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        固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)嬰幼兒奶粉中的7種鏈格孢霉毒素

        2022-02-13 06:26:12邢家溧張子庚鄭睿行徐曉蓉毛玲燕
        色譜 2022年2期
        關(guān)鍵詞:孢霉鏈格小柱

        邢家溧, 張子庚, 鄭睿行*, 徐曉蓉, 毛玲燕, 承 海, 沈 堅(jiān)

        (1. 寧波市產(chǎn)品食品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院(寧波市纖維檢驗(yàn)所), 浙江 寧波 315048; 2. 中國計(jì)量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 浙江 杭州 310018)

        鏈格孢霉菌廣泛存在于泥土和各種農(nóng)作物里,是污染谷物、油籽與果蔬的一種極為常見的條件致病菌和腐生絲狀真菌[1]。由于該菌能在潮濕、低溫的環(huán)境下生長繁殖,環(huán)境適應(yīng)能力較強(qiáng),可以產(chǎn)生大量的次級(jí)代謝產(chǎn)物,這類代謝產(chǎn)物統(tǒng)稱鏈格孢霉毒素(Alternariatoxins,ATs),因此即使是冷藏運(yùn)輸?shù)霓r(nóng)產(chǎn)品也可能受到ATs的污染[2]?,F(xiàn)今已有諸多研究表明ATs對(duì)人與動(dòng)物均具有急慢性毒性以及三致效應(yīng)(致癌、致畸、致突變)等風(fēng)險(xiǎn)存在,對(duì)人畜的健康造成了損害。研究表明約有70余種ATs具有明顯毒性,歐洲食品安全局(European Food Safety Authority, EFSA)在2011年對(duì)ATs的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了細(xì)致的描述[3],此外在Georg等[4]的研究中可知,鏈格孢霉毒素由于結(jié)構(gòu)的不同,大體上可分為6種不同的類型:(1)二苯并吡喃酮類及其衍生物,主要毒素包括交鏈孢烯(altenuene, ALT)、交鏈格孢酚單甲醚(alternariol monomethyl ether, AME)和鏈格孢酚(alternariol, AOH); (2)四氨基酸衍生物類,代表毒素為細(xì)交鏈格孢菌酮酸(tenuazonic acid, TeA)和異細(xì)交鏈孢菌酮酸(iso-TeA); (3)二萘嵌苯醌類及其衍生物,包括交鏈孢毒素Ⅰ(altertoxin Ⅰ, ATX-Ⅰ)、ATX-Ⅱ、ATX-Ⅲ等一類衍生物毒素,是少數(shù)鏈格孢霉的代謝物;(4)丙三羧酸酯類化合物,是一系列長鏈氨基多元醇,即互隔交鏈孢霉(Alternaria alternata,AAL)毒素,又可分為AAL-TA、AAL-TB、AAL-TC、AAL-TD和AAL-TE幾大類,其中AAL-TA的毒性最強(qiáng);(5)包括騰毒素(tentoxin, Ten)在內(nèi)的環(huán)形四肽結(jié)構(gòu);(6)其他結(jié)構(gòu):細(xì)格菌素(altenusin, ALS)等。近年來,與ATs相關(guān)的食品安全事件時(shí)常發(fā)生[5],嬰幼兒是受全社會(huì)關(guān)注的一種特殊群體,而嬰幼兒奶粉是有益于嬰幼兒生長發(fā)育的首選食品。植物油在嬰幼兒奶粉中占比很高,又因其易被鏈格孢霉菌污染,因此對(duì)嬰幼兒的健康產(chǎn)生了威脅[6]。目前已報(bào)道的關(guān)于ATs檢測(cè)的主要基質(zhì)為柑橘[7]、番茄[8]、蘋果[9]、麥芯粉[10]、啤酒[11]、豌豆[12]、向日葵籽[13]等,且同時(shí)檢測(cè)的ATs種類也不超過6種,關(guān)于嬰幼兒奶粉中ATs的檢測(cè)方法相對(duì)較少,因此建立嬰幼兒奶粉中典型ATs的檢測(cè)方法具有重要的意義。

