呂孝飛，馬君義，郭俊煒，楊立華，任曉霞，雍巧寧，孔維寶，鄧 煜

(1.西北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，蘭州 730070； 2.隴南市經(jīng)濟(jì)林研究院 油橄欖研究所，甘肅 武都 746000)

油橄欖(OleaeuropaeaL.)屬木犀科木犀欖屬常綠喬木，是一種重要的木本油料植物，主要分布于西班牙、意大利、希臘等地中海沿岸的國家[1]。我國自1964年開始引進(jìn)和栽培油橄欖，主要種植于四川、云南和甘肅等干旱和炎熱的山谷地帶，特別是在白龍江、嘉陵江和金沙江流域[2]。1998年，國際油橄欖理事會將甘肅隴南武都劃入世界油橄欖分布圖。目前，武都已成為我國最大的油橄欖種植和加工基地[3]。

橄欖油是一種通過物理冷壓技術(shù)從新鮮油橄欖果實(shí)中提取的植物油，富含均衡的脂肪酸、抗氧化酚類化合物、維生素、色素和揮發(fā)性化合物，被譽(yù)為“飄香的軟黃金”[4]。臨床研究證明，橄欖油中較高比例的單不飽和脂肪酸(MUFA)可降低心血管疾病的風(fēng)險，降低血液中低密度脂蛋白膽固醇水平，而酚類化合物具有降低冠心病風(fēng)險，預(yù)防某些癌癥，抗菌和抗病毒活性等作用[5-7]。橄欖油中的脂肪酸、抗氧化性物質(zhì)(極性酚類化合物和生育酚)、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)和色素的含量受到采收時間、品種、氣候環(huán)境和加工條件的影響[8-9]。目前，國內(nèi)關(guān)于油橄欖的研究主要集中在果實(shí)含油率、橄欖油脂肪酸組成和活性成分分析等方面[10-11]，而基于不同品種和不同果實(shí)成熟度指數(shù)的橄欖油脂肪酸、酚類化合物和風(fēng)味屬性進(jìn)行品質(zhì)分析的研究少有報道。本文以甘肅隴南武都引種栽培的‘城固32號’和‘萊星’2個品種的油橄欖果為研究對象，分析不同品種、不同成熟度指數(shù)對橄欖油脂肪酸、酚類化合物及風(fēng)味屬性的影響，為確定油橄欖果實(shí)的最佳采收時間，揭示油橄欖果實(shí)的品質(zhì)形成，開展橄欖油真?zhèn)舞b別與品牌區(qū)分提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

‘城固32號’(Chenggu 32)