李潔薇，池永清，吳鈿芳，朱陽春，丁楓華

（1. 浙江農(nóng)林大學(xué)，浙江 杭州 310000；2. 麗水學(xué)院，浙江 麗水 323000；3. 麗水市土肥植保能源總站，浙江 麗水 323000）

我國《全國土壤污染狀況調(diào)查公報(bào)》中顯示，全國土壤總點(diǎn)位超標(biāo)率為16.1%，其中鎘點(diǎn)位超標(biāo)率達(dá)7.0%，鉛點(diǎn)位超標(biāo)率有1.5%[1]。鎘、鉛是土壤環(huán)境中具潛在危害的污染物，常復(fù)合存在于土壤中，具高度持久性，半衰期超過20 a，已被納入中國重金屬污染防治規(guī)劃中[2-3]，所以研究如何高效經(jīng)濟(jì)地解決土壤鎘鉛污染問題具有重要意義。

植物修復(fù)作為一種環(huán)境友好型的土壤污染治理技術(shù)，因其成本低、適用面積廣、可大規(guī)模原位修復(fù)和無二次污染等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于實(shí)際中[4]，其中草本花卉因其生長(zhǎng)周期短、生物量大和具觀賞性等優(yōu)點(diǎn)成為植物修復(fù)研究的熱點(diǎn)[5-7]。賈永霞等[8]發(fā)現(xiàn)，百日草具有較強(qiáng)的抗鎘脅迫能力和富集能力；張小艾等[9]研究表明，二月蘭能耐輕度鉛脅迫；另外，波斯菊[10]、金魚草[11]和屈曲花[12]等草本花卉在鎘鉛脅迫下均有一定的耐性。

種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)是植物生命周期中對(duì)非生物脅迫最敏感的階段，此階段的植物種子防御機(jī)制尚未發(fā)育完全，易受脅迫影響發(fā)生機(jī)械損傷，導(dǎo)致植物無法正常生長(zhǎng)[13]。種子在重金屬脅迫下的抗性程度將直接影響植物修復(fù)的效果。目前有關(guān)草本花卉抗重金屬脅迫能力的研究主要集中于某一種花卉，鮮少對(duì)多種草本花卉種子耐性強(qiáng)弱進(jìn)行比較研究。因此，選取7 種常見草本花卉種子為試驗(yàn)材料，研究其在鎘鉛復(fù)合脅迫下的種子萌發(fā)特性和幼苗生長(zhǎng)情況，利用加權(quán)隸屬函數(shù)法對(duì)花卉種子抗脅迫能力進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，并對(duì)加權(quán)隸屬函數(shù)值進(jìn)行聚類分析，以期篩選出對(duì)重金屬耐性較強(qiáng)的草本花卉，為鎘鉛污染土壤的植物修復(fù)應(yīng)用提供科學(xué)參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試花卉（沐陽斗研種業(yè)有限公司）：千日紅、魯冰花、紫茉莉、二月蘭、百日草、波斯菊、金盞菊7種常見草本花卉種子，如表1 所示。供試藥品（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）：CdCl2·2.5H2O（分析純）、Pb（CH3COO）2·3H2O（分析純）。

表1 種子萌發(fā)試驗(yàn)的供試花卉Tab.1 Materials of seed germination experiment

1.2 試驗(yàn)方法

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果及相關(guān)研究[14]，首先，設(shè)置6 個(gè)鎘、鉛質(zhì)量濃度梯度，其中鎘質(zhì)量濃度分別為0、5、10、20、40、80 mg/L，鉛質(zhì)量濃度分別為0、50、250、500、1 000、2 000 mg/L，進(jìn)行鎘鉛復(fù)合脅迫，對(duì)照組（CK）用去離子水處理，如表2所示。

表2 草本花卉種子萌發(fā)試驗(yàn)鎘鉛復(fù)合脅迫處理Tab.2 Cd-Pb mass concentration setting for seed germination of herbaceous flowers