        目前我國有關(guān)ATs的標(biāo)準(zhǔn)只有1項(xiàng)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[14],并且該標(biāo)準(zhǔn)僅涉及4種ATs,應(yīng)用范圍只限于部分果蔬,尚不涵蓋嬰幼兒奶粉中ATs的檢測(cè)?,F(xiàn)有研究涉及的ATs的檢測(cè)技術(shù)主要有薄層色譜法[15]、酶聯(lián)免疫吸附法[16]、氣相色譜(GC)[17]以及氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)[18]、液相色譜(LC)[19]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[20]等。薄層色譜法靈敏度較低,實(shí)驗(yàn)操作繁瑣且重復(fù)性較差;GC和GC-MS/MS經(jīng)常用于分離和檢測(cè)易揮發(fā)和熱穩(wěn)定的毒素[21],因?yàn)锳Ts相對(duì)來說較為穩(wěn)定且揮發(fā)性較差,所以GC和GC-MS/MS在ATs檢測(cè)方面的應(yīng)用受到了限制;LC-MS/MS適用性非常廣泛,因?yàn)槠渫瑫r(shí)具備質(zhì)譜的高靈敏度與LC的高分離性,能夠?qū)Ts準(zhǔn)確地定量定性,可以補(bǔ)充LC技術(shù)的不足[22]。考慮到奶粉基質(zhì)組成十分復(fù)雜,不利于提取,所以選取固相萃取前處理技術(shù)凈化ATs,可以更有效地將干擾組分和分析物分離[23]?;诖?本研究擬開發(fā)一種固相萃取結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(UPLC-MS/MS)同時(shí)準(zhǔn)確檢測(cè)嬰幼兒奶粉中7種ATs的分析方法。

        1 實(shí)驗(yàn)部分

        1.1 材料與試劑

        從國內(nèi)各大企業(yè)和當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)收集了60份嬰幼兒奶粉樣本,其中一段(0~6月齡)、二段(6~12月齡)、三段(12~36月齡)各20份,密封,-20 ℃保存使用。

        ATs標(biāo)準(zhǔn)品:AOH、AME、ALT、Ten、TeA、ALS、ATX-Ⅰ,購自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司,純度均大于98%;甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純,購自德國Merck公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        ACQUITY UPLC I-CLASS超高效液相色譜-Waters XeVO TQ-XS串聯(lián)質(zhì)譜儀,配有電噴霧離子源(美國Waters公司); TGL-20M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司); Vortex 3自動(dòng)漩渦混合器(德國IKA公司); Milli-Q型超純水機(jī),電阻率為18.2 MΩ·cm(美國Millipore公司); KS-300EI超聲波清洗機(jī)(寧波科生設(shè)備有限公司); SW22振蕩水浴鍋(德國Julabo公司); AH-30全自動(dòng)均質(zhì)器(睿科儀器有限公司); 0.22 μm有機(jī)濾膜(北京捷盛依科科技有限公司); ME204E電子天平(實(shí)際分度值為0.000 1 g)和FE28 pH酸度計(jì)(上海梅特勒-托利多儀器有限公司); N-EVAP112氮吹儀(上海慶開實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司); HLB小柱6 mL(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)。

        1.3 UPLC-MS/MS條件

        色譜條件:BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm),柱溫為40 ℃;流動(dòng)相體系為(A)0.1%(v/v)甲酸水溶液和(B)乙腈;梯度洗脫程序:0~5.0 min, 10%B~95%B; 5.0~7.0 min, 95%B; 7.0~7.5 min, 95%~10%B; 7.5~10.0 min, 10%B。流速:0.4 mL/min;進(jìn)樣量:3 μL。

        質(zhì)譜條件:采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式對(duì)7種ATs進(jìn)行分析;數(shù)據(jù)采集和處理采用MassLynxTM4.2軟件完成;離子源參數(shù)為:正負(fù)離子開關(guān)掃描;毛細(xì)管電壓1.08 kV;射頻透鏡1(RF lens 1)和RF lens 2的電壓均為15.0 V;離子源溫度150 ℃;脫溶劑溫度600 ℃;脫溶劑氣體流量1 000 L/h;錐孔反吹氣流量150 L/h,其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

