◎ 潘 寧，賀俊偉，孫萌輝，陳彬云，蘇東民

（鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450002）

花生粕的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高，含有氨基酸、蛋白質(zhì)、糖類等化合物[1]。研究發(fā)現(xiàn)，花生粕具有促進(jìn)微生物發(fā)育和代謝功能，能夠促進(jìn)雙歧桿菌的發(fā)酵[2]，還能促進(jìn)乳酸菌及其他菌類的增殖，并對(duì)面包酵母充氣有著促進(jìn)作用。此外，有學(xué)者用脫脂花生粕為原料，將其酶解成低分子多肽后與其他輔料經(jīng)加工制成天然飲品[3]。我國(guó)的花生粕主要產(chǎn)于花生榨油工業(yè)中，但由于高溫壓榨等工藝使花生粕蛋白高度變性[4]，其功能特性下降，影響了花生粕蛋白在食品工業(yè)中的推廣應(yīng)用，目前國(guó)內(nèi)外都在尋找食品工業(yè)中有效處理花生粕的方法。

等離子體一般用于材料的表面處理，可以改變材料表面的結(jié)構(gòu)及其性能[5]。在食品領(lǐng)域中，等離子體常被用來(lái)對(duì)食品進(jìn)行滅菌、滅酶處理，延長(zhǎng)食品的保質(zhì)期。劉政等[6]用等離子體對(duì)雞肉進(jìn)行處理，殺菌率達(dá)到96.34%，表明等離子體技術(shù)具有顯著的殺菌效果。等離子體還可以用于食品體系中的大分子淀粉和蛋白質(zhì)的改性和優(yōu)化[7]。

對(duì)花生粕進(jìn)行酶解是一種分離出花生粕中有效物質(zhì)的重要方法。目前，研究方法主要是利用單酶解制備花生粕多肽，但由于花生粕蛋白質(zhì)組成和結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，在花生粕蛋白酶解時(shí)，會(huì)出現(xiàn)酶解反應(yīng)速度慢、水解度較低、水解產(chǎn)物功能性質(zhì)差等問(wèn)題，且在單酶酶解過(guò)程中所生成的蛋白存在大量疏水性氨基酸殘基，影響蛋白的品質(zhì)，這些問(wèn)題都限制了花生粕酶解產(chǎn)物的利用價(jià)值[8-10]。因此，尋找一種高效的處理辦法是現(xiàn)階段的研究重點(diǎn)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Alcalase 堿性蛋白酶對(duì)花生粕蛋白具有較好的酶解效果，為系統(tǒng)揭示等離子體對(duì)花生粕蛋白酶解特性的影響，本文以花生粕為原料，進(jìn)行等離子體預(yù)處理，根據(jù)處理時(shí)間的不同，對(duì)其水解度、分子量分布、氨基酸組成等指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，系統(tǒng)揭示等離子體對(duì)花生粕蛋白酶解特性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生粕蛋白（粗蛋白85.4%）；Alcalase 蛋白酶（酶活為3.9×105U·mL-1，經(jīng)福林法測(cè)得），Sigma公司；Na2CO3、NaOH、酒石酸鉀鈉、CuSO4、硼酸鈉、NaHCO3、NaH2PO4和Na2HPO4，天津市大茂化學(xué)試劑廠；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CTP-2000K 等離子體實(shí)驗(yàn)裝置，南京蘇曼電子有限公司；JSM-76490LV 掃描電子顯微鏡，日本JEOL公司；TGL-16 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，湖南省長(zhǎng)沙市望城經(jīng)濟(jì)開發(fā)區(qū)湘儀工業(yè)園；L8900 氨基酸分析儀，日立（中國(guó)）有限公司；Waters 1525 高效液相色譜儀，美國(guó)Waters 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 花生粕蛋白的等離子體預(yù)處理