種子消毒：挑選大小一致、顆粒飽滿的種子，用0.1%HgCl2溶液消毒15 min，去離子水漂洗3～4次。

萌發(fā)試驗(yàn)：將消毒好的種子置于已滅菌的90 mm 規(guī)格的培養(yǎng)皿中（內(nèi)鋪2 層濾紙），每皿種子30粒，重復(fù)3次，分別加入不同質(zhì)量濃度重金屬溶液3 mL，之后置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（溫度25 ℃，光暗各12 h）。每天固定時(shí)間通過稱重法用去離子水補(bǔ)充蒸發(fā)的水分，以保持培養(yǎng)皿中的溶液體積不變，每隔24 h 記錄一次種子發(fā)芽數(shù)（以胚根露出種皮2 mm 作為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)）。參考田曉璇[15]的方法以連續(xù)3 d 種子發(fā)芽數(shù)不再增長(zhǎng)作為試驗(yàn)?zāi)┢诮Y(jié)束試驗(yàn)，結(jié)束當(dāng)天每個(gè)培養(yǎng)皿隨機(jī)挑選5個(gè)幼苗，測(cè)量根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)、干質(zhì)量。

1.3 種子萌發(fā)觀測(cè)指標(biāo)

根據(jù)種子發(fā)芽情況計(jì)算如下種子發(fā)芽指標(biāo)[16]：

式中：N0為發(fā)芽種子數(shù)；N1為發(fā)芽高峰期發(fā)芽數(shù)；N為各培養(yǎng)皿種子總數(shù)（30）；Gt為t天發(fā)芽數(shù)；Dt為相應(yīng)發(fā)芽天數(shù)；S為芽長(zhǎng)。另外，相對(duì)發(fā)芽指標(biāo)為各處理發(fā)芽指標(biāo)與對(duì)照發(fā)芽指標(biāo)的百分比。

1.4 鎘鉛耐性評(píng)價(jià)分析

利用加權(quán)隸屬函數(shù)法對(duì)7種草本花卉種子抗鎘鉛脅迫能力進(jìn)行分析。參考吳讓嘯等[17]的方法，以7 種花卉種子相對(duì)指標(biāo)（相對(duì)發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽勢(shì)、相對(duì)發(fā)芽指數(shù)、相對(duì)活力指數(shù)、相對(duì)干質(zhì)量、相對(duì)芽長(zhǎng)、相對(duì)根長(zhǎng)）為依據(jù)，計(jì)算不同鎘鉛濃度的隸屬函數(shù)值μ（Xij），進(jìn)而計(jì)算每種種子的加權(quán)隸屬函數(shù)值D。具體計(jì)算公式如下：

式中：i為各草本花卉；j為各相對(duì)指標(biāo)；Xij為某一草本花卉的某一指標(biāo)測(cè)定值；Xjmax和Xjmin分別為7種草本花卉中第j項(xiàng)指標(biāo)的最大值和最小值；μ（Xij）為各供試材料的各個(gè)指標(biāo)的隸屬函數(shù)值；-X j為7 種草本花卉第j項(xiàng)指標(biāo)平均值；Vj為第j項(xiàng)指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)差系數(shù)；Wj為第j項(xiàng)指標(biāo)權(quán)重；D為各草本花卉加權(quán)隸屬函數(shù)值。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Office Excel 2010 進(jìn)行初步分析建立數(shù)據(jù)庫，運(yùn)用SPSS 25.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鎘鉛復(fù)合脅迫對(duì)7種草本花卉種子萌發(fā)的影響

由表3 可知，不同花卉種子在不同鎘鉛質(zhì)量濃度脅迫下萌發(fā)情況不同，以魯冰花的發(fā)芽率最高，均在90%以上；二月蘭的發(fā)芽率最低，均在52%以下，且其在鎘鉛質(zhì)量濃度≥40 mg/L+1 000 mg/L 時(shí)受到嚴(yán)重抑制，發(fā)芽率顯著低于對(duì)照（P＜0.05）。千日紅各項(xiàng)發(fā)芽指標(biāo)隨著鎘鉛質(zhì)量濃度的升高呈下降趨勢(shì)，在高質(zhì)量濃度脅迫下受到顯著抑制（P＜0.05）；百日草、魯冰花和二月蘭的發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)隨著質(zhì)量濃度的升高呈先上升后下降趨勢(shì)，5 mg/L+50 mg/L 鎘鉛質(zhì)量濃度對(duì)其起促進(jìn)作用，值高于對(duì)照；波斯菊和金盞菊各項(xiàng)發(fā)芽指標(biāo)隨著鎘鉛質(zhì)量濃度的升高基本上呈先下降再上升后下降的變化趨勢(shì)，20 mg/L+500 mg/L 復(fù)合質(zhì)量濃度下，各項(xiàng)發(fā)芽指標(biāo)值達(dá)到最大。質(zhì)量濃度≥40 mg/L+1 000 mg/L 時(shí)，百日草各項(xiàng)發(fā)芽指標(biāo)均顯著低于對(duì)照（P＜0.05）；80 mg/L+2 000 mg/L 的鎘鉛脅迫下，7 種花卉種子的活力指數(shù)均顯著下降（P＜0.05），其中百日草、魯冰花的活力指數(shù)與對(duì)照相比分別下降了47.16、32.55。