        1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

        標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:分別準(zhǔn)確稱量TeA、AME、AOH、Ten、ALT、ALS和ATX-Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)品0.001 g溶于10 mL乙腈中,配制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)混合液,取100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)混合液100 μL用乙腈溶解并定容至10 mL,得到1 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,密封后置于-20 ℃保存。

        標(biāo)準(zhǔn)工作液:用乙腈-水(1∶1, v/v)溶液將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋配制成0.5、1、2、5、10、20、50、100、200 μg/L的7種ATs的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

        基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液:用空白基質(zhì)溶液逐級(jí)稀釋1 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,制備成0.5、1、2、5、10、20、50、100與200 μg/L的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液。

        1.5 鏈格孢霉毒素的提取

        分別稱取奶粉1 g(精確到0.01 g)于50 mL尖底具塞離心管內(nèi),加入標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液50 μL,配制成待測(cè)奶粉樣品。加入15 mL乙腈-水(84∶16, v/v)溶液,加入0.3 mL甲酸,水平搖勻30 min,在9 500 r/min下離心10 min,取上清液,沉淀重復(fù)提取3次。最后一次提取時(shí)加入15 mL乙腈-甲醇-水(45∶10∶45, v/v/v)和0.3 mL甲酸,水平搖勻30 min, 9 500 r/min下離心10 min,多次提取的上清液混合后于40 ℃氮吹,之后重懸于12 mL一級(jí)水(pH 5.5)中。

        1.6 鏈格孢霉毒素的富集

        用HLB固相萃取小柱萃取,依次用6 mL甲醇和6 mL一級(jí)水(pH 5.5)活化,之后將待測(cè)液加入小柱中,調(diào)整固相萃取儀,確保水樣以1 mL/min的速度流過柱子,在上樣結(jié)束之前要確保整個(gè)過程小柱都不能干,用12 mL一級(jí)水淋洗小柱,淋洗結(jié)束后繼續(xù)負(fù)壓抽濾5 min左右,最后用10 mL甲醇洗脫,振蕩混勻1 min,取1 mL混勻液過0.22 μm有機(jī)濾膜,待測(cè)。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 儀器條件的優(yōu)化

        2.1.1色譜條件的優(yōu)化

        在實(shí)際測(cè)定過程中,色譜柱的選擇對(duì)目標(biāo)物的分離、識(shí)別與檢測(cè)十分重要,因?yàn)锽EH C18具有較低的次級(jí)相互作用,pH承受能力強(qiáng),柱效更高,峰形更好[24],因此采用BEH C18(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm)分離7種ATs。

        水-甲醇和水-乙腈都是UPLC-MS/MS常用的流動(dòng)相體系[25],而且甲酸和甲酸銨的引入一般可以增強(qiáng)靶向響應(yīng)并改善靶峰[26]。在我們之前的研究中,甲酸、乙腈被用作萃取劑,為了保持一致性,本實(shí)驗(yàn)采用了3種流動(dòng)相體系:水-乙腈、0.1%甲酸水溶液-乙腈、0.1%甲酸水溶液(含0.01 mol/L甲酸銨)-乙腈進(jìn)行了比較。結(jié)果表明,甲酸的引入增強(qiáng)了7種靶向ATs的反應(yīng);而甲酸銨的引入使靶向TeA的反應(yīng)減弱,并出現(xiàn)峰形拖尾,因此,選擇0.1%甲酸水溶液-乙腈作為流動(dòng)相體系。

        由于7種ATs極性的不同,而且極性相差較大,如ALT的極性特別強(qiáng),AME的極性相對(duì)很弱[20],為了兼顧7種毒素可以同時(shí)出現(xiàn)良好的峰形,流動(dòng)相需要有較大的梯度變化,本實(shí)驗(yàn)通過不斷調(diào)整,選取最佳的洗脫順序,可以同時(shí)獲得不同ATs的靈敏度和穩(wěn)定性。因?yàn)镋SI掃描檢測(cè)需要流動(dòng)相流速較低,所以設(shè)置流速為0.4 mL/min。7種ATs幾乎都在40 ℃左右穩(wěn)定[27],不會(huì)發(fā)生反應(yīng),因此,最終選取柱溫為40 ℃。

