安義偉，梁慧慧，仲崇佳，孫迪虎，生嘉誠，張 震，李 浩，郭光輝

（1. 河南大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，河南 開封 475004；2. 河南大學(xué) 省部共建作物逆境適應(yīng)與改良國家重點實驗室，河南 開封 475004；3. 河南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 開封 475004）

植物基因工程是指將外源遺傳物質(zhì)通過多種方法導(dǎo)入受體植物細(xì)胞，并整合到受體基因組中，使之表達(dá)并穩(wěn)定遺傳，以改變植物的性狀表現(xiàn)。遺傳轉(zhuǎn)化是植物基因工程的關(guān)鍵步驟之一，自1984年首次利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功獲得轉(zhuǎn)基因煙草以來，植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)迅速發(fā)展，并在作物品質(zhì)改良和產(chǎn)量提升中得到廣泛運用[1]。目前，在植物中常用的遺傳轉(zhuǎn)化方法包括基因槍法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、花粉管通道法、超聲波介導(dǎo)法、PEG（聚乙二醇）介導(dǎo)法、顯微注射法等。這些轉(zhuǎn)化方法均有一定的缺陷，例如：常見的基因槍法轉(zhuǎn)化效率低、導(dǎo)入大片段困難、損傷受體細(xì)胞及成本高等[2]；農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化周期長、宿主局限性明顯、外源基因隨機(jī)整合等；而且，基因槍法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法一般需要經(jīng)過漫長的組織培養(yǎng)過程，對于組織培養(yǎng)困難的物種很難進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化；利用花粉管通道法轉(zhuǎn)化時有花期限制，需精準(zhǔn)掌握開花時間，轉(zhuǎn)化操作需要一定的經(jīng)驗，且操作難度大、工作效率低[3]；超聲波介導(dǎo)法會對受體材料造成一定損傷，轉(zhuǎn)化效率低，且外源基因插入的隨機(jī)性高[4]；PEG 介導(dǎo)法常應(yīng)用于植物原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化，但很難將轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體培養(yǎng)成完整植株，且培養(yǎng)周期長；顯微注射法的操作難度大，外源基因表達(dá)不穩(wěn)定。因此，有必要探索新的、更加快捷方便的遺傳轉(zhuǎn)化方法應(yīng)用于植物遺傳轉(zhuǎn)化。

20 世紀(jì)80 年代末，隨著納米技術(shù)的興起，納米材料以其特殊的表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)以及良好的生物學(xué)特性等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于基因工程、藥物研發(fā)及分子細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域[5]。2007 年，TORNEY 等[6]首次將納米基因載體應(yīng)用于植物遺傳轉(zhuǎn)化領(lǐng)域，其利用二氧化硅納米基因載體攜帶目的基因轉(zhuǎn)化煙草和玉米，成功將目的基因遞送到煙草、玉米細(xì)胞中，為植物基因工程開辟了新途徑。近年來，研究人員先后利用碳納米管[7]、DNA 納米結(jié)構(gòu)[8]和金納米簇[9]開發(fā)了不依賴于植物物種的、無需外力輔助的、高效的納米基因載體介導(dǎo)的外源遺傳物質(zhì)遞送系統(tǒng)，實現(xiàn)了GFP（綠色熒光蛋白）、GUS（β-葡萄糖苷酸酶）等報告基因和siRNA（小干擾RNA）等向植物細(xì)胞或特定細(xì)胞器的轉(zhuǎn)入。目前，納米基因載體已經(jīng)成功運用于煙草[6]、玉米[6，10]、擬南芥[11]、洋蔥[12]、棉花[13]、牡丹[14]和辣椒[15]等植物的遺傳轉(zhuǎn)化。主要闡述了納米基因載體的特征、分類，綜述了無機(jī)納米基因載體、天然高分子納米基因載體、人工合成高分子納米基因載體在植物遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用進(jìn)展，并對納米基因載體在植物遺傳轉(zhuǎn)化領(lǐng)域的應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

