劉安平，卜晨琛，馬潔瓊，蘇媛，李維業(yè)，馬秀玲，任東海，楊增亮

(1.西寧市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，西寧 810000；2.青海省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院，西寧 810000；3.青海省中醫(yī)院，西寧 810000；4.青海省格爾木市藥品管理服務(wù)中心，格爾木 816099)

七味兔耳草散，藏藥名灑增屯巴，收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》(藏藥)第一冊(cè)1995年版[1]。處方由訶子、短穗兔耳草、熊膽粉、朱砂、姜黃、紅花、手參7味原藥材組成，功能與主治如下：補(bǔ)腎，澀精，用于“晶尼”病，腎虛引起的尿頻、遺尿、遺精等[2-3]。七味兔耳草散在各級(jí)藏族醫(yī)療機(jī)構(gòu)均有生產(chǎn)和使用。目前，質(zhì)量控制項(xiàng)目?jī)H有性狀和檢查，為了保證七味兔耳草散的質(zhì)量及安全性，筆者在本研究增加朱砂、姜黃、紅花、手參的顯微鑒別；增加短穗兔耳草、訶子、紅花、熊膽粉、姜黃的薄層色譜(TLC)鑒別；建立高效液相色譜(HPLC)法同時(shí)測(cè)定沒食子酸和木犀草素(短穗兔耳草)的含量[4-6]，報(bào)道如下。

1 材料

1.1儀器 Linomat 5全自動(dòng)薄層色譜點(diǎn)樣儀(CAMAG)，TLC Visualizer薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)(瑞士CAMAG)，超聲波清洗器B2500s-MT(上海必能信超聲波清洗儀有限公司)，VIC-212電子天平(德國(guó)賽多利斯公司，感量：0.01 g)、BSA224SCW電子天平(德國(guó)賽多利斯公司，感量：0.01 mg)，硅膠G薄層板(默克公司)，Agilent1260高效液相色譜儀(安捷倫科技公司)，Agilent ZORBAX SB色譜柱(4.6 mm×250 mm)，Milli-QA超純水器(美國(guó)Millipore公司)，Olympus BX53顯微鏡(日本奧林巴斯株式會(huì)社)。

1.2試藥 短穗兔耳草對(duì)照藥材(青海省藥檢院標(biāo)本館提供)；訶子對(duì)照藥材(批號(hào)：121015-201605)、紅花對(duì)照藥材(批號(hào)：120907-201713)、姜黃對(duì)照藥材(批號(hào)：121188-201605)、熊去氧膽酸對(duì)照品(批號(hào)：110755-202005，含量：99.0%)、沒食子酸對(duì)照品(批號(hào)：110831-201605)、木犀草素(批號(hào)：111520-202006，含量：94.4%)，均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。甲醇為色譜純，其余試劑為分析純。

1.3樣品 共收集七味兔耳草散樣品10批次，批號(hào)分別為：20190412，20190413，20190414，20190210，20190201，20180506，20180512，20180610，20180912，20180913，其來(lái)源均為青海省各級(jí)民族醫(yī)療機(jī)構(gòu)。

2 方法與結(jié)果

2.1顯微鑒別 取本品粉末少許，制片，置顯微鏡下觀察，朱砂：不規(guī)則細(xì)小顆粒暗棕紅色，有光澤，邊緣暗黑色；姜黃：薄壁細(xì)胞含油滴及紅棕色色素；紅花：花粉粒類圓形、橢圓形或橄欖形，直徑約60 μm，外壁有齒狀突起；手參：草酸鈣針晶散在或呈束存在于黏液細(xì)胞中，見圖1。

圖1 七味兔耳草散粉末顯微特征圖Fig.1 Microscopic characteristics of Qiwei Tuercao San

2.2薄層鑒別 分別以短穗兔耳草對(duì)照藥材、訶子對(duì)照藥材、紅花對(duì)照藥材、姜黃對(duì)照藥材、熊去氧膽酸對(duì)照品為對(duì)照，選用硅膠G薄層板進(jìn)行分離，建立5項(xiàng)薄層色譜鑒別指標(biāo)。

2.2.1訶子薄層鑒別 取樣品粉末2 g，加乙酸乙酯50 mL，超聲處理20 min，濾過(guò)，濾液濃縮至2 mL，作為供試品溶液；取訶子對(duì)照藥材0.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液；按處方制備缺訶子的陰性樣品，同法制成訶子陰性樣品溶液。吸取上述3種溶液各10 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-丙酮-甲酸(7：2：1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%三氯化鐵乙醇溶液，105 ℃加熱至斑顯色清晰，日光下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性無(wú)干擾。見圖2。

1.陰性(訶子)；2.訶子對(duì)照藥材；3-12.樣品。圖2 訶子的薄層色譜圖1.negative (Terminalia chebula)；2.reference of Terminalia chebula；3-12 .sample.Fig.2 TLC of Terminalia chebula