        結(jié)果顯示,優(yōu)化條件下各種ATs分離效果明顯,峰形較好(見圖1)。

        圖 1 優(yōu)化條件下(a)6種鏈格孢霉毒素的正離子圖和 (b)ATX-Ⅰ的負(fù)離子圖Fig. 1 (a) Positive ion chromatogram of six ATs and (b) negative ion chromatogram of ATX-Ⅰ under the optimized conditions 1. ALT; 2. ALS; 3. TeA; 4. AOH; 5. Ten; 6. AME; 7. ATX-Ⅰ.

        2.1.2質(zhì)譜條件的優(yōu)化

        因?yàn)槎喾磻?yīng)監(jiān)測(cè)模式可以相當(dāng)大程度地排除外界干擾,提高信噪比,有助于對(duì)目標(biāo)化合物的定量分析,所以本研究選取多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描,并對(duì)7種ATs在ESI+和ESI-模式掃描時(shí)進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)ATX-Ⅰ在ESI-模式掃描時(shí)響應(yīng)值較高,其他ATs在ESI+模式掃描時(shí)響應(yīng)值高,因此選取正負(fù)離子交替掃描。錐孔電壓、碰撞電壓、離子源溫度、脫溶劑氣體溫度、碰撞氣體流量和每種毒素的定性、定量離子通過流動(dòng)注射泵的連續(xù)進(jìn)樣進(jìn)行測(cè)定,優(yōu)化質(zhì)譜條件,達(dá)到每種靶物質(zhì)的最佳電離效率。分別用ESI+和ESI-模式對(duì)毒素進(jìn)行掃描,尋找響應(yīng)值較高的母體離子。進(jìn)一步改變碰撞電壓,進(jìn)行二次質(zhì)譜掃描,尋找信號(hào)強(qiáng)、穩(wěn)定性好的子離子。

        圖 2 (a)提取劑比例和(b)提取方式對(duì)嬰幼兒奶粉中7種 鏈格孢霉毒素回收率的影響(n=5)Fig. 2 Effects of (a) extractant ratio and (b) extraction method on the recoveries of the seven ATs in infant milk powder (n=5)

        2.2 提取溶劑比例的優(yōu)化

        由于嬰幼兒奶粉結(jié)構(gòu)復(fù)雜,相對(duì)來說難以處理,多次提取有利于增加ATs的回收率[28]。而且TeA的酸性和極性較強(qiáng),因此將提取劑酸化有利于提高TeA的提取率[29,30]。本研究根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[31]報(bào)道考察了前兩次提取劑,即乙腈-水(100∶0, 50∶50, 84∶16, v/v)溶液以及第三次提取中乙腈-甲醇-水(50∶25∶25, 45∶10∶45, v/v/v)溶液(加入甲醇是因?yàn)槠溆欣诒锦怉Ts的提取[32])。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2a所示,當(dāng)采用乙腈-水(50∶50, v/v)時(shí),提取液過于混濁,離心不成形,回收率過低;采用純乙腈提取時(shí),AOH和ALS的回收率相對(duì)較低,兩種毒素的回收率僅在50%左右,由此可知,水的體積比例不可過高或過低,適量水的加入會(huì)提高萃取效果;當(dāng)采用乙腈-水(84∶16, v/v)+乙腈-甲醇-水(45∶10∶45, v/v/v)時(shí),提取效果更好,回收率為80.2%~96.1%,可以看出甲醇比例高出一定范圍可能會(huì)影響ATs的回收。因此,選取乙腈-水(84∶16, v/v)+乙腈-甲醇-水(45∶10∶45, v/v/v)進(jìn)行提取。