1 納米基因載體的特征及分類

納米材料是指在三維空間尺度中至少有一維處于納米尺寸或由它們作為基本單元構(gòu)成的材料，主要包括碳納米材料、金屬納米材料、金屬氧化物納米材料和聚合物納米材料[16]。納米材料因具備小尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)、生物兼容性、基本無毒等優(yōu)勢，已成為理想的微觀運輸載體[17]，在生物分子、營養(yǎng)物質(zhì)和農(nóng)藥等向植物的精準(zhǔn)運輸中發(fā)揮了重要作用[16]。納米基因載體是以納米微粒為基本單位、通過分子自組裝方法制備而成的[18]，具有體積小、穿透性強(qiáng)、可生物降解、無免疫原性、可保護(hù)外源生物大分子免受降解等優(yōu)點。對納米基因載體進(jìn)行表面修飾或改性后，可將核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子吸附在納米微粒表面或包埋于內(nèi)部，形成復(fù)合物，實現(xiàn)生物大分子向細(xì)胞內(nèi)的遞送[19]。

目前，應(yīng)用廣泛的納米基因載體可以分為3 種類型：無機(jī)納米基因載體、天然高分子納米基因載體、人工合成高分子納米基因載體（表1）。無機(jī)納米基因載體是一種粒徑在1～100 nm 的無機(jī)納米顆粒，具有尺寸小、種類多、易進(jìn)行功能化修飾、穩(wěn)定性好、可有效保護(hù)DNA 免受降解等優(yōu)點[20]。天然高分子納米基因載體是由天然的高分子如殼聚糖、淀粉等制成的，具有低毒性、生物相容性好、易生物降解等優(yōu)點[21]。人工合成高分子納米基因載體是由納米材料和有機(jī)高分子材料復(fù)合而成的新型納米材料，易于合成和制備，可規(guī)模化生產(chǎn)，易于進(jìn)行表面修飾[21]。

2 納米基因載體在植物遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用

2.1 無機(jī)納米基因載體在植物遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用

常用的無機(jī)納米基因載體主要有碳納米管、碳點、介孔二氧化硅納米顆粒、磁性納米顆粒和量子點等。

碳納米管是由單層或多層石墨烯片卷曲而成的中空無縫管狀結(jié)構(gòu)，可分為單壁碳納米管和多壁碳納米管[39]。LIU 等[24]首次發(fā)現(xiàn)單壁碳納米管-DNA 復(fù)合物可穿透煙草懸浮細(xì)胞的細(xì)胞壁并通過內(nèi)化作用進(jìn)入細(xì)胞，表明單壁碳納米管可用作向具有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞進(jìn)行基因運輸?shù)妮d體。天然碳納米管因其表面高度疏水而不具備水溶性，通過共價或非共價修飾對其表面進(jìn)行改性可提高其生物相容性和水溶性。利用PEG、聚乙烯亞胺、殼聚糖等修飾后的碳納米管可靜電吸附或包裹大量的生物大分子。KWAK等[22]利用殼聚糖修飾單壁碳納米管后，在無外力或化學(xué)助劑作用下，將YFP（黃色熒光蛋白）基因遞送到煙草、芝麻菜、菠菜等不同物種的葉綠體中，實現(xiàn)了YFP的瞬時表達(dá)。DEMIRER等[7]利用高縱橫比的碳納米管以高效率、無毒性、無機(jī)械輔助及無轉(zhuǎn)基因整合的方式將質(zhì)粒DNA 遞送到煙草、小麥和棉花等植物中，實現(xiàn)了外源基因的有效遞送和高水平的蛋白質(zhì)表達(dá)，隨后又利用單壁碳納米管經(jīng)靜電作用結(jié)合siRNA，通過葉片注射的方式將siRNA 遞送到完整的煙草葉片細(xì)胞內(nèi)，在RNA 水平上實現(xiàn)了高效的基因沉默，并且單壁碳納米管可以有效保護(hù)siRNA 不被細(xì)胞中核酸酶降解[23]。