將2 g 花生粕蛋白溶解于50 ℃去離子水，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的花生粕蛋白懸浮液，恒溫?cái)嚢? min，經(jīng)功率為750 W、射頻25 kHz、氣體壓力0.18 MPa 的壓縮空氣、射流出口流速為30 L·min-1的等離子體處理機(jī)處理（分別處理0 s、30 s、60 s、90 s、120 s 和150 s），同時(shí)用1 mol·L-1NaOH 溶液調(diào)節(jié)其pH 值至9.0；加入6 080 U·g-1的Alcalase 蛋白酶，恒溫勻速攪拌，同時(shí)添加NaOH 溶液維持酶解體系的pH 值不變；在酶解時(shí)間為90 min 時(shí)，將酶解液轉(zhuǎn)至100 ℃水浴中加熱10 min 滅酶，冷卻后于4 ℃、8 000 r·min-1條件下離心10 min 除去沉淀，取上清液，將酶解殘?jiān)占?，放入離心機(jī)，于溫度4 ℃、轉(zhuǎn)速10 000 r·min-1條件下離心20 min，取殘?jiān)瑢⑸锨逡号c酶解殘?jiān)鋬龈稍?，研磨即得花生粕蛋白。采用pH-stat 法計(jì)算花生粕蛋白的水解度，計(jì)算公式為

式中：V為水解過(guò)程中氫氧化鈉的消耗量，mL；Nb為氫氧化鈉的濃度，mol·L-1；α為亞麻籽粕蛋白的平均解離度，在50 ℃、pH 8.5 條件下α為0.955（無(wú)量綱）；Mp為底物中蛋白質(zhì)的總量，g；htot為底物中每g蛋白質(zhì)的肽鍵總數(shù)，亞麻籽粕蛋白的htot為8.38，mEq。

1.3.2 氨基酸組成分析

參考CHEN 的方法[11]，對(duì)組成花生粕蛋白的氨基酸進(jìn)行分類，并計(jì)算各類氨基酸所占比例。

1.3.3 分子量分布的測(cè)定

參考張艷艷[19]的方法，采用高效凝膠過(guò)濾色譜法測(cè)定花生粕蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量分布。色譜條件：色譜柱為TSKgel 2000 SWXL（300 mm×7.8 mm）；流動(dòng)相為乙腈-水-三氟酸（45 ∶55 ∶0.1）；流速為0.5 mL·min-1；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣體積為20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm。

1.3.4 對(duì)酶解反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究

分別稱取5 g·L-1、10 g·L-1、15 g·L-1、20 g·L-1和25 g·L-1花生粕蛋白溶液放置在恒溫加熱磁力攪拌器上50 ℃加熱5 min，后經(jīng)功率為750 W 的等離子體表面處理機(jī)處理120 s，將處理好的樣品置于50 ℃，410 r·min-1的恒溫加熱磁力攪拌器上，用1 mol·L-1NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 值為9.0，并保持在9.0 不變，加入200 μL 堿性蛋白酶，前15 min 每隔1 min 記一次NaOH 消耗量，15 min 后每隔5 min 記錄一次NaOH 消耗量。酶解70 min 后將酶解液水浴加熱至100 ℃，滅酶10 min。以不經(jīng)等離子體預(yù)處理的為對(duì)照組。測(cè)定前15 min 對(duì)酶解反應(yīng)初速度的影響及其對(duì)酶解動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響。

根據(jù)SONG 等[12]報(bào)道的實(shí)驗(yàn)方法研究花生粕蛋白的水解動(dòng)力學(xué)得到公式為

式中：V為反應(yīng)初速度，g·L-1·min-1；KA為表觀分解率常數(shù)的平均值或酶與底物結(jié)合頻率的平均值，min-1；ET為反應(yīng)體系中酶濃度，g·L-1；KM為表觀常數(shù)（類似于米氏常數(shù)），g·L-1；S為初始底物濃度，g·L-1。

1.3.5 場(chǎng)發(fā)射電鏡測(cè)定

將樣品使用真空冷凍干燥機(jī)進(jìn)行干燥，敲擊干燥后的樣品使樣品自然斷裂，選擇大小合適、表面平整均勻的樣品，將樣品固定在導(dǎo)電膠上，噴金，然后在15 kV 下，使用掃描電子顯微鏡在1 000 倍的放大倍數(shù)下觀察樣品的微觀結(jié)構(gòu)。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析及處理

用Microsoft Excel 2016對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析，用Origin 2018 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖。通過(guò)SPSS 18.0 進(jìn)行單因素方差分析（p＜0.05）。每個(gè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，取平均值，數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 等離子體預(yù)處理對(duì)花生粕蛋白水解度的影響