        2.3 提取方式的優(yōu)化

        分別比較了均質(zhì)(12 000 r/min, 5 min)、渦旋振蕩(300 r/min, 30 min)、超聲波(40 ℃, 300 W, 30 min)和水平搖勻(40 ℃, 30 min)4種提取方式對(duì)7種ATs回收率的影響。如圖2b所示,使用均質(zhì)提取時(shí),TeA的回收率過低,僅為50.4%,這可能是因?yàn)閶胗變耗谭鄢珊隣?容易粘在均質(zhì)器頭上,造成基質(zhì)損失過大,進(jìn)而影響對(duì)ATs的提取;渦旋振蕩提取時(shí),回收率在62.5%~91.2%之間;超聲波提取時(shí),超聲時(shí)間短會(huì)導(dǎo)致提取ATs不充分,而超聲時(shí)間長又會(huì)導(dǎo)致奶粉樣品沉積在離心管底部,致使提取劑和樣品接觸不充分,造成個(gè)別毒素回收率較低,7種毒素的回收率范圍為63.1%~90.6%;而水平搖勻回收率好于其他3種提取方式,在79.1%~93.2%之間。Marina等[31]同樣采取水平搖勻的方法提取嬰幼兒食品中的ATs,提取效果較好,檢出限為0.05~1.25 μg/kg,加標(biāo)回收率為83%~108%。這可能是因?yàn)樵谒綋u勻過程中,基質(zhì)中的ATs不易被破壞。

        2.4 固相萃取條件的優(yōu)化

        優(yōu)化固相萃取條件時(shí),用標(biāo)準(zhǔn)溶液分別對(duì)固相萃取小柱和洗脫液條件進(jìn)行優(yōu)化,最后采用實(shí)際的基質(zhì)樣品萃取液進(jìn)行確證。取一定體積的ATs混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,用乙腈稀釋成50 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,用于對(duì)條件的優(yōu)化;在確證的基質(zhì)樣品中加入50 ng的ATs混合標(biāo)準(zhǔn),保持一致,對(duì)以下固相萃取條件進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化[33]。

        圖 3 不同固相萃取小柱對(duì)7種鏈格孢霉毒素 回收率的影響(n=5)Fig. 3 Effect of different SPE columns on the recoveries of the seven ATs (n=5)

        2.4.1固相萃取小柱的選擇

        對(duì)比了HLB小柱、C18小柱和PSA小柱的凈化效果,如圖3所示,PSA小柱對(duì)TeA凈化效果差,回收率僅為43.6%,推測(cè)原因是PSA填料可以去除有機(jī)酸[34]; HLB小柱效果略好于C18小柱,回收率在73.1%~92.8%之間,且HLB小柱適用性強(qiáng),在上樣過程中,小柱干涸不影響分離效果,易于操作[35,36]。因此選取HLB小柱進(jìn)行凈化。

        2.4.2洗脫液種類及用量的選擇

        根據(jù)文獻(xiàn)[33]得知,甲醇、乙腈、甲醇+乙腈洗脫小柱均在文獻(xiàn)中被提及。由此本研究分別選用10 mL甲醇、10 mL乙腈、5 mL甲醇+5 mL乙腈作為洗脫液(如圖4a),結(jié)果表明,測(cè)定后未發(fā)現(xiàn)明顯差異。但考慮到使用甲醇時(shí)ATs的回收率為76.8%~93.2%,效果略好于其他兩種洗脫液,所以選取甲醇洗脫HLB小柱??紤]到洗脫液的用量可能不足以將ATs完全洗脫出來,本研究分別選取了6、8、10和12 mL的甲醇洗脫液進(jìn)行比較,結(jié)果如圖4b所示,當(dāng)甲醇添加量為6~10 mL時(shí),7種ATs的回收率均呈現(xiàn)上升趨勢(shì);當(dāng)甲醇添加量為10 mL時(shí),7種ATs的回收率最好,在80.6%~92.2%之間;當(dāng)甲醇添加量為12 mL時(shí),7種ATs的回收率變化不大,說明甲醇洗脫幾乎已達(dá)到飽和。綜上所述,選取10 mL甲醇為洗脫液。

