陳思劼，蔡舒婷，徐靜，陳雅娟，陳斌斌，陳曉莉，熊紅萍，2

1.廈門大學(xué)附屬福州第二醫(yī)院內(nèi)分泌科，福建福州 350007；2.福建醫(yī)科大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，福建福州 350007；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，福建福州 350122

代謝相關(guān)脂肪性肝?。╩etabolic associated fatty liver disease, MAFLD）是一種遺傳易感、環(huán)境因素和代謝紊亂相互作用導(dǎo)致的慢性肝病，其患病率逐年上升，累及全球約25%的人口[1]。糖代謝紊亂、胰島素抵抗、內(nèi)臟型肥胖等代謝因素被認(rèn)為是與MAFLD 關(guān)系最為密切的危險(xiǎn)因素，同時(shí)也是2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus, T2DM）的臨床特征，故MAFLD 與T2DM 共病率較高。研究顯示，在全球T2DM 人群中MAFLD 的患病率高達(dá)47.3%～63.7%[2]。腸道菌群能夠參與動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)人體能量穩(wěn)態(tài)和免疫反應(yīng)。當(dāng)遺傳、環(huán)境因素、飲食和行為模式發(fā)生改變后，人體內(nèi)腸道菌群可能發(fā)生漂移。近年來不斷有研究發(fā)現(xiàn)T2DM 和NAFLD 患者伴有腸道菌群漂移表現(xiàn)[3]。青少年T2DM 中合并MAFLD的患者逐年增多，但這部分人群的腸道菌群漂移特點(diǎn)尚未明確。因此，本研究回顧性選取2020年10月—2021年7月就診于廈門大學(xué)附屬福州第二醫(yī)院內(nèi)分泌科并接受肝臟彩超的青少年2 型糖尿病患者44 例為研究對(duì)象，按照是否合并代謝相關(guān)脂肪性肝病分為非MAFLD 組和MAFLD 組，比較兩組人群的腸道菌群，旨在探討青少年T2DM 人群中MAFLD 與腸道菌群數(shù)量的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取于本院內(nèi)分泌科接受肝臟彩超的青少年2型糖尿病患者44 例為研究對(duì)象，根據(jù)MAFLD 診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]，將其中不符合MAFLD 診斷的18 例患者設(shè)為非MAFLD 組，符合MAFLD 診斷的26 例患者設(shè)為MAFLD 組。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（No.2020018），所有對(duì)象均知情同意。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《中國(guó)2 型糖尿病防治指南（2020年版）》[4]的診斷及分型標(biāo)準(zhǔn)；②年齡14～40歲，性別不限；③臨床資料完整，知情同意。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①妊娠或哺乳期女性；②糖尿病酮癥酸中毒、高滲性昏迷等急性并發(fā)癥患者；③急、慢性感染患者；④急性心臟、肝臟、胃腸道、腎臟及腦血管病變患者；⑤半年以內(nèi)嚴(yán)重外傷、手術(shù)者；⑥惡性腫瘤、臨床結(jié)締組織疾病等患者；⑦其他嚴(yán)重內(nèi)分泌代謝性疾病患者（如甲狀腺功能亢進(jìn)、甲狀腺功能減退、庫(kù)欣綜合征等）。

1.3 方法

所有患者就診時(shí)采集其清晨糞便樣本，將新鮮糞便樣本（10±5） g 于2 h 內(nèi)速凍于-80℃冰箱中。采用QIAamp DNA Stool Mini Kit 試劑盒進(jìn)行基因組抽提樣本中微生物的總DNA，將所提取的DNA 為模板，根據(jù)菌群16 S rRNA V4V5 序列設(shè)計(jì)各類菌種特異性引物，引物序列見表1。采用FTC-3000 熒光定量PCR 儀（加拿大Funglyn Biotech 公司）對(duì)腸道中常見幾種細(xì)菌進(jìn)行定量測(cè)定，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，在95℃變性10 s，55℃退火 30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)40 次。熒光數(shù)據(jù)采集在延伸時(shí)進(jìn)行。每個(gè)糞便標(biāo)本均測(cè)量3 次，取平均CT 值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算該菌屬基因拷貝數(shù)，并經(jīng)Log10 轉(zhuǎn)化后表示每克糞便腸道菌屬的數(shù)量。