由圖1 可知，花生粕蛋白水解度隨著預(yù)處理時(shí)間的增加而增加，在前20 min 內(nèi)花生粕蛋白水解度（Degree of Hydrolysis，DH）呈指數(shù)增長(zhǎng)，20 min 后增長(zhǎng)逐漸平緩，到最后階段趨于穩(wěn)定。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，花生粕蛋白在90 min 時(shí)水解度最大，因此對(duì)花生粕蛋白酶解90 min 并記錄水解度，結(jié)果如表1 所示。根據(jù)表1 結(jié)果可看出花生粕蛋白在處理120 s 時(shí)DH達(dá)到最大，為30.22%，超過(guò)120 s 之后，花生粕蛋白的DH相對(duì)降低。造成這種現(xiàn)象的原因是適當(dāng)?shù)牡入x子體預(yù)處理可以使花生粕蛋白顆粒細(xì)化、螺旋結(jié)構(gòu)舒展、酶解位點(diǎn)暴露，更有利于酶解反應(yīng)的發(fā)生；此外，等離子體處理會(huì)引起多肽分子疏水鍵外露，肽鏈末端疏水性氨基酸增多，但當(dāng)處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，花生粕蛋白由于疏水性增加過(guò)大又會(huì)發(fā)生聚集折疊，導(dǎo)致溶解度下降[13]，不利于酶解反應(yīng)的進(jìn)行，導(dǎo)致DH逐漸趨于平緩。

表1 不同處理時(shí)間的花生粕蛋白水解度的參數(shù)表

圖1 等離子體預(yù)處理對(duì)花生粕蛋白水解度的影響圖

綜上，與對(duì)照（等離子體預(yù)處理0 s）相比，等離子體預(yù)處理提高了花生粕蛋白的DH，這是由于等離子體預(yù)處理改變了花生粕蛋白的酶解特性，使得更多的與DH有關(guān)的疏水性基團(tuán)暴露出來(lái)[14]。最佳的等離子體預(yù)處理時(shí)間為120 s。

2.2 等離子體預(yù)處理對(duì)花生粕蛋白酶解產(chǎn)物氨基酸組成的影響

氨基酸組成對(duì)蛋白酶解物酶解特性的研究具有十分重要的意義，本次試驗(yàn)測(cè)定了不同等離子體處理下的花生粕蛋白的氨基酸組成。如表2 所示，花生粕蛋白中酸性氨基酸含量（25.38%～27.00%）比堿性氨基酸含量（12.22%～13.88%）高，表明花生粕蛋白呈弱酸性，這與丁香麗[15]從大麥籽粒中提取的抗凍蛋白的酸性氨基酸和堿性氨基酸比例相似。花生粕蛋白中親水性氨基酸所占比例（26.49%～28.41%）顯著高于疏水性氨基酸殘基所占比例（21.03%～22.23%），具有多數(shù)蛋白類物質(zhì)所具有的高親水性氨基酸含量特征[16]。

表2 等離子體預(yù)處理對(duì)花生粕蛋白氨基酸組成的影響表

從表中數(shù)據(jù)可以看出，不同等離子體處理下的花生粕蛋白均富含Glu、Arg、Asp、Leu 和Phe 5 種氨基酸，結(jié)合花生粕蛋白的DH結(jié)果，說(shuō)明以上氨基酸很可能在花生粕蛋白的水解過(guò)程中起到了重要作用。其中Glu 殘基（強(qiáng)極性羥基）、Arg 和Asp 殘基（提供部分非極性環(huán)境以穩(wěn)定氫鍵）含量較多，有助于花生粕蛋白的酶解。

2.3 等離子體預(yù)處理對(duì)花生粕蛋白分子量分布的影響

表3 為不同等離子體處理?xiàng)l件下花生粕蛋白中各分子量范圍內(nèi)肽段的相對(duì)含量。經(jīng)過(guò)等離子體預(yù)處理的花生粕蛋白，分子量大于3 000 u 的分子沒(méi)有明顯變化，在200 ～3 000 u 的肽段顯著降低，小于200 u 的小分子活性肽有顯著增加，表明經(jīng)過(guò)等離子體處理后花生粕蛋白分子量分布向小分子肽段轉(zhuǎn)移；在本研究中，經(jīng)過(guò)不同等離子體預(yù)處理下的花生粕蛋白均富含＜1 000 u 的短肽（主要由2 ～10 個(gè)氨基酸組成），占比超56%，當(dāng)?shù)入x子體預(yù)處理為120 s 時(shí)，小于1 000 u 的小分子活性肽最多，達(dá)到總含量的61.80%；其中在預(yù)處理時(shí)間為30 s 和60 s 過(guò)程中花生粕蛋白小于1 000 u的肽段也分別達(dá)到了59.31%、58.47%。WANG 等[17-18]的研究結(jié)果與這相似，抗凍多肽的分子量主要分布在200 ～1 000 u（占比80%），分子量在500 ～2 000 u的肽段比其他分子量范圍內(nèi)的肽段更有效地抑制了冰晶的生長(zhǎng)和重結(jié)晶，從而增大了酶解特性；在本研究中，相對(duì)于對(duì)照，經(jīng)過(guò)等離子體預(yù)處理的花生粕蛋白分子量在200 ～1 000 u 的肽段相對(duì)含量較高，這可能與花生粕蛋白的酶解特性較高有著一定的聯(lián)系。