        圖 4 (a)洗脫液種類和(b)甲醇用量對(duì)嬰幼兒奶粉中7種 鏈格孢霉毒素回收率的影響(n=5)Fig. 4 Effects of (a) eluent type and (b) methanol dosage on the recoveries of the seven ATs in infant milk powder (n=5)

        圖 5 水的pH值對(duì)7種鏈格孢霉毒素回收率的影響(n=5)Fig. 5 Effect of water pH on the recoveries of the seven ATs (n=5)

        2.4.3提取后水的pH的優(yōu)化

        因?yàn)锳Ts需要酸化提取才會(huì)更加完全,但過度酸化會(huì)抑制回收率[8],所以本研究在3次萃取之后,針對(duì)氮吹復(fù)溶的樣品水溶液的pH(4、4.5、5、5.5、6)進(jìn)行了考察,如圖5所示,結(jié)果發(fā)現(xiàn)提取效果差異不是特別明顯,但是pH 5.5時(shí),ATs的回收率穩(wěn)定性相對(duì)較高,所以選取pH 5.5的水進(jìn)行復(fù)溶,回收率為78.9%~92.3%。同時(shí)為了與其保持一致,利于上樣時(shí)樣品更好的萃取保留,同樣選擇pH 5.5的水進(jìn)行活化。

        圖 6 是否復(fù)溶對(duì)奶粉中7種鏈格孢霉毒素回收率的影響(n=5)Fig. 6 Effect of redissolution on the recoveries of the seven ATs in milk powder (n=5)

        2.4.4濃縮條件的選擇

        實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),若洗脫之后在40 ℃氮吹后再次使用1 mL甲醇復(fù)溶,如圖6所示,AOH、AME回收率過低,僅為20%左右,可能這2種毒素在奶粉基質(zhì)中經(jīng)固相萃取后再氮吹復(fù)溶會(huì)導(dǎo)致毒素流失,影響回收率;而不復(fù)溶時(shí)7種ATs的回收率為77.4%~91.1%,即除AOH、AME外,其他毒素復(fù)溶與否無顯著性差異。因此選擇在經(jīng)10 mL甲醇洗脫之后不濃縮,即振蕩混勻后直接吸取1 mL洗脫液過0.22 μm濾膜后測(cè)定。

        2.5 方法評(píng)價(jià)

        2.5.1基質(zhì)效應(yīng)(ME)

        在UPLC-MS/MS分析中,洗脫化合物對(duì)電噴霧界面電離效率的影響表現(xiàn)為造成離子增強(qiáng)或抑制[37]。據(jù)報(bào)道,基質(zhì)效應(yīng)在UPLC-MS/MS方法分析ATs時(shí)很常見[38],通常通過比較標(biāo)準(zhǔn)溶液和相同濃度的陰性加標(biāo)樣品的響應(yīng)來研究。本實(shí)驗(yàn)為了檢測(cè)空白樣品基質(zhì)對(duì)目標(biāo)化合物的響應(yīng)值是否增強(qiáng)或抑制,分別用溶劑和基質(zhì)空白液配制7種ATs的標(biāo)準(zhǔn)混合液,質(zhì)量濃度為50 μg/L,并進(jìn)一步對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較。

        根據(jù)測(cè)定的7種ATs的回收率值,將ME值分為3組(低于80%、80%~120%和高于120%)。ME值在80%~120%之間為低基質(zhì)效應(yīng),可以忽略。當(dāng)ME值超過120%時(shí),說明存在基質(zhì)增強(qiáng)作用[39]。同時(shí),ME值低于80%說明存在基質(zhì)抑制作用。ME的計(jì)算公式如下[40]:

        其中:A1為毒素標(biāo)準(zhǔn)品在特定濃度的純?nèi)軇?初流動(dòng)相)中的平均峰面積;A2為基質(zhì)空白溶液中相同濃度每種毒素標(biāo)準(zhǔn)品的平均峰面積。

        表 2 鏈格孢霉毒素在嬰幼兒奶粉樣品基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Matrix effects (MEs) of the ATs in infant milk powder sample matrixes

