吳樂，武強，陳勇

[泰康同濟(武漢)醫(yī)院1.神經(jīng)內(nèi)科；2.急診醫(yī)學(xué)科，武漢 430050]

缺血性腦卒中是導(dǎo)致人類死亡的第二大疾病，也是導(dǎo)致終身殘疾的首要原因[1]。早期恢復(fù)腦血流再灌注是治療缺血性腦卒中的重要方法，但可能導(dǎo)致缺血-再灌注(ischemia/ reperfusion，I/R)損傷，進(jìn)一步加重腦損傷。炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致腦I/R損傷的重要因素，而神經(jīng)炎癥與繼發(fā)性神經(jīng)元死亡密切相關(guān)。細(xì)胞質(zhì)炎性體復(fù)合物激活被認(rèn)為是神經(jīng)炎癥的必要步驟，也是神經(jīng)元焦亡的一個重要觸發(fā)因素[2]。筆者以往的研究表明，脂氧素A4(lipoxin A4，LXA4)抑制核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3(NOD like receptor protein 3，NLRP3)炎性體可能是其抗I/R損傷的機制之一[3]。NLRP3炎性體是激活天冬氨酸蛋白水解酶1(cysteinyl aspartate-specific proteases 1，Caspase-1)的分子平臺，當(dāng)內(nèi)源性或外源性因素激活NLRP3炎性體后，細(xì)胞內(nèi)招募無活性的半胱天冬氨酸蛋白酶-1前體(protease cysteine aspartate-specific protease-1，pro-caspase-1)，無活性的pro-caspase-1酶原水解，產(chǎn)生p20和p10兩個亞基，組合成四聚體，最終形成有活性的Caspase-1[4]。因此，筆者在本研究擬觀察LXA4對大鼠大腦中動脈閉塞再灌注(middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R)模型缺血腦皮層周邊區(qū)Caspase-1活性的影響，進(jìn)一步探討LXA4抗腦I/R損傷的機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 清潔級健康SD雄性大鼠24只，體質(zhì)量250～280 g，購自華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物學(xué)部，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(鄂)2010-0007。適應(yīng)性喂養(yǎng) 7 d，飼養(yǎng)溫度(20±2)℃，相對濕度(50±10)%，實驗前動物禁食 12 h，自由飲水。

1.2試劑及試劑盒 LXA4(美國Cayman Chemical公司，批號：90410)，2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC，美國Sigma公司，批號：T8877)，兔抗Caspase-1 p20(德國Merck Millipore公司，批號：ZRB1233)，二抗(羊抗兔和羊抗鼠)(武漢Boster公司，批號：BA1056)，Caspase-1活性檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：C1102)，大鼠白細(xì)胞介素1β(IL-1β)和大鼠IL-18酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(伊萊瑞特生物科技有限公司，批號分別為E-EL-R0012c，E-EL-R0567c)。

1.3實驗分組、造模及給藥 雄性大鼠24只，按數(shù)字隨機分為假手術(shù)組、模型對照組、LXA4組，每組8只。假手術(shù)組：假手術(shù)大鼠側(cè)腦室注射0.9%氯化鈉溶液5 μL；模型對照組：大鼠接受2 h的MCAO和24 h再灌注，并側(cè)腦室注射0.9%氯化鈉溶液5 μL；LXA4組，大鼠接受2 h的MCAO和24 h再灌注，并側(cè)腦室注射LXA4(0.2 mmol·L-1)5 μL，劑量參照SOBRADO等[5]研究。MCAO手術(shù)操作依據(jù)LONGA等[6]方法，缺血2 h后小心拔出栓線約10 mm，即形成再灌注，保持再灌注24 h。手術(shù)過程、缺血期及再灌注后2 h體溫保持在(37.0±0.5) ℃。大鼠麻醉清醒后出現(xiàn)左側(cè)肢體肌力下降并屈曲，站立不穩(wěn)，提尾時向一側(cè)轉(zhuǎn)圈或行走時向左側(cè)轉(zhuǎn)圈為模型成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)。假手術(shù)組大鼠只是不插入魚線，其余步驟同模型組。MCAO操作完成后立即進(jìn)行側(cè)腦室注射，采用江灣Ⅱ型立體定位儀，以前囪為基點，按照坐標(biāo)調(diào)整位置(前后0.8 mm，側(cè)方1.5 mm，背腹3.8 mm)。并用牙鉆鉆開顱骨，進(jìn)行側(cè)腦室注射，深4.5 mm，注射速度2 μL·min-1，注射完畢后留針1～2 min。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.1檢測大鼠腦梗死體積 采用TTC染色法檢測各組大鼠腦梗死體積，大鼠缺血再灌注24 h后，給予10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，處死并取腦，將新鮮腦組織置于-20 ℃冰箱中冷凍15 min。大腦以額極與視交叉連線中點處為起點，切5片腦組織，厚度為2 mm。將腦組織切片置于2%TTC溶液避光，放入37 ℃溫箱30 min。然后將腦組織切片置入10%甲醛溶液浸泡過夜。剩余腦組織繼續(xù)切片，取梗死側(cè)缺血腦組織，-70 ℃冰箱中冷凍，生化實驗備用。數(shù)碼相機攝像，圖像分析軟件(Image J software，NIH Image，Version 1.61，Bethesda，USA)計算腦梗死灶面積，依據(jù)公式計算腦梗死灶體積。為了排除腦水腫的干擾作用，校正的腦梗死灶面積計算公式如下：校正的腦梗死灶面積=測量梗死面積×{1-[(同側(cè)半球面積-對側(cè)半球面積)/對側(cè)半球]}。根據(jù)公式V=t(A1+…An)-t(A1+…An)/2計算梗死體積，t為切片厚度，A為梗死面積[7]。