表3 不同等離子體預(yù)處理對(duì)花生粕蛋白分子量分布的影響表

2.4 等離子體預(yù)處理對(duì)花生粕蛋白酶解反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的影響

2.4.1 等離子體預(yù)處理對(duì)花生粕蛋白酶解過(guò)程的影響在固定等離子體預(yù)處理處理時(shí)間為120 s、料液初始溫度為50 ℃、功率為750 W、射頻為25 kHz、氣體壓力為0.18 MPa 的壓縮空氣、射流出口流速為30 L·min-1的等離子體表面處理機(jī)的基礎(chǔ)上，研究不同底物濃度對(duì)花生粕蛋白的多肽濃度的影響，其結(jié)果見圖2。

圖2 不同底物濃度的酶解進(jìn)程曲線對(duì)比圖

由圖2 可知，等離子體預(yù)處理對(duì)花生粕蛋白的酶解過(guò)程產(chǎn)生了一定影響。相同的酶解時(shí)間下，底物濃度越大，被水解的蛋白濃度也越大，表明花生粕蛋白的多肽濃度隨底物濃度的增加而升高。與對(duì)照樣品相比，在相同的底物濃度下，酶解反應(yīng)前40 min 等離子體預(yù)處理樣品的多肽濃度存在小幅度提高；酶解反應(yīng)40 min 后，經(jīng)過(guò)等離子處理的底物濃度為10 g·L-1、15 g·L-1的花生粕蛋白的多肽濃度相對(duì)于對(duì)照有一定程度的降低，當(dāng)料液濃度為5 g·L-1、20 g·L-1、25 g·L-1時(shí)，經(jīng)過(guò)等離子體處理的花生粕蛋白多肽濃度沒(méi)有明顯變化，造成這種現(xiàn)象的原因可能是料液濃度過(guò)低時(shí)，等離子體處理的作用力致使蛋白顆粒減少，而未充分相互碰撞，過(guò)高的料液濃度會(huì)影響物料的傳質(zhì)傳熱效果，而適度的料液濃度使蛋白顆粒能夠充分接受等離子體處理的作用力，同時(shí)使蛋白之間發(fā)生強(qiáng)烈的碰撞[19]，提高了等離子體對(duì)蛋白的作用力效果。

2.4.2 等離子體預(yù)處理對(duì)花生粕蛋白酶解初速度的影響

在保持等離子體參數(shù)恒定（預(yù)處理處理時(shí)間為120 s、料液初始溫度為50 ℃、功率為750 W、射頻為25 kHz、氣體壓力為0.18 MPa 的壓縮空氣、射流出口流速為30 L·min-1）的情況下，研究了不同底物濃度對(duì)花生粕蛋白酶解反應(yīng)初速度的影響。

從表4 可看出，其線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)均在0.85 以上，具有較好的可信度。在相同的酶解時(shí)間下，隨著底物濃度的增加，初速度也隨之增加；與對(duì)照相比，實(shí)驗(yàn)組的初速度在相同的酶解時(shí)間下均比對(duì)照組要高，其中底物濃度為25 g·L-1的花生粕蛋白的酶解初速度最大為0.009 8，表明當(dāng)?shù)孜餄舛仍礁?，溶液中越多的蛋白與酶發(fā)生碰撞反應(yīng)；底物濃度為20 g·L-1的花生粕蛋白的酶解初速度與對(duì)照相比差值最大。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因是施加適當(dāng)時(shí)間的等離子體預(yù)處理，可以為整個(gè)體系提供充足的能量，在一定程度上可以引起蛋白酶解特性的改變[20]。同時(shí)，當(dāng)?shù)孜餄舛冗^(guò)低時(shí)，蛋白分子與酶的碰撞不完全，不利于蛋白分子活性基團(tuán)的暴露，也不利于蛋白底物和蛋白酶的相互作用[19]。