碳點是一種由sp2、sp3雜化的碳核和各種表面官能團(tuán)組成的粒徑在10 nm 以下的新型發(fā)光納米材料[40]。碳點尺寸小，毒性低，易于功能化修飾，制備簡單，還具有良好的光穩(wěn)定性和優(yōu)異的生物相容性。因此，常作為載體用于基因、蛋白質(zhì)和藥物遞送，并且在生物成像、熒光標(biāo)記和生物傳感等研究中發(fā)揮重要作用[41]?；谔键c易被功能化修飾這一特性，DOYLE 等[25]利用碳點攜帶基因編輯載體在小麥中實現(xiàn)了快速便捷的瞬時基因編輯，該研究使用PEG 修飾碳點后裝載含有Cas9（CRISPR associated 9）和gRNA 的質(zhì)粒，形成碳點-質(zhì)粒復(fù)合物，通過直接噴灑葉片成功實現(xiàn)了對小麥SPO11（SPORULATION 11）基因的編輯。SCHWARTZ 等[26]利用攜帶沉默靶基因GFP的siRNA 的碳點，低壓噴灑煙草和番茄的葉片，使煙草和番茄中的GFP基因的表達(dá)被沉默。

介孔二氧化硅納米顆粒是硅氧化物納米顆粒的一種，具有穩(wěn)定的硅質(zhì)結(jié)構(gòu)和優(yōu)異的機(jī)械強(qiáng)度，且表面富含硅羥基易被修飾[42]。介孔二氧化硅納米顆粒既可以直接遞送遺傳物質(zhì)，也可以輔助其他遺傳物質(zhì)遞送方法（例如基因槍法），提高遺傳物質(zhì)的遞送效率。TORNEY 等[6]利用孔徑為3 nm 的蜂窩狀介孔二氧化硅納米顆粒裝載GFP基因轉(zhuǎn)化煙草，觀察到了GFP的瞬時表達(dá)，隨后又用金粉對介孔二氧化硅納米顆粒的孔道表面進(jìn)行覆蓋，并用基因槍轟擊介孔二氧化硅納米顆粒，成功將GFP基因遞送至玉米愈傷組織中。MARTIN-ORTIGOSA 等[27]通過多次電鍍的方法，用金粉修飾介孔二氧化硅納米顆粒表面，裝載質(zhì)粒后，用基因槍分別轟擊洋蔥表皮細(xì)胞、玉米細(xì)胞和煙草細(xì)胞，相比TORNEY 等[6]的方法，進(jìn)一步提高了轉(zhuǎn)化效率。隨后，MARTINORTIGOSA 等[28]再次利用金粉修飾的介孔二氧化硅納 米 顆 粒 裝 載 Cre（Cyclization recombination enzyme）蛋白遞送到在篩選標(biāo)記基因和報告基因兩側(cè)含有LoxP[Locus of X（cross）-over in P1]位點的轉(zhuǎn)基因玉米中，在Cre/LoxP 重組酶系統(tǒng)的作用下，切除了轉(zhuǎn)基因玉米中的篩選標(biāo)記基因，并可通過肉眼直接篩選無篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因玉米，該研究為獲得無篩選標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因及基因編輯植株提供了新思路。CHANG 等[29]利用介孔二氧化硅納米顆粒，在不借助任何機(jī)械外力的條件下，直接將紅色熒光蛋白基因mCherry遞送至擬南芥根系細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化效率高達(dá)46.5%。