1.4.2檢測大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分 大鼠神經(jīng)功能評分以HUNTER等[8]5分制法進(jìn)行評分。具體標(biāo)準(zhǔn)如下，0分：無神經(jīng)損傷癥狀；1分：不能完全伸展對側(cè)前爪；2分：提起尾巴時，對側(cè)前爪握力下降；3分：自發(fā)性旋轉(zhuǎn)及向?qū)?cè)傾倒；4分：沒有自發(fā)運動活動；5分：對刺激無反應(yīng)。神經(jīng)功能評分越高，表明大鼠神經(jīng)損傷越嚴(yán)重。

1.4.3檢測大鼠缺血腦皮層Caspase-1 p20的蛋白水平 采用Western blotting免疫印跡法檢測各組Caspase-1 p20的蛋白水平，取少量缺血腦皮層，稱定質(zhì)量，置于勻漿器中，并加入1：100的體積比PMSF，按1 mg腦組織/9 μL勻漿液的比例加入勻漿器開始勻漿，勻漿完畢后將其移入1.5 mL EP管中，冰上靜置30 min裂解。于4 ℃下20 000×g離心20 min，收集上清液，按照體積比為1：5加入上樣緩沖液，置于100 ℃沸水煮10 min，使蛋白變性，并用BCA蛋白定量法測定各組蛋白濃度，計算上樣量，保持各組上樣蛋白質(zhì)量的一致。進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)凝膠電泳，100V恒壓轉(zhuǎn)膜1.5 h，轉(zhuǎn)膜后的NC膜用50 g·L-1脫脂奶粉緩沖封閉液封閉1 h，加一抗4 ℃孵育過夜，一抗為兔抗Caspase-1 p20(1：200)，鼠抗β-actin(1：400)。之后洗膜15 min×3，二抗37 ℃孵育1 h，二抗為辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔，羊抗鼠(1：10 000)。然后洗膜15 min×3，洗去未結(jié)合的二抗，用增強化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)洗片，暗室曝光膠片。測定條帶反應(yīng)灰度值，以β-actin為內(nèi)參計算相對值，每組實驗重復(fù)6次進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.4.4檢測大鼠缺血腦皮層Caspase-1活性 腦組織勻漿同“1.4.3”項，然后把勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5 mL EP管中，冰浴再裂解5 min。于4 ℃下20 000×g離心10～15 min，把上清液轉(zhuǎn)移到冰浴預(yù)冷的離心管中，立即測定Caspase-1的酶活性。按照試劑盒步驟操作，一個酶活力單位定義為當(dāng)?shù)孜镲柡蜁r，在37 ℃可以剪切1nmol Ac-YVAD-pNA產(chǎn)生1 nmol pNA的caspase-1的酶量。按公式計算Caspase-1活力：

Caspase-1活力=pNA濃度×反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)÷待測樣本蛋白濃度。