表1 各類菌種特異性引物序列

收集所有患者：①人體學(xué)指標(biāo)：身高、體質(zhì)量、腹圍，計(jì)算身體質(zhì)量指數(shù)（body mass index, BMI）=體質(zhì)量/身高2（kg/m2）；②生化代謝指標(biāo)：空腹血糖（fasting plasma glucose, FPG）、餐后2 h 血糖（2 h postprandial plasma glucose, 2 hPG）、糖化血紅蛋白（glycosylated hemoglobin, HbA1c）、三酰甘油（triglycerides, TG）、總膽固醇thosetotal cholesterol, TC）、高密度脂蛋白膽固醇（thosehigh-density lipoprotein cholesterol, HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C）、尿 酸（serum uric acid, SUA）、肌酐；③炎癥指標(biāo)：中性粒細(xì)胞淋巴細(xì)胞比值(neutrophil-to-lymphocyte ratio, NLR)、血小板淋巴細(xì)胞比值（platelet-lymphocyte ratio, PLR）；④甲狀腺功能：促甲狀腺激素（thyroid stimulating hormone, TSH）、游離三碘甲狀原氨酸（free triiodothyronine, FT3）、游離甲狀腺激素（free thyroxine, FT4），通過問卷收集吸煙史、飲酒史、糖尿病家族史。

1.4 觀察指標(biāo)

①對(duì)比兩組一般資料、人體學(xué)指標(biāo)、生化代謝指標(biāo)、炎癥指標(biāo)及甲狀腺功能水平；②對(duì)比兩組腸道主要菌群數(shù)量；③腸道菌群與相關(guān)臨床指標(biāo)的相關(guān)分析；④腸道菌群與MAFLD 的相關(guān)性分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析數(shù)據(jù)。使用Shapiro–Wilk 檢驗(yàn)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用（±s）表示，組間差異比較進(jìn)行t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用率（%）表示，組間差異比較進(jìn)行單因素ANOVA 檢驗(yàn)分析或χ2檢驗(yàn)分析。采用Pearson 相關(guān)性分析進(jìn)行腸道菌群與人體學(xué)指標(biāo)、糖脂代謝指標(biāo)等相關(guān)性分析。采用Logistics 回歸分析青少年T2DM 患MAFLD 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料、人體學(xué)指標(biāo)、生化代謝指標(biāo)、炎性指標(biāo)及甲狀腺功能比較

兩組性別、飲酒史、糖尿病家族史比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；MAFLD 組年齡較非MAFLD組小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。人體學(xué)指標(biāo)方面，MAFLD 組BMI、腹圍均大于非MAFLD 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。生化代謝指標(biāo)方面，MAFLD 組HDL-C 低于非MAFLD 組，血尿酸水平高于 非MAFLD 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；MAFLD 組FPG 及2 hPG 水平均高于非MAFLD 組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。兩組NLR、PLR 比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），MAFLD 組TSH 水平高于非MAFLD 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組一般資料、人體學(xué)指標(biāo)、生化代謝指標(biāo)、炎性指標(biāo)及甲狀腺功能比較

2.2 兩組腸道主要菌群數(shù)量比較

MAFLD 組的柔嫩梭菌屬和雙歧桿菌屬數(shù)量明顯均低于非MAFLD 組，腸球菌屬和乳酸菌屬數(shù)量明顯均高于非MAFLD 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 兩組腸道主要菌群數(shù)量對(duì)比 (±s)

表3 兩組腸道主要菌群數(shù)量對(duì)比 (±s)