2.2.2短穗兔耳草薄層鑒別 取樣品粉末2 g，加乙醇50 mL，加熱回流40 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)訜崴?0 mL使溶解，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次25 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液；取短穗兔耳草對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液；取木犀草素對(duì)照品適量，加甲醇制成每毫升含木犀草素0.5 mg的對(duì)照品溶液；按處方制備缺短穗兔耳草的陰性樣品，同法制成短穗兔耳草陰性樣品溶液。吸取上述4種溶液各10 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(30～60 ℃)-乙酸乙酯-甲酸(7：2.5：0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑顯色清晰，分別置日光及紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥品和對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上，分別顯相同顏色的斑點(diǎn)或熒光斑點(diǎn)，且陰性無(wú)干擾。見圖3。

A.日光下檢視；B.紫外光燈(365 nm)；1.木犀草素；2-3.短穗兔耳草對(duì)照藥材；4-5.陰性樣品；6-10.樣品。圖3 短穗兔耳草的薄層色譜圖A.inspection in daylight B.inspection under ultraviolet lamp (365 nm)；1.luteolin；2-3. reference of Lagotis brachystachya；4-5.negative sample；6-10.sample.Fig.3 TLC of Lagotis brachystachya

2.2.3熊膽粉薄層鑒別 取樣品粉末2 g，加乙醇10 mL超聲處理10 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)?0%氫氧化鈉溶液10 mL，加熱回流2 h，放冷，滴加鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2～3，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次10 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)右掖? mL溶解，作為供試品溶液；取熊去氧膽酸對(duì)照品，加乙醇制成每毫升含0.5 mg的對(duì)照品溶液；按處方制備缺熊膽粉的陰性樣品，同法制成熊膽粉陰性樣品溶液。吸取供試品溶液、陰性溶液各10 μL，對(duì)照品溶液5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以異辛烷-乙醚-正丁醇-冰醋酸-水(10：5：3：5：1)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑顯色清晰，分別置日光及紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)或熒光斑點(diǎn)，且陰性無(wú)干擾。見圖4。

A.日光下檢視；B.紫外光燈(365nm)；1.熊去氧膽酸對(duì)照品；2.陰性(熊膽粉)；3-12.樣品。圖4 熊膽粉的薄層色譜圖A.inspection in daylight；B.inspection under ultraviolet lamp (365 nm)；1.reference substance of ursodeoxycholic acid；2.negative (Bear bile powder)；3-12.sample.Fig.4 TLC of Bear bile powder

2.2.4姜黃薄層鑒別 取樣品粉末1 g，加無(wú)水乙醇10 mL，超聲處理20 min，濾過(guò)，濾液濃縮至2 mL，作為供試品溶液；取姜黃對(duì)照藥材0.2 g，同法制成對(duì)照藥材溶液；按處方制備缺姜黃的陰性樣品，同法制成姜黃陰性樣品溶液。吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸(96：4：0.6)為展開劑，展開，取出，晾干，分別置日光和紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，分別顯相同顏色的斑點(diǎn)或熒光斑點(diǎn)，且陰性無(wú)干擾。見圖5。

1.陰性(姜黃)；2.姜黃對(duì)照藥材；3-12.樣品。圖5 姜黃的薄層色譜圖1.negative (Curcumae longae rhizoma)；2.reference of Curcumae longae rhizome；3-12.sample.Fig.5 TLC of Curcumae longae rhizome

2.3含量測(cè)定

2.2.5紅花薄層鑒別 取樣品粉末2 g，加80%丙酮15 mL，超聲處理10 min，濾過(guò)，濾液濃縮至5 mL，作為供試品溶液；取紅花對(duì)照藥材0.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液；按處方制備缺紅花的陰性樣品，同法制成紅花陰性樣品溶液；吸取上述三種溶液各10 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水(6：1：1)為展開劑，展開，取出，晾干，放至斑點(diǎn)顯色清晰，日光下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性無(wú)干擾。見圖6。

1.陰性(紅花)；2.紅花對(duì)照藥材；3-12.樣品。圖6 紅花的薄層色譜圖1.negative (Carthami flos)；2.reference of Carthami flos；3-12.sample.Fig.6 TLC of Carthami flos

2.3.1色譜條件及系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇為流動(dòng)相A，0.3%磷酸為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫(0～13 min，A：3%，B：97%；>13～20 min，A：3%→40%，B：97%→60%；>20～40 min，A：55%，B：45%)；流率為1.0 mL·min-1；沒食子酸檢測(cè)波長(zhǎng)為273 nm，木犀草素檢測(cè)波長(zhǎng)為350 nm。理論板數(shù)按沒食子酸計(jì)不得低于2000。見圖7。

A.對(duì)照品；B.樣品；C.陰性(訶子)； D.陰性(短穗兔耳草)；1.沒食子酸(273 nm)；2.木犀草素(350 nm)。圖7 七味兔耳草散HPLC圖A.reference substances ；B.sample； C.:negative(Chebulae fructus)；D.:negative(Lagotis brachystachya Maxim)；1.gallic acid(273 nm)；2.luteolin(350 nm).Fig.7 HPLC chromatograms of Qiwei Tuercao San