1.4.5檢測大鼠缺血腦皮層IL-1β和IL-18 采用ELISA法檢測各組大鼠缺血腦皮層IL-1β和IL-18。腦組織勻漿同“1.4.3”項，取上清液，按照試劑盒步驟操作，用酶標(biāo)儀在450 nm波長測量各孔吸光度(A值)，由標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與A值計算出直線回歸方程式，將樣品的A值代入方程式，計算出樣品濃度。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠腦梗死體積及神經(jīng)功能評分的比較 大鼠梗死面積見圖1。 圖1中白色腦組織為缺血病灶，紅色腦組織為正常腦組織。模型對照組大鼠腦缺血非常明顯，LXA4組腦梗死灶體積顯著縮小，與模型對照組相比大鼠腦缺血腦組織體積顯著縮小(P<0.01)(圖1)。假手術(shù)組大鼠沒有任何神經(jīng)功能障礙，模型對照組神經(jīng)功能評分為(2.83±0.41)，表示神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重。LXA4組大鼠神經(jīng)功能評分顯著降低，為(1.33±0.21)，明顯低于模型對照組(t=9.753，P<0.01)，表明LXA4組大鼠神經(jīng)功能缺損較輕。

A.假手術(shù)組；B.模型對照組；C.LXA4組；①與模型對照組比較，t=5.411，P<0.01。圖1 3組大鼠腦梗死體積比較A.sham operation group；B.model control group；C.LXA4 group；①Compared with model control group，t=5.411，P<0.01.Fig.1 Comparison of cerebral infarction volume among three groups of

2.2各組大鼠缺血腦皮層Caspase-1(p20)的蛋白表達(dá)變化 Western blotting分析結(jié)果見圖2，模型對照組和LXA4組大鼠缺血腦皮層Caspase-1(p20)蛋白表達(dá)分別較假手術(shù)組明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。但LXA4組與模型對照組相比，LXA4組Caspase-1(p20)表達(dá)明顯降低，與模型對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

A.假手術(shù)組；B.模型對照組；C.LXA4組；①與假手術(shù)組比較，t=11.498，16.228，P<0.01；②與模型對照組比較，t=33.362，P<0.01。圖2 3組大鼠缺血腦皮層Caspase-1(p20)蛋白表達(dá)比較A.sham operation group；B.model control group；C.LXA4 group；①Compared with sham operation group，t=11.498，16.228，P<0.01；②Compared with model control group， t=33.362，P<0.01.Fig.2 Comparison of Caspase-1 (p20) protein expression in ischemic cerebral cortex among three groups of rats

2.3各組大鼠缺血腦皮層Caspase-1活性變化 各組Caspase-1活性結(jié)果見圖3。與假手術(shù)組比較，模型對照組和LXA4組大鼠缺血腦皮層Caspase-1活性明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。但與模型對照組相比，LXA4組Caspase-1活性明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

A.假手術(shù)組；B.模型對照組；C.LXA4組；①與假手術(shù)組比較，t=4.276，5.945，P<0.01；②與模型對照組比較，t=10.291，P<0.01。圖3 3組大鼠缺血腦皮層Caspase-1活性比較A.sham operation group；B.model control group；C.LXA4 group；①Compared with sham operation group，t=4.276，5.945，P<0.01；②Compared with model control group， t=10.291，P<0.01.Fig.3 Comparison of Caspase-1 activity in ischemic cerebral cortex among three groups of

2.4各組大鼠缺血腦皮層IL-1β和IL-18濃度變化 各組大鼠缺血腦皮層IL-1β濃度結(jié)果見圖4，模型對照組和LXA4組大鼠缺血腦皮層IL-1β濃度分別較假手術(shù)組明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。但與模型對照組比較，LXA4組IL-1β濃度明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。各組大鼠缺血腦皮層IL-18濃度結(jié)果見圖4，模型對照組和LXA4組大鼠缺血腦皮層IL-18濃度分別較假手術(shù)組明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型對照組比較，LXA4組IL-18濃度降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

A.假手術(shù)組；B.模型對照組；C.LXA4組；①與假手術(shù)組比較，t=3.707～4.708，P<0.05；②與模型對照組比較，t=12.272，14.151，P<0.05。圖4 3組大鼠缺血腦皮層IL-1β和IL-18濃度比較A.sham operation group；B.model control group；C.LXA4 group；①Compared with sham operation group，t=3.707-4.708，P<0.05；②Compared with model control group， t=12.272，14.151，P<0.05.Fig.4 Comparison of concentration of IL-1β and IL-18 in ischemic cerebral cortex among three groups of rats