磁性納米顆粒是一種含鐵、鈷、鎳等元素及其氧化物的納米級大小的顆粒，具有優(yōu)異的理化性質(zhì)，包括尺寸小、表面積大、低毒性和活性表面易功能化等[43]，可輔助其他遺傳轉(zhuǎn)化方法，如超聲波和電擊法等，將裝載外源物質(zhì)的磁性納米顆粒遞送到植物細(xì)胞中。王鳳華等[30]利用電擊法將裝載GFP基因的磁性納米顆粒成功遞送到水稻懸浮細(xì)胞中。同時，磁性納米顆粒還具有超順磁性和靶向性，在外加磁場的作用下，可將遺傳物質(zhì)定向遞送到植物特定的組織或細(xì)胞中。ZHAO 等[13]利用磁性納米顆粒Fe3O4作為載體，在外加磁場介導(dǎo)下將抗蟲基因Bt（Bacillus thuringiensis）與豇豆胰蛋白酶抑制劑基因CPTI（Cowpea trypsin inhibitor）的雙價基因BtΔα-CPTI輸送至棉花花粉內(nèi)部，將轉(zhuǎn)化后的花粉通過人工授粉直接獲得轉(zhuǎn)基因種子，再經(jīng)選育獲得穩(wěn)定遺傳的抗棉鈴蟲轉(zhuǎn)基因棉花后代，該方法將納米磁轉(zhuǎn)化和花粉介導(dǎo)法相結(jié)合，克服了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因方法中組織再生困難和寄主依賴性等瓶頸，提高了遺傳轉(zhuǎn)化效率，縮短了周期。賈艷晶等[14]利用磁性納米顆粒轉(zhuǎn)化牡丹花粉，發(fā)現(xiàn)磁性納米顆粒與其裝載的DNA 的質(zhì)量比合適時，可以保障納米顆粒與DNA穩(wěn)定結(jié)合，并且證明了花粉磁轉(zhuǎn)化過程對花粉損傷較小，經(jīng)磁轉(zhuǎn)化之后的牡丹花粉萌發(fā)率在50%以上，與未處理的花粉萌發(fā)率相當(dāng)。孫國勝等[15]通過將磁性納米顆粒和帶有Cas9的基因編輯載體質(zhì)粒結(jié)合，在磁場作用下轉(zhuǎn)化辣椒花粉，再經(jīng)人工授粉收獲辣椒種子，成功獲得了辣椒T0種子，經(jīng)鑒定轉(zhuǎn)化效率（63.70%）遠(yuǎn)高于常規(guī)的基因槍轉(zhuǎn)化法（4.2%），建立了辣椒可操作性強(qiáng)、轉(zhuǎn)化效率高、低成本的遺傳轉(zhuǎn)化體系。納米磁轉(zhuǎn)化和花粉介導(dǎo)法相結(jié)合的遺傳轉(zhuǎn)化方法有很多優(yōu)點，但該方法在植物中的普適性也存在疑問，如VEJLUPKOVA 等[44]通過花粉磁珠轉(zhuǎn)化法未能成功轉(zhuǎn)化單子葉植物玉米、高粱和百合。隨后經(jīng)過不斷探索，WANG 等[10]對玉米花粉進(jìn)行預(yù)處理，并將整個納米磁轉(zhuǎn)化過程在低溫條件下進(jìn)行，在保持花粉活力的前提下，大幅提高了玉米花粉萌發(fā)孔打開的效率，從而成功建立了磁納米顆粒介導(dǎo)的不依賴基因型的玉米遺傳轉(zhuǎn)化體系。

量子點是一種由Ⅱ—Ⅵ族（如CdSe、ZnS、CdS等）、Ⅲ—V 族（GaAs 和InAs 等）或者Ⅳ—Ⅵ族元素組成的新型半導(dǎo)體納米材料，此類納米材料具有量子尺寸效應(yīng)、良好的光穩(wěn)定性和熒光特性，并且易于進(jìn)行化學(xué)修飾[45]。在量子點納米顆粒表面修飾上能識別抗體、蛋白酶等生物分子的功能化基團(tuán)后，可以作為熒光探針用于標(biāo)記、追蹤活體細(xì)胞的活動及其動力學(xué)過程[45]，在量子點納米顆粒上裝載核酸后還可以用作植物轉(zhuǎn)基因載體。RAVINDRAN 等[46]利用ZnS/CdSe 量子點作為熒光探針標(biāo)記富含半胱氨酸的柱頭/花柱黏著素，發(fā)現(xiàn)花柱黏著素在植物受精過程中發(fā)揮重要作用，該研究首次將量子點應(yīng)用于植物發(fā)育過程的實時成像領(lǐng)域。董琛等[47]研究發(fā)現(xiàn)，在PEG 介導(dǎo)下，CdSe/ZnS 量子點可以經(jīng)細(xì)胞的液相胞吞作用進(jìn)入雜交鵝掌楸懸浮細(xì)胞內(nèi)，且不會影響細(xì)胞活性，該研究為將CdSe/ZnS 量子點納米材料用作植物轉(zhuǎn)基因載體奠定了基礎(chǔ)。FU 等[31]用多聚賴氨酸修飾的ZnS量子點裝載帶有GUS報告基因的質(zhì)粒后，在超聲波作用下，將GUS基因?qū)霟煵萑~片細(xì)胞中，并通過組織培養(yǎng)獲得了穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株。SANTANA 等[32]設(shè)計了包覆有β-環(huán)糊精的親水性量子點，由RbcS（Ribulose bisphosphate carboxylase small chain）引導(dǎo)肽識別葉綠體，定向地將化學(xué)物質(zhì)（甲基紫精和抗壞血酸）成功遞送到擬南芥葉綠體中，實現(xiàn)了外源物質(zhì)向植物細(xì)胞器的靶向遞送及對葉綠體氧化還原狀態(tài)的調(diào)控，并且基于量子點的熒光特性，還研究了該納米基因載體在植物體內(nèi)的靶向傳遞途徑。另外，研究發(fā)現(xiàn)，量子點對植物的生長會產(chǎn)生一些不良影響，比如高濃度碳量子點會導(dǎo)致小球藻細(xì)胞內(nèi)氧化損傷，從而抑制其生長[48]，但可通過表面修飾減輕甚至消除其細(xì)胞毒性[49]。因此，隨著對量子點納米材料的深入研究及其表面修飾技術(shù)的發(fā)展，憑借其熒光特性，量子點有望發(fā)展成為一種可視化的植物轉(zhuǎn)基因載體。