菌群菌群總量（16S V4V5）腸球菌屬大腸桿菌屬厚壁菌門擬桿菌屬柔嫩梭菌屬乳酸菌屬雙歧桿菌非MAFLD 組（n=18）11.158±0.339 6.681±0.854 8.112±0.882 10.234±0.324 10.259±0.465 9.448±0.739 6.514±1.032 7.354±1.134 MAFLD 組（n=26）11.052±0.364 7.268±1.014 7.854±1.248 10.038±0.546 9.872±0.907 8.764±0.687 7.106±0.700 6.513±0.753 t 值0.978-2.007 0.755 1.363 1.662 3.145-2.267 2.960 P 值0.334 0.045 0.455 0.180 0.104 0.003 0.043 0.010

2.3 腸道菌群與代謝相關(guān)臨床指標(biāo)的關(guān)系

將兩組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的腸道菌群與代謝相關(guān)臨床指標(biāo)行Pearson 相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，腸球菌屬數(shù)量與腹圍呈正相關(guān)；柔嫩梭菌屬數(shù)量與腹圍、血尿酸水平、NLR 呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；乳酸菌屬數(shù)量與腹圍、糖化血紅蛋白、低密度脂蛋白膽固醇呈正相關(guān)（P＜0.05）；雙歧桿菌與腹圍、NLR、BMI 呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。見表4。

表4 腸道菌群與臨床指標(biāo)關(guān)系

2.4 青少年2 型糖尿病腸道菌群與代謝相關(guān)脂肪性肝病的關(guān)系

為探究腸道菌群數(shù)量與青少年T2DM 發(fā)生MAFLD 的相關(guān)性，以MAFLD 為因變量，將兩組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的腸道菌群為自變量，逐個(gè)納入Logistics 回歸分析。結(jié)果提示，柔嫩梭菌、雙歧桿菌數(shù)量減少，乳酸菌屬數(shù)量增加，青少年T2DM 發(fā)生MAFLD 的概率增加。見表5。進(jìn)一步進(jìn)行多因素Logistics 回歸分析，在調(diào)整了年齡、性別、是否新診斷糖尿病、BMI 后，柔嫩梭菌屬和雙歧桿菌屬仍是青少年T2DM 發(fā)生MAFLD 的獨(dú)立保護(hù)因素（P＜0.05）；即腸道中柔嫩梭菌和雙歧桿菌數(shù)量增加，青少年T2DM 發(fā)生MAFLD 的概率降低。見表6。

表5 青少年T2DM 腸道菌群數(shù)量與MAFLD 關(guān)系

表6 影響青少年T2DM 發(fā)生MAFLD 多因素分析

3 討論

T2DM 對(duì)人體的主要危害在于其長(zhǎng)期慢性高血糖狀態(tài)對(duì)靶器官的損害，其中MAFLD 是T2DM 發(fā)生肝臟損害的主要形式[5]。近年來有研究表明，腸道菌群能通過調(diào)節(jié)宿主能量代謝、改善炎癥反應(yīng)等方式，參與T2DM、MAFLD 等多種代謝性疾病的發(fā)生和發(fā)展過程[6-8]。本研究通過比較青少年T2DM 中MAFLD 患者與非MAFLD 患者的臨床特點(diǎn)及腸道菌群的差異，探索青少年T2DM 患者腸道菌群數(shù)量與MAFLD 的關(guān)系。研究結(jié)果表明，柔嫩梭菌屬和雙歧桿菌屬是青少年T2DM 發(fā)生MAFLD 的獨(dú)立保護(hù)因素，且不受年齡、性別、病程和其他混雜因素的影響。