表4 酶解過(guò)程經(jīng)等離子體預(yù)處理對(duì)不同底物濃度花生粕蛋白水解反應(yīng)初速度的影響表

2.4.3 經(jīng)等離子體預(yù)處理對(duì)花生粕蛋白酶解動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響

表5 為花生粕蛋白經(jīng)等離子體預(yù)處理后酶解反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的變化情況。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)KA基本不變，說(shuō)明酶被底物飽和時(shí)的最大反應(yīng)速率相近[21]。KM與米氏常數(shù)類似，表示酶對(duì)底物的匹配程度，KM越小，表明蛋白酶與底物的親和力越強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)組的KM比對(duì)照組降低了14.67%，表明經(jīng)過(guò)等離子體預(yù)處理后可使酶與底物的親和力在短時(shí)間內(nèi)增大[22]。通過(guò)KM與KA可以表明，等離子體預(yù)處理對(duì)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的影響可以通過(guò)改變酶與底物的親和力的方式實(shí)現(xiàn)。

表5 酶解過(guò)程經(jīng)等離子體預(yù)處理對(duì)花生粕蛋白水解動(dòng)力學(xué)參數(shù)影響表

2.5 等離子體預(yù)處理對(duì)花生粕蛋白微觀結(jié)構(gòu)的影響

利用場(chǎng)發(fā)射電鏡觀察經(jīng)等離子體預(yù)處理后花生粕蛋白的顯微結(jié)構(gòu)變化，其結(jié)果如圖3。通過(guò)圖3-A 可以看出，對(duì)照組的表面為不規(guī)則球體狀，表面凹凸不平。與對(duì)照相比，實(shí)驗(yàn)組中圖3 中B 圖和C 圖表面為片狀結(jié)構(gòu)，表面不規(guī)則有凸起，表明花生粕蛋白致密的膠團(tuán)結(jié)構(gòu)受到破壞，分裂成較小的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[23]。實(shí)驗(yàn)組中圖3 中E 圖和F 圖的表面為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，表明在等離子體處理前期，蛋白質(zhì)顆粒迅速細(xì)化，但在經(jīng)過(guò)等離子體處理一定時(shí)間之后開始出現(xiàn)蛋白質(zhì)分子聚集現(xiàn)象。等離子體處理前期由于微射流作用而引起蛋白顆粒疏松破碎，傳質(zhì)效果改善[19,24]；隨著等離子體處理時(shí)間的延長(zhǎng)，花生粕蛋白以分子形態(tài)暴露出來(lái)，等離子體作用會(huì)引起蛋白質(zhì)分子的疏水鍵外露。

圖3 等離子體預(yù)處理的花生粕蛋白酶解殘?jiān)奈⒂^結(jié)構(gòu)圖

花生粕蛋白表面微觀形貌的變化將直接影響其酶解特性的改變。主要是表面微觀形貌的變化會(huì)引起蛋白表面疏水性基團(tuán)重新分布，進(jìn)而影響花生粕蛋白的酶解特性；此外，表面微觀形貌的變化會(huì)引起蛋白比表面積的改變，影響蛋白與酶接觸的機(jī)會(huì)進(jìn)而使得蛋白酶解的速度改變[25]。

3 結(jié)論

本文研究了不同等離子體預(yù)處理時(shí)間對(duì)花生粕蛋白酶解特性的影響規(guī)律。研究結(jié)果表明了等離子體預(yù)處理花生粕蛋白不僅有效提高了其水解度，而且也使得分子量分布向小分子肽段轉(zhuǎn)移，使分子量主要集中在200 ～1 000 u；通過(guò)對(duì)花生粕蛋白進(jìn)行酶解動(dòng)力學(xué)測(cè)定，結(jié)果表明適當(dāng)時(shí)間的等離子體預(yù)處理，可以為整個(gè)體系提供充足的能量，在一定程度上可以引起蛋白酶解特性的改變。同時(shí)，等離子體預(yù)處理對(duì)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的影響可以通過(guò)改變酶與底物的親和力的方式實(shí)現(xiàn)。本文系統(tǒng)揭示了等離子體調(diào)控過(guò)程中底物蛋白關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域變化與其酶解特性之間的內(nèi)在關(guān)聯(lián)機(jī)制，為制備高效酶解和結(jié)構(gòu)緊湊的花生粕蛋白提供了理論基礎(chǔ)。