        如表2所示,TeA的ME值在80%~100%之間,說明TeA的基質(zhì)作用較小;Ten和AOH的ME值低于80%,表現(xiàn)出基質(zhì)抑制效應(yīng)。相反AME、ALT、ALS和ATX-Ⅰ的ME值高于120%,表現(xiàn)出基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。根據(jù)表2所呈現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,本研究采用基質(zhì)匹配的方法對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行補(bǔ)償,最大程度上抵消基質(zhì)效應(yīng)的影響。

        2.5.2線性范圍與檢出限

        在線性關(guān)系研究中,所有標(biāo)準(zhǔn)工作溶液均在1.3節(jié)色譜-質(zhì)譜條件下測(cè)定。以x代表質(zhì)量濃度、y代表峰面積進(jìn)行線性回歸分析,用基質(zhì)空白標(biāo)準(zhǔn)工作溶液做校準(zhǔn)曲線。結(jié)果如表3所示,每種毒素在0.5~200 μg/L內(nèi)都有良好的線性關(guān)系,判定系數(shù)(R2)均大于0.990。以各目標(biāo)化合物信噪比(S/N)分別為3和10計(jì)算檢出限(LOD)和定量限(LOQ), 7種ATs的LOD為0.15~0.64 μg/kg,LOQ為0.54~2.24 μg/kg。

        表 3 嬰幼兒奶粉中7種鏈格孢霉毒素的線性范圍、線性方程、R2和檢出限和定量限Table 3 Linear ranges, linear equations, coefficients of determination (R2), LODs, and LOQs of the seven ATs in infant milk powder

        表 4 嬰幼兒奶粉中7種鏈格孢霉毒素的添加回收率和 精密度(n=5)Table 4 Recoveries and precisions of the seven Alternaria toxins spiked in infant milk powder (n=5)

        2.5.3樣品回收率和精密度結(jié)果分析

        按1.5節(jié)和1.6節(jié)的操作制備嬰幼兒奶粉樣品,參照GB/T 27404-2008[41],分別以1倍、2倍和10倍定量限進(jìn)行三水平加標(biāo)試驗(yàn),在一天內(nèi)每個(gè)添加濃度重復(fù)進(jìn)樣5次,測(cè)定樣品的回收率與精密度。結(jié)果如表4所示,7種ATs的平均回收率為79.1%~114.3%, RSD≤8.87%。

        2.5.4實(shí)際樣品的測(cè)定

        按照上述方法對(duì)實(shí)際嬰幼兒奶粉樣品(一段、二段、三段各20個(gè)樣品)進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明,未在一段(0~6月齡)和二段(6~12月齡)奶粉中檢測(cè)出真菌毒素;三段奶粉中只有1個(gè)樣品檢測(cè)出Ten,濃度為4.97 μg/kg。這是因?yàn)槟谭壑幸资芪廴镜闹参镉驼急容^小,所以奶粉受ATs的污染程度相對(duì)果蔬類產(chǎn)品和小麥類產(chǎn)品較小。而隨著嬰兒年齡的增長,其奶粉選用原料種類較多,被ATs污染的幾率也隨之升高。

        3 結(jié)論

        本文采用固相萃取技術(shù)富集嬰幼兒奶粉中7種ATs,并結(jié)合UPLC-MS/MS,定性定量測(cè)定嬰幼兒奶粉中的ATs,建立了一種高效檢測(cè)7種ATs的檢測(cè)方法。該方法操作簡便,高效靈敏,快速準(zhǔn)確,其檢出限、線性關(guān)系、回收率和重現(xiàn)性等方法學(xué)指標(biāo)均能滿足ATs的測(cè)定,可適用于實(shí)際樣品檢測(cè)。本研究開發(fā)的方法為檢測(cè)更多種類的ATs提供了技術(shù)支持,同時(shí)還為嬰幼兒奶粉中典型鏈格孢霉毒素安全限量標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供理論依據(jù),此外,本研究對(duì)于評(píng)估嬰幼兒奶粉的食品安全風(fēng)險(xiǎn)、保護(hù)嬰幼兒健康也具有十分重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

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