǎn)染MH7A細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，參照熒光素酶活性檢測試劑盒說明書檢測MH7A細(xì)胞熒光素酶活性。

1.2.5Western印跡檢測PSORS1C1、MMP-2、E-cadherin蛋白表達(dá) 收集各組MH7A細(xì)胞，加入蛋白裂解液，離心后提取細(xì)胞總蛋白，鄰苯三酚紅鉬法測定蛋白濃度，高溫煮沸，蛋白變性，取30 μg蛋白上樣，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，反應(yīng)結(jié)束后將其轉(zhuǎn)移硝酸纖維素膜，室溫條件下用5%脫脂奶粉封閉1 h，加一抗，4℃孵育24 h，TBST清洗，加入二抗，室溫孵育2 h，TBST洗膜，滴加電化學(xué)(ECL)顯影，置于凝膠呈現(xiàn)系統(tǒng)掃描，Quantityone軟件檢測條帶灰度值。

1.2.6檢測細(xì)胞上清液中IL-1、IL-2水平 收集各組細(xì)胞上清液，按照IL-1、IL-2檢測試劑盒說明書檢測細(xì)胞上清液中IL-1、IL-2水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1miR-18a-5p在細(xì)胞HFLS和MH7A中的表達(dá) 與HFLS細(xì)胞中miR-18a-5p表達(dá)水平(0.92±0.09)相比，MH7A細(xì)胞顯著降低(0.23±0.02，P<0.05)。

2.2過表達(dá)miR-18a-5p對細(xì)胞MH7A遷移、侵襲及炎癥因子的影響 與miR-NC組相比，miR-18a-5p組遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著減少，IL-1水平與MMP-2蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)，而IL-2水平與E-cadherin蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.05)，見圖1、表1、圖2。表明miR-18a-5p過表達(dá)可顯著抑制MH7A細(xì)胞遷移及侵襲，并可有效減緩炎癥反應(yīng)。

圖1 過表達(dá)miR-18a-5p對細(xì)胞MH7A遷移、侵襲的影響(結(jié)晶紫，×200)

圖2 過表達(dá)miR-18a-5p對細(xì)胞MH7A遷移、侵襲蛋白表達(dá)的影響

2.3miR-18a-5p靶向、調(diào)控PSORS1C1的表達(dá) Targetscan靶基因預(yù)測網(wǎng)站顯示PSORS1C1的3′UTR區(qū)存在miR-18a-5p結(jié)合位點(diǎn)，見圖3。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示，相比共轉(zhuǎn)染miR-NC、WT-PSORS1C1的MH7A細(xì)胞，共轉(zhuǎn)染miR-18a-5p mimics、WT-PSORS1C1的MH7A細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；而與共轉(zhuǎn)染miR-NC、MUT-PSORS1C1的MH7A細(xì)胞相比，共轉(zhuǎn)染miR-18a-5p mimics、MUT-PSORS1C1的MH7A細(xì)胞熒光素酶活性無顯著性變化(P>0.05)，見表2。表明miR-18a-5p可靶向結(jié)合PSORS1C1。Western印跡檢測結(jié)果顯示，與miR-NC組PSORS1C1蛋白表達(dá)水平(0.73±0.07)相比，miR-18a-5p組(0.14±0.01)顯著降低(P<0.05)；與anti-miR-NC組RSORS1C1蛋白表達(dá)水平(0.74±0.07)相比，anti-miR-18a-5p組(1.15±0.11)顯著升高(P<0.05)，見圖4。

1～4:miR-NC組，miR-18a-5p組，anti-miR-NC組，anti-miR-18a-5p組圖3 miR-18a-5p靶向PSORS1C1

表2 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

圖4 miR-18a-5p調(diào)控PSORS1C1的表達(dá)

2.4抑制PSORS1C1對細(xì)胞MH7A遷移、侵襲及炎癥因子的影響 與si-NC組相比，si-PSORS1C1組遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著減少(P<0.05)，IL-1水平與MMP-2蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)，而IL-2水平與E-cadherin蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)，見圖5、表3。

圖5 抑制PSORS1C1對細(xì)胞MH7A遷移、侵襲蛋白表達(dá)的影響

2.5過表達(dá)PSORS1C1能逆轉(zhuǎn)miR-18a-5p對細(xì)胞MH7A遷移、侵襲及炎癥因子的影響 與miR-18a-5p+pcDNA3.1組相比，miR-18a-5p+pcDNA3.1-PSORS1C1組遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著增加(P<0.05)，IL-1水平與MMP-2蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)，而IL-2水平與E-cadherin蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)，見表4、圖6。

1～2：miR-18a-5p+pcDNA3.1組;miR-18a-5p+pcDNA3.1-PSORS1C1組圖6 過表達(dá)PSORS1C1能逆轉(zhuǎn)miR-18a-5p對細(xì)胞MH7A遷移、侵襲蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎主要以手、足小關(guān)節(jié)的炎癥反應(yīng)為主要病理特征，常伴有關(guān)節(jié)外器官受累、免疫功能指標(biāo)異常等導(dǎo)致患者關(guān)節(jié)畸形甚至誘發(fā)功能障礙〔8〕。Toll樣受體可通過促進(jìn)炎癥因子的釋放而促進(jìn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)生及發(fā)展〔9〕。研究表明部分miRNA可通過抑制SFs增殖及侵襲能力進(jìn)而抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生〔10〕。

miR-18a-5p在動脈粥樣硬化疾病等其他心血管疾病中的表達(dá)水平降低，并可能作為臨床診斷心血管疾病發(fā)生的有效指標(biāo)〔11〕。沉默LncRNA H19可通過上調(diào)miR-18a-5p表達(dá)而抑制胎兒生長受限中絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖及侵襲〔12〕。LncRNA GAS5通過負(fù)調(diào)節(jié)miR-18a-5p而調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲〔13〕。miR-18a-5p通過調(diào)控Notch2途徑而抑制內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化及心臟纖維化〔14〕。研究表明MMP-2、E-cadherin表達(dá)異常與細(xì)胞遷移及侵襲能力有關(guān)，MMP-2與細(xì)胞遷移及侵襲能力呈正相關(guān)，而E-cadherin與細(xì)胞遷移及侵襲能力呈負(fù)相關(guān)〔15,16〕。提示miR-18a-5p過表達(dá)可能通過抑制MMP-2表達(dá)及上調(diào)E-cadherin表達(dá)進(jìn)而抑制MH7A細(xì)胞遷移及侵襲。已有報(bào)道指出IL-1可誘導(dǎo)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞增殖并增強(qiáng)IL-6等炎性因子的作用，IL-2屬于免疫調(diào)節(jié)因子并可抑制促炎性細(xì)胞因子及趨化因子的釋放，同時(shí)還可抑制MMPs表達(dá)進(jìn)而保護(hù)軟骨細(xì)胞〔17〕。提示miR-18a-5p過表達(dá)可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫功能進(jìn)而抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞遷移及侵襲。

PSORS1C1基因多態(tài)性與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎密切相關(guān)，還可能與強(qiáng)直性脊柱炎發(fā)生及發(fā)展有關(guān)〔18～20〕。本研究結(jié)果提示miR-18a-5p 過表達(dá)可通過下調(diào)PSORS1C1表達(dá)而降低MH7A細(xì)胞遷移、侵襲能力，并減輕機(jī)體炎癥反應(yīng)程度。

綜上，miR-18a-5p 可有效抑制SFs遷移及侵襲能力，減輕炎癥反應(yīng)，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)生過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，其作用機(jī)制與下調(diào)PSORS1C1的表達(dá)有關(guān)。