2.3.2對(duì)照品溶液的制備 取沒食子酸對(duì)照品適量，加50%甲醇制成每毫升含沒食子酸30.78 μg的對(duì)照品溶液；取木犀草素對(duì)照品適量，加甲醇制成每毫升含木犀草素10.47 μg的對(duì)照品溶液。

2.3.3供試品溶液的制備 取七味兔耳草散約1.2 g，精密稱定，置具塞錐瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲(功率250 W，頻率35 kHz)處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4線性關(guān)系考察 配制木犀草素對(duì)照品溶液為98.98 μg·mL-1，沒食子酸對(duì)照品溶液為1.001 3 μg·mL-1。分別吸取2，5，8，12，20 μL，按“2.3.1”項(xiàng)條件分別注入色譜儀測(cè)定，以進(jìn)樣量對(duì)峰面積進(jìn)行回歸。沒食子酸回歸方程Y=97 576X+6.424，r=0.999 6，沒食子酸在0.002 023～0.020 23 μg的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；木犀草素回歸方程Y=8 248X+136.0，r=0.999 6，木犀草素在0.197～1.97 μg的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.5精密度考察 取“2.3.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣5次，進(jìn)樣量10 μL，沒食子酸、木犀草素峰面積RSD值分別為0.05%，0.09%，表明本方法精密度良好。

2.3.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取“2.3.3”項(xiàng)下供試品溶液(批號(hào)：20190412)，分別在0，4，8，12，24 h進(jìn)樣，進(jìn)樣量10 μL，沒食子酸、木犀草素峰面積的 RSD值分別為0.9%，0.7%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.7重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取“2.3.3”項(xiàng)下供試品溶液(批號(hào)：20190412)5份，進(jìn)樣量10 μL，并分別計(jì)算出沒食子酸、木犀草素的含量，RSD值均<2%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.8加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取七味兔耳草散樣品(批號(hào)：20190413)6份，每份取0.6 g，精密稱定，置具塞容量瓶中，然后分別在每份樣品中精密加入0.035 8 mg·mL-1木犀草素對(duì)照品溶液1 mL、0.401 7 mg·mL-1沒食子酸對(duì)照品溶液1 mL，加入 50%甲醇定容至刻度，稱定質(zhì)量，超聲(功率250 W，頻率35 kHz)處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，取續(xù)濾液，即得。按“2.3.3”項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算加樣加收率，結(jié)果見表2。

表2 七味兔耳草散的加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of recovery test of Qiwei Tuercao San

2.4樣品含量測(cè)定 取七味兔耳草散的樣品10 批，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含有量，結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果Tab.3 Content determination results of samples mg·g-1

3 討論

藏藥中有許多地方習(xí)慣用藥，所以會(huì)存在基源差異的問(wèn)題，而七味兔耳草散處方中各原料藥材基源準(zhǔn)確，無(wú)爭(zhēng)議。各原料藥材的法定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載情況、藥材基原和用藥部位如下。①訶子、朱砂、姜黃、紅花收載于《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版一部，訶子為使君子科植物訶子TerminaliachebulaRetz.或絨毛訶子TerminaliachebulaRetz.var.tomentella Kurt.的干燥成熟果實(shí)[6]；朱砂為硫化物類礦物辰砂族辰砂，主含硫化汞(HgS)[6]；姜黃為姜科植物CurcumaLonga L.的干燥根莖[6]；紅花為菊科植物紅花Carthamustinctorius L.的干燥花[6]。②短穗兔耳草收載于《青海藏藥標(biāo)準(zhǔn)》1992 年版，為玄參科植物短穗兔耳草LagotisbrachystachyaMaxim.的干燥全草[7]。③熊膽粉收載于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部部標(biāo)準(zhǔn)》新藥轉(zhuǎn)正第十一冊(cè)，為熊科動(dòng)物黑熊SelenaretosthibetanusCuvier 膽囊手術(shù)引流膽汁而得的干燥品[8]。④手參收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》1995 年版(藏藥第一冊(cè))，為蘭科植物手參Gymnadeniaconopsea(L.)R.Br.的干燥塊莖[1]。

筆者在本研究將七味兔耳草散中七味藥材全部進(jìn)行質(zhì)量研究，可保障七味兔耳草散制劑的投料準(zhǔn)確，對(duì)此藥研究尚屬首次。新增朱砂、姜黃、紅花、手參的顯微定性特征鑒別法，因其四味藥中顯微特征明顯；新建立短穗兔耳草、訶子、紅花、熊膽粉、姜黃的TLC定性鑒別法，鑒別特征明顯、可行性良好、易操作、保障七味兔耳草散的質(zhì)量安全。

在方法的選擇和優(yōu)化中，針對(duì)短穗兔耳草，本研究將訶子和短穗兔耳草的含量測(cè)定建立在一個(gè)HPLC系統(tǒng)中，采用雙波長(zhǎng)來(lái)分別測(cè)定沒食子酸和木犀草素的含量，既方便快捷又經(jīng)濟(jì)環(huán)保。結(jié)果顯示，沒食子酸的含量在0.56～0.66 mg·g-1，木犀草素含量在0.05～0.07 mg·g-1，不同醫(yī)療機(jī)構(gòu)間的樣品存在一定的差異。