2.2 天然高分子納米基因載體在植物遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用

在植物遺傳轉(zhuǎn)化領(lǐng)域應(yīng)用較多的天然高分子納米基因載體主要有殼聚糖納米顆粒和淀粉納米顆粒。

殼聚糖是一種由天然多糖甲殼素脫乙?；笮纬傻亩嗵穷愇镔|(zhì)，可在生物體內(nèi)降解為二氧化碳和水，安全無毒。近年來，由殼聚糖制成的納米材料被應(yīng)用于植物遺傳物質(zhì)的遞送。宋瑜等[11]利用殼聚糖納米顆粒為載體，將GFP基因遞送到了擬南芥葉片原生質(zhì)體中。王鳳華等[12]利用交聯(lián)法制備了殼聚糖納米顆粒，整合含有GFP基因的質(zhì)粒后，利用基因槍法成功將GFP基因遞送到洋蔥表皮細(xì)胞中。但殼聚糖在生理條件下的穩(wěn)定性低，導(dǎo)致殼聚糖納米基因載體遞送遺傳物質(zhì)的效率比較低，通過特殊的化學(xué)修飾可以提高其穩(wěn)定性、特異性和在細(xì)胞內(nèi)逃避降解的能力。朱蘊(yùn)奇[50]制備了N，N，N-三甲基化殼聚糖，裝載質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化細(xì)胞，與未修飾的殼聚糖遞送組相比，轉(zhuǎn)化效率提高。殼聚糖還可以作為修飾劑修飾其他納米基因載體。KWAK等[22]利用殼聚糖-單壁碳納米管復(fù)合納米材料以葉片注射的方式成功地將外源遺傳物質(zhì)遞送到煙草、芝麻菜、菠菜等植物的葉綠體中，該研究為植物葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化提供了新思路。

淀粉納米顆粒是一種天然高分子納米材料，無毒、可生物降解，且具有良好的生物相容性。由淀粉制成的淀粉納米顆粒經(jīng)修飾后帶正電荷，可吸附帶負(fù)電荷的核酸分子，從而作為基因載體用于遺傳物質(zhì)的遞送。淀粉納米顆粒的尺寸一般較大，穿透植物細(xì)胞壁的能力較弱，在應(yīng)用過程中常需要額外的輔助與修飾。LIU 等[34]利用多聚賴氨酸修飾淀粉納米顆粒后，在超聲波介導(dǎo)下，將GFP基因成功遞送到了盾葉薯蕷懸浮細(xì)胞中。WANG等[51]將多聚賴氨酸修飾的磁性淀粉納米顆粒連接上異硫氰酸熒光素，制備出具有磁靶向性和熒光標(biāo)記的新型納米基因載體，既可用于研究納米基因載體進(jìn)入植物細(xì)胞的途徑，又可實現(xiàn)外源物質(zhì)向特定植物組織或細(xì)胞的靶向輸送?？踪毁籟33]分別利用多聚賴氨酸和水溶性量子點修飾淀粉納米基因載體，在超聲波介導(dǎo)下成功轉(zhuǎn)化了麻楓樹愈傷組織和懸浮細(xì)胞。但超聲波和基因槍等外力輔助會對外植體造成一定的損傷，后續(xù)可嘗試使用PEG 和殼聚糖等對淀粉納米顆粒進(jìn)行修飾以提高轉(zhuǎn)化效率[52]。