柔嫩梭菌是厚壁菌門的主要成員，是健康人腸道中豐度最高的菌群之一，它的缺失必然引起腸道微生態(tài)的紊亂[9]。近年來多項(xiàng)研究表明，柔嫩梭菌對(duì)于人體健康的益處來源于其產(chǎn)生的丁酸鹽，它的豐度變化與潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病等腸道炎性疾病密切相關(guān)[10]。柔嫩梭菌可在外周血單核細(xì)胞中誘導(dǎo)白細(xì)胞介素-10(interleukin, IL-10)分泌，后者是一種抗炎細(xì)胞因子[11]。Munukka 等[12]的研究表明，與高脂飲食對(duì)照小鼠相比，高脂飲食+口服柔嫩梭菌群的小鼠肝臟脂肪含量、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶及丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶降低，其機(jī)制與內(nèi)臟脂肪組織中脂聯(lián)素表達(dá)上調(diào)，皮下及內(nèi)臟脂肪組織對(duì)胰島素敏感性增加且炎癥減少相關(guān)。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，柔嫩梭菌在MAFLD 人群中數(shù)量更少，且其與血尿酸及NLR呈負(fù)相關(guān)，前者可使線粒體發(fā)生氧化應(yīng)激，激活NLRP3 炎癥復(fù)合體，加重肝臟炎癥反應(yīng)及胰島素抵抗，而后者反映機(jī)體整體的炎癥狀態(tài)，當(dāng)NLR 增加時(shí)，MAFLD 患者發(fā)生肝炎和肝纖維化的可能性更大。Martín R 等[13]從健康志愿者的糞便中分離出柔嫩梭菌菌株，通過研究其產(chǎn)物、抗生素耐藥性、免疫調(diào)節(jié)功能及代謝特征，發(fā)現(xiàn)其具有良好的抗炎作用，是下一代益生菌的良好候選者。

雙歧桿菌是目前主要使用的益生菌之一，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并測(cè)序出72 種亞種，它們?cè)谀c道功能乃至人體穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要作用[14]。一項(xiàng)研究通過肥胖并伴有T2DM 患者的十二指腸微生物群進(jìn)行宏基因組分析，揭示了肥胖、肥胖伴有T2DM 患者，雙歧桿菌屬豐度顯著低于健康個(gè)體[15]。另一項(xiàng)研究通過多組學(xué)方法，分析4 株人體腸道共生雙歧桿菌（雙歧桿菌PRL2010、青春雙歧桿菌22L、短雙歧桿菌12L、長(zhǎng)雙歧桿菌亞種）在小鼠腸道內(nèi)的相互作用[16]。研究表明，雙歧桿菌之間通過多糖獲取、多糖降解及互養(yǎng)策略在競(jìng)爭(zhēng)性環(huán)境下合作共生，多株雙歧桿菌地引入導(dǎo)致小鼠盲腸菌群組成發(fā)生顯著變化，增加了糖降解菌群，如擬桿菌的豐度，從而增強(qiáng)腸道降解植物碳水化合物及宿主多糖的能力。動(dòng)物研究表明，由乳桿菌與雙歧桿菌聯(lián)合的益生菌可以延緩高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD 病變，大鼠的體質(zhì)量、血清FFA、TG、ALT、IL-1β 和IL-18 水平顯著降低，肝臟和脂肪組織中Gpr109a 的表達(dá)顯著降低，丁酸水平顯著增加[17]。上述研究提示，雙歧桿菌與肥胖、低度炎癥、胰島素抵抗和糖代謝紊亂呈負(fù)相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)MAFLD 患者中雙歧桿菌數(shù)量更少，且與腹圍、NLR 呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），但與糖代謝指標(biāo)（FPG、2 hPG、HAb1c）無顯著相關(guān)性（P＞0.05）。