3 討論

目前，細(xì)胞死亡的方式主要有凋亡、焦亡和壞死。焦亡是一種新近發(fā)現(xiàn)的程序化、炎癥性細(xì)胞死亡方式，具有Caspase-1依賴性的特點[9]。細(xì)胞焦亡機制可能是Caspase-1介導(dǎo)細(xì)胞膜上形成小孔(直徑1.1～2.4 nm)，進(jìn)而破化細(xì)胞內(nèi)外的離子梯度[特別是鈉離子(Na+)和鉀離子(K+)]，使得細(xì)胞內(nèi)外滲透壓發(fā)生改變，水分子通過水通道蛋白滲透進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、裂解及死亡細(xì)胞。焦亡作為一種新型的炎性相關(guān)的細(xì)胞死亡方式，在缺血性腦卒中等中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷模型中也得到了證實[10]。核苷酸結(jié)合區(qū)和亮氨酸富集區(qū)蛋白(nucleotide-binding domain leucine-rich repeat containing proteins，NLRs)與凋亡相關(guān)的斑點樣蛋白 (apoptosis-associated speck-like protein containing caspase recruitment domain，ASC)以及無活性的pro-caspase-1構(gòu)成炎性體復(fù)合體[4]。炎性體復(fù)合體激活后產(chǎn)生具有活性的Caspase-1，誘發(fā)細(xì)胞焦亡，并釋放IL-1β和IL-18等炎性因子[11]。

NLRs也稱NOD樣受體，包括NLRP1、NLRP3、NLRP6、NLRP7及 NLRP12。研究表明，敲除NLRP3基因能明顯減輕小鼠腦I/R損傷，NLRP3炎性體信號通路與腦I/R損傷密切相關(guān)[12]。NLRP3炎性體主要作用是將pro-caspase-1轉(zhuǎn)化為有活性的Caspase-1。激活后Caspase-1將pro-IL-1β和pro-IL-18裂解成為有活性的炎癥因子IL-1β和IL-18，釋放到細(xì)胞外，觸發(fā)神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞的炎性損傷，導(dǎo)致神經(jīng)及膠質(zhì)細(xì)胞死亡。同時，激活后的Caspase-1，直接誘導(dǎo)Caspase-1依賴的細(xì)胞焦亡，同時也能促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

脂氧素(lipoxins，LXs)是SERHAN等[13]于1984年發(fā)現(xiàn)的花生四烯酸代謝產(chǎn)物，已被證實為體內(nèi)重要的抗炎及促炎癥消退遞質(zhì)，對多種炎癥細(xì)胞和炎癥相關(guān)因子有著顯著的負(fù)性調(diào)節(jié)效應(yīng)[14-17]。2009年SOBRADO等[5]首次在大鼠MCAO模型上觀察到LXA4能減輕腦缺血損傷。也有研究表明LXA4能減輕老齡大鼠海馬神經(jīng)炎癥[18]。筆者以往的研究在大鼠MCAO/R模型上觀察到LXA4能縮小腦梗死體積，減輕神經(jīng)功能缺損、腦水腫及星型膠質(zhì)細(xì)胞損傷，初步機制包括減少炎性遞質(zhì)白三烯的產(chǎn)生[19]。筆者也在大鼠MCAO/R模型上觀察到LXA4能顯著減少NLRP3陽性神經(jīng)元以及顯著下調(diào)NLRP3蛋白表達(dá)[3]。

筆者在以往研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討LXA4對NLRP3炎性體的下游分子Caspase-1的作用，進(jìn)一步揭示LXA4抗腦I/R損傷的機制。所觀察到側(cè)腦室注射LXA4顯著降低MCAO/R模型大鼠腦梗死灶體積和神經(jīng)功能缺失評分，與以往的研究結(jié)果一致[19]。缺血腦皮層周邊區(qū)Caspase-1蛋白表達(dá)和活力明顯增加，炎癥因子IL-1β和IL-18濃度升高，而LXA4能顯著抑制Caspase-1蛋白表達(dá)和活力，降低IL-1β和IL-18濃度。本研究表明LXA4抑制Caspase-1活性是其抗腦缺血-再灌注損傷的機制之一。