表3 不同質(zhì)量濃度鎘鉛復(fù)合脅迫對(duì)7種草本花卉萌發(fā)期發(fā)芽指標(biāo)的影響Tab.3 Effects of different mass concentrations of Cd-Pb stress on germination indexes of seven species of herbaceous flowers during germination

續(xù)表3 不同質(zhì)量濃度鎘鉛復(fù)合脅迫對(duì)7種草本花卉萌發(fā)期發(fā)芽指標(biāo)的影響Tab.3（Continued） Effects of different mass concentrations of Cd-Pb stress on germination indexes of seven species of herbaceous flowers during germination

2.2 鎘鉛復(fù)合脅迫對(duì)7種草本花卉萌發(fā)期幼苗生長(zhǎng)的影響

鎘鉛脅迫下，不同的草本花卉幼苗干質(zhì)量所受影響程度不同（圖1）。金盞菊和魯冰花的干質(zhì)量隨著鎘鉛質(zhì)量濃度的升高而降低，其中金盞菊干質(zhì)量在10 mg/L+250 mg/L 質(zhì)量濃度下顯著低于對(duì)照（P＜0.05），質(zhì)量濃度越高，抑制越明顯。可見，鎘鉛脅迫對(duì)金盞菊和魯冰花幼苗影響較大，不利于其有機(jī)物質(zhì)的積累。千日紅的干質(zhì)量隨著鎘鉛質(zhì)量濃度的升高呈先上升后下降趨勢(shì)，這與種子萌發(fā)時(shí)各項(xiàng)發(fā)芽指標(biāo)變化趨勢(shì)不同，說明低質(zhì)量濃度（5 mg/L+50 mg/L）鎘鉛溶液可促進(jìn)其幼苗有機(jī)物質(zhì)積累，但不一定促進(jìn)種子萌發(fā)，其對(duì)鎘鉛質(zhì)量濃度敏感程度不同。鎘鉛質(zhì)量濃度為5 mg/L+50 mg/L 時(shí)，百日草的干質(zhì)量高于對(duì)照；質(zhì)量濃度為10 mg/L+250 mg/L時(shí)，紫茉莉的干質(zhì)量達(dá)到最大；質(zhì)量濃度為80 mg/L+2000 mg/L 時(shí)，7 種花卉幼苗的干質(zhì)量受到明顯抑制，顯著低于對(duì)照（P＜0.05），總體呈現(xiàn)出低促高抑效應(yīng)。

圖1 不同質(zhì)量濃度鎘鉛復(fù)合脅迫對(duì)7種草本花卉幼苗干質(zhì)量的影響Fig.1 Effects of different mass concentrations of Cd-Pb stress on dry weight of seven species of herbaceous flower seedlings

7 種花卉的幼苗生長(zhǎng)在不同質(zhì)量濃度鎘鉛脅迫下所受影響不同（圖2）。百日草、魯冰花、紫茉莉、金盞菊和二月蘭的幼苗芽長(zhǎng)總體隨著鎘鉛質(zhì)量濃度的增大而減小，其中魯冰花的芽長(zhǎng)在質(zhì)量濃度為20 mg/L+500 mg/L 時(shí)顯著低于對(duì)照（P＜0.05），受抑制作用明顯，百日草和二月蘭的芽長(zhǎng)在質(zhì)量濃度為40 mg/L+1 000 mg/L 時(shí)受到明顯抑制，低于對(duì)照（P＜0.05）。千日紅和波斯菊的芽長(zhǎng)在鎘鉛脅迫下，隨著其質(zhì)量濃度的升高，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，均在5 mg/L+50 mg/L 質(zhì)量濃度下達(dá)到最大值，可見此質(zhì)量濃度鎘鉛溶液對(duì)幼苗芽長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用。在鎘鉛80 mg/L+2 000 mg/L 復(fù)合脅迫下，7種花卉的幼苗芽長(zhǎng)均受到嚴(yán)重的抑制，顯著低于對(duì)照（P＜0.05）。