盡管不是青少年T2DM 患MAFLD 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，研究觀察到MAFLD 患者中腸球菌和乳酸桿菌的數(shù)量更多。腸球菌是檢出率僅次于大腸桿菌的第二大病原菌，當(dāng)機(jī)體大量使用抗生素或免疫力下降時(shí)，腸球菌會(huì)易位進(jìn)入其他組織器官，造成機(jī)體感染。Llorente C 等[18]的研究基于小鼠模型和人體數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)質(zhì)子泵抑制劑可通過增加腸道腸球菌的數(shù)量及促進(jìn)腸球菌的易位，導(dǎo)致肝臟炎癥及肝細(xì)胞死亡。有趣的是，作為益生菌之一，多項(xiàng)研究觀察到，乳酸桿菌與肥胖呈正相關(guān)[19-21]。目前也有研究發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌屬益生菌（如鼠李糖乳桿菌GG）通過與宿主腸道競(jìng)爭(zhēng)脂肪酸，抑制小鼠腸道中的脂肪酸代謝及吸收，從而抑制肝臟脂肪堆積，以此機(jī)制預(yù)防脂肪肝的發(fā)生[22]。由于乳酸桿菌是T2DM 和MAFLD 患者共有的特征菌群，其對(duì)這兩種代謝疾病發(fā)揮作用的相關(guān)機(jī)制還需進(jìn)一步探討。

另外，本研究發(fā)現(xiàn)，盡管在青少年T2DM 中，合并MAFLD 的患者年齡更小[（35.440±7.262）歲 vs（29.150±7.341）歲]（P＜0.05），這可能與青少年T2DM患者存在學(xué)習(xí)、事業(yè)、家庭等多重負(fù)擔(dān)，生活、飲食、睡眠習(xí)慣更差有關(guān)，增加了代謝紊亂的風(fēng)險(xiǎn)。雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，本研究發(fā)現(xiàn)青少年T2DM 人群中，男性MAFLD 患病率比女性更高。既往研究表明，MAFLD 在男性的患病率高于絕經(jīng)前女性，而在絕經(jīng)后相反，可能與體內(nèi)雌激素水平相關(guān)[23]。雌激素可以通過調(diào)節(jié)情緒和能量穩(wěn)態(tài)、調(diào)整脂肪組織功能及分布、抑制炎癥因子生成和改善胰島素抵抗等機(jī)制，阻止肝臟的脂肪變性。

本研究還發(fā)現(xiàn)甲狀腺功能正常的青少年T2DM患者中，TSH 水平和MAFLD 患病相關(guān)。一項(xiàng)橫斷面研究表明，在HbA1c≥7%的T2DM 人群中，TSH 升高不僅與MAFLD 患病率相關(guān)，還與MAFLD 脂肪變性程度相關(guān)[24]。已有的研究對(duì)于TSH 升高導(dǎo)致MAFLD 的機(jī)制做了說明：TSH 可作用于激素敏感性三酰甘油脂肪酶和脂肪甘油三酯脂肪酶這兩個(gè)脂肪分解的關(guān)鍵酶，促進(jìn)脂肪細(xì)胞的分化，從而抑制脂肪組織的分解；此外，TSH 通過調(diào)節(jié)肝細(xì)胞內(nèi)固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(sterol regulatory element binding proteins, SREBP-1c)的表達(dá)活性，達(dá)到增加三酰甘油合成的目的[25]。

但本研究仍存在一些局限性：①研究樣本數(shù)量小，研究結(jié)果存在地域限制；②沒有詳細(xì)的用藥史，不能排除降糖藥物對(duì)腸道菌群的影響；③由于本研究的性質(zhì)為回顧性分析，腸道菌群與青少年T2DM人群患MAFLD 之間的因果關(guān)系尚不能確定。因此，后續(xù)可以在大樣本量的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)多中心前瞻性研究，并在進(jìn)一步研究中收集可能影響腸道菌群的用藥史。

綜上所述，青少年T2DM 中MAFLD 患者與非MAFLD 患者的腸道菌群存在差異，表現(xiàn)為柔嫩梭菌和雙歧桿菌數(shù)量偏低，腸球菌和乳酸桿菌數(shù)量偏高。腸道菌群的變化和患者糖脂代謝、肥胖表型、炎癥水平密切相關(guān)。在排除了相關(guān)混雜因素以后，柔嫩梭菌和雙歧桿菌仍是青少年T2DM 發(fā)生MAFLD 的獨(dú)立保護(hù)因素。這提示調(diào)節(jié)相應(yīng)腸道菌群，將有助于青少年T2DM 人群中MAFLD 的防治。