2.3 人工合成高分子納米基因載體在植物遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用

人工合成高分子納米材料主要包括樹枝狀聚合物納米顆粒和DNA納米結(jié)構(gòu)等。

樹枝狀聚合物是一種結(jié)構(gòu)清晰、高度分支化、單分散的納米級合成高分子材料，其細(xì)胞毒性低、理化性質(zhì)精準(zhǔn)可控，且具有良好的分散性和生物相容性，表面帶有大量可修飾的官能團(tuán)，是制備納米基因載體的良好模板[53]。常用的樹枝狀聚合物包括聚酰胺-胺型樹枝狀高分子聚合物、聚乙烯亞胺、聚丙烯亞胺和聚乙二胺。其中，聚酰胺-胺型樹枝狀高分子聚合物和聚乙烯亞胺應(yīng)用較多。

聚酰胺-胺型樹枝狀高分子聚合物納米顆粒外部親水、內(nèi)部疏水，可以通過分子間作用力與核酸、多肽和蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合[54]。PASUPATHY等[35]利用聚酰胺-胺型樹枝狀高分子聚合物納米顆粒經(jīng)靜電作用與帶有GFP基因的質(zhì)粒結(jié)合，成功將GFP基因遞送到草坪草的愈傷組織中，并且通過優(yōu)化緩沖液的pH 值以及聚酰胺-胺型樹枝狀高分子聚合物納米顆粒與質(zhì)粒DNA 混合的摩爾比等進(jìn)一步提高了轉(zhuǎn)化效率，最終轉(zhuǎn)化效率可達(dá)48.5%。

聚乙烯亞胺納米顆粒有較高的陽離子電荷密度，可通過靜電作用吸附帶負(fù)電荷的DNA，形成聚乙烯亞胺-DNA 復(fù)合物，是目前研究和利用最多的非病毒載體之一[55]。宋瑜等[11]和LI 等[36]先后利用聚乙烯亞胺納米顆粒與質(zhì)粒DNA 混合后轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體，成功將GFP基因遞送到了擬南芥原生質(zhì)體中，實現(xiàn)其瞬時表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)聚乙烯亞胺對質(zhì)粒DNA 有良好的保護(hù)作用。但聚乙烯亞胺納米顆粒很少單獨作為載體使用，常用作其他納米基因載體 的 修 飾 劑 。 DEMIRER 等[37]利 用 PEI（Polyethyleneimine）修飾單壁碳納米管后，在無外部輔助的情況下成功地將帶有GFP基因的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)運到煙草、芝麻菜、小麥和棉花中，實現(xiàn)了GFP基因的瞬時表達(dá)。

DNA 是由2 條脫氧核糖核苷酸鏈經(jīng)堿基互補(bǔ)配對形成的生物大分子，最初研究人員對DNA 的研究只圍繞DNA 如何攜帶、復(fù)制和傳遞遺傳物質(zhì)，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，SEEMAN 開創(chuàng)了DNA 納米技術(shù)這一全新領(lǐng)域[56]。KALLENBACH 等[57]對核酸序列進(jìn)行設(shè)計，使DNA 分子自組裝形成基本的構(gòu)建單元，再將這些構(gòu)建單元進(jìn)行自組裝，即無需人工雕琢和復(fù)雜設(shè)備的組裝，制備出了結(jié)構(gòu)和功能可控的納米組裝體，即DNA 納米結(jié)構(gòu)。DNA 納米結(jié)構(gòu)具有天然的生物相容性、無細(xì)胞毒性、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和良好的可編程性等優(yōu)點。ZHANG 等[8，38]制備了一系列不同結(jié)構(gòu)的DNA 分子后，裝載靶向GFP基因的siRNA，轉(zhuǎn)化煙草、芝麻菜和豆瓣菜等植物，發(fā)現(xiàn)DNA 納米結(jié)構(gòu)可以穿過植物細(xì)胞壁內(nèi)化到植物細(xì)胞中，在沒有外部輔助的情況下將siRNA 遞送到成熟的植物組織中，實現(xiàn)基因沉默；另外，還發(fā)現(xiàn)DNA納米結(jié)構(gòu)的大小、形狀、緊密性和硬度以及DNA 納米結(jié)構(gòu)和siRNA 的連接位點不僅會影響DNA 納米結(jié)構(gòu)向植物細(xì)胞的內(nèi)化過程，還影響基因沉默的效率和途徑。

3 展望

植物基因工程是定向改良植物遺傳性狀、實現(xiàn)作物精準(zhǔn)育種的有力手段，打破了傳統(tǒng)育種的瓶頸，實現(xiàn)產(chǎn)量與品質(zhì)的同步提升[58]。不同于動物細(xì)胞，植物細(xì)胞具有細(xì)胞壁這一天然屏障，且植物細(xì)胞壁僅允許直徑小于20 nm 的生物分子通過，阻礙了外源生物分子向植物細(xì)胞內(nèi)傳遞[59]，這也是植物基因工程技術(shù)落后于動物基因工程技術(shù)的主要原因之一。

外源遺傳物質(zhì)向植物細(xì)胞的順利遞送是實現(xiàn)植物遺傳轉(zhuǎn)化的首要步驟，而植物遺傳轉(zhuǎn)化缺乏一種能允許遞送不同生物分子進(jìn)入所有植物物種和組織，且不需要借助外力、不引起組織損傷的轉(zhuǎn)化方法。近年來，隨著納米生物技術(shù)的發(fā)展，植物遺傳轉(zhuǎn)化中的困難有望被解決。到目前為止，納米基因載體介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化已經(jīng)取得一定進(jìn)展，實現(xiàn)了煙草[6]、玉米[6，10]、擬南芥[11]、洋蔥[12]、棉花[13]、牡丹[14]和辣椒[15]等植物的遺傳轉(zhuǎn)化。因為納米材料介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化研究時間較短，目前還存在一些問題，例如：納米材料可能會對植物細(xì)胞產(chǎn)生毒性；納米基因載體介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化多以瞬時轉(zhuǎn)化為主，穩(wěn)定性較低，外源遺傳物質(zhì)經(jīng)常不能整合到基因組中等。因此，需要研究制備對植物細(xì)胞安全無害的納米材料，并優(yōu)化轉(zhuǎn)化方法。未來可嘗試將納米生物技術(shù)與其他學(xué)科相結(jié)合，制備可高通量使用、安全無害以及功能化的新型納米材料，并進(jìn)一步探究納米材料在植物細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運機(jī)制及發(fā)揮作用后的降解機(jī)制。同時可嘗試將納米生物技術(shù)與其他基因工程技術(shù)相結(jié)合，例如與基因編輯技術(shù)相結(jié)合，可以利用大多數(shù)納米基因載體的瞬時轉(zhuǎn)化特性，對植物的莖尖或根尖分生組織進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)化，完成對目標(biāo)基因的編輯，獲得穩(wěn)定遺傳、不含任何外源遺傳物質(zhì)的后代；可以將納米生物技術(shù)與其他常見轉(zhuǎn)化方法如農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍法相結(jié)合，農(nóng)桿菌和基因槍法介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化必須經(jīng)過愈傷組織再生過程，然而愈傷組織再生受基因型影響很大，可以利用納米基因載體的瞬時表達(dá)特性，在愈傷組織再生階段瞬時表達(dá)促進(jìn)組織分化的基因，提高愈傷組織再生能力，從而提高農(nóng)桿菌和基因槍法的轉(zhuǎn)化效率，且轉(zhuǎn)化后代不會攜帶組織分化基因?？傊?，利用納米基因載體對植物細(xì)胞壁的穿透性強(qiáng)這一優(yōu)點，經(jīng)注射、噴施及侵染等方式可以將遺傳物質(zhì)遞送至植物細(xì)胞中，完成對植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，未來隨著對納米材料理化特性和納米基因載體轉(zhuǎn)化機(jī)制的深入研究，可探索不依賴于植物組織培養(yǎng)的植物原位轉(zhuǎn)基因技術(shù)；并可利用特殊納米材料的磁靶向性，根據(jù)時空需要，實現(xiàn)對植物細(xì)胞、組織及器官的靶向轉(zhuǎn)化?？梢灶A(yù)見納米基因載體在植物遺傳轉(zhuǎn)化領(lǐng)域?qū)l(fā)揮更大的作用。