圖2 不同質(zhì)量濃度鎘鉛復(fù)合脅迫對(duì)7種草本花卉芽長(zhǎng)的影響Fig.2 Effects of different mass concentrations of Cd-Pb stress on shoot length of seven species of herbaceous flower seedlings

鎘鉛脅迫對(duì)7種花卉幼苗的根長(zhǎng)具明顯的影響（圖3），除千日紅和紫茉莉根長(zhǎng)分別在鎘鉛質(zhì)量濃度5 mg/L+50 mg/L 和10 mg/L+250 mg/L 下略大于對(duì)照外，其余5 種花卉根長(zhǎng)基本上隨著質(zhì)量濃度的增大而減小，低于對(duì)照。其中百日草和金盞菊根長(zhǎng)對(duì)鎘鉛溶液較為敏感，抗脅迫能力較差，在5 mg/L+50 mg/L 質(zhì)量濃度下即受到嚴(yán)重影響，顯著低于對(duì)照（P＜0.05）。鎘鉛質(zhì)量濃度為40 mg/L+1 000 mg/L時(shí)，7種花卉幼苗的根長(zhǎng)均受到明顯的抑制，顯著低于對(duì)照（P＜0.05）。鎘鉛質(zhì)量濃度為80 mg/L+2 000 mg/L時(shí)，除千日紅和紫茉莉外，其余5種花卉的根長(zhǎng)抑制率均達(dá)50%以上。從根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)的遞減幅度可以看出，鎘鉛脅迫對(duì)7 種花卉幼苗根長(zhǎng)的抑制作用明顯高于對(duì)芽長(zhǎng)的抑制作用。

圖3 不同質(zhì)量濃度鎘鉛復(fù)合脅迫對(duì)7種草本花卉根長(zhǎng)的影響Fig.3 Effects of different mass concentrations of Cd-Pb stress on root length of seven species of herbaceous flower seedlings

2.3 鎘鉛復(fù)合脅迫下7種草本花卉的綜合評(píng)價(jià)和聚類分析

采用加權(quán)隸屬函數(shù)法，利用性狀相對(duì)指標(biāo)進(jìn)行隸屬函數(shù)綜合評(píng)價(jià)，加權(quán)隸屬函數(shù)值越大，耐鎘鉛能力越強(qiáng)。由圖4 可知，7 種花卉種子耐鎘鉛脅迫能力表現(xiàn)為紫茉莉＞千日紅＞波斯菊＞魯冰花＞金盞菊＞百日草＞二月蘭。對(duì)7種草本花卉的加權(quán)隸屬函數(shù)值進(jìn)行聚類分析（圖5），在歐氏距離為10 時(shí)，可將7 種草本花卉種子劃分為耐鎘鉛型、中間型和敏感型3種類型，紫茉莉耐鎘鉛能力較強(qiáng)，千日紅、波斯菊和魯冰花耐鎘鉛能力中等，金盞菊、百日草和二月蘭耐鎘鉛能力較弱，較為敏感。

圖4 7種草本花卉種子隸屬函數(shù)綜合評(píng)價(jià)Fig.4 Comprehensive evaluation of membership function of seven species of herbaceous flower seedlings

圖5 7種草本花卉種子對(duì)鎘鉛脅迫耐性的聚類分析Fig.5 Cluster analysis of Cd-Pb resistance of seven species of herbaceous flower seedlings

3 結(jié)論與討論

植物種子對(duì)重金屬的耐性因重金屬屬性及植物種類、品種的不同而有所差異[8]。在本研究中，百日草、魯冰花和二月蘭的發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)隨著鎘鉛質(zhì)量濃度的升高呈先上升后下降趨勢(shì)，質(zhì)量濃度在5 mg/L+50 mg/L 時(shí)大于對(duì)照，這與BAE 等[18]對(duì)青蒿種子、查應(yīng)琴等[19]對(duì)雞冠花種子的研究結(jié)果相似?？梢姡唾|(zhì)量濃度的鎘鉛溶液對(duì)草本植物種子萌發(fā)有一定的促進(jìn)作用。波斯菊和金盞菊各項(xiàng)發(fā)芽指標(biāo)隨著鎘鉛質(zhì)量濃度的升高呈先下降再上升后下降的變化趨勢(shì)，雖與其余5 種草本花卉所呈現(xiàn)的變化趨勢(shì)不同，但與李瑞莉等[20]研究的假酸漿種子在鉛、鎘脅迫下的萌發(fā)特性變化趨勢(shì)結(jié)果一致。出現(xiàn)這種結(jié)果的原因可能與波斯菊、金盞菊種子自身內(nèi)部的激素調(diào)控機(jī)制和平衡關(guān)系有關(guān)[21-22]，說明波斯菊、金盞菊種子在萌發(fā)時(shí)對(duì)低質(zhì)量濃度鎘鉛脅迫較為敏感，在中低質(zhì)量濃度下耐性更好。

重金屬脅迫下，植物的種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)普遍存在低質(zhì)量濃度下的刺激效應(yīng)和高質(zhì)量濃度下的抑制效應(yīng)[17，23]。本研究中，千日紅的芽長(zhǎng)和干質(zhì)量在5 mg/L+50 mg/L 鎘鉛溶液下受到促進(jìn)作用，波斯菊的芽長(zhǎng)在此質(zhì)量濃度下也大于對(duì)照；在80 mg/L+2 000 mg/L鎘鉛脅迫下，7種草本花卉種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)均受到明顯抑制，這與羅巧玉等[24]、胡娜等[25]、李富榮等[26]研究結(jié)果相似。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是低質(zhì)量濃度的重金屬促進(jìn)了種子體內(nèi)活性氧物種（ROS）和活性氮物種（RNS）的產(chǎn)生，其中一氧化氮（NO）具促氧化劑和抗氧化劑功能，可適當(dāng)增強(qiáng)氧化應(yīng)激水平，刺激種子發(fā)芽，而ROS 信號(hào)可刺激細(xì)胞周期活動(dòng)，促使幼苗生長(zhǎng)[27]。高質(zhì)量濃度重金屬脅迫下，種子體內(nèi)的蛋白酶活性降低，貯藏蛋白的水解過程發(fā)生顯著破壞，釋放的游離氨基酸總量減少，導(dǎo)致胚軸生長(zhǎng)所必需的氮素供應(yīng)不足，幼苗生長(zhǎng)受到抑制[28]。

大量研究表明，重金屬脅迫下，種子萌發(fā)所受的影響要小于幼苗生長(zhǎng)的影響；相較于幼苗芽長(zhǎng)，幼苗根長(zhǎng)受抑制程度更高[29-30]。本試驗(yàn)中，7種草本花卉根長(zhǎng)在鎘鉛40 mg/L+1 000 mg/L 脅迫下均受到嚴(yán)重抑制，顯著低于對(duì)照的研究結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)。出現(xiàn)該現(xiàn)象可能是因?yàn)榉N子萌發(fā)初期以吸收水為主，萌發(fā)后期，重金屬進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)代替酶中的必需金屬，脂質(zhì)過氧化，幼苗生長(zhǎng)受阻，所以其所受影響大于種子萌發(fā)；而胚根首先接觸重金屬，受其脅迫時(shí)間更長(zhǎng)，且相較于芽，根對(duì)重金屬離子的吸收和積累能力更強(qiáng)，故而根抑制大于芽抑制[26，31]。

不同指標(biāo)反映不同的耐受能力，單一指標(biāo)難以全面準(zhǔn)確地反映花卉種子抗鎘鉛脅迫的能力，隸屬函數(shù)值平均法既可消除單個(gè)指標(biāo)的片面性，又使各草本花卉種子對(duì)鎘鉛的耐性差異具有可比性[32]。同時(shí)，使用相對(duì)值作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以減少各花卉的遺傳背景差異，使結(jié)果更具代表性[33]。因此，本研究采用加權(quán)隸屬函數(shù)法，利用性狀相對(duì)值進(jìn)行隸屬函數(shù)值綜合評(píng)價(jià)，以判斷7 種草本花卉種子在鎘鉛脅迫下的耐性強(qiáng)弱。并通過對(duì)加權(quán)隸屬函數(shù)值進(jìn)行聚類分析，將7種花卉種子劃分為耐鎘鉛型（紫茉莉）、中間型（千日紅、波斯菊、魯冰花）、敏感型（金盞菊、百日草、二月蘭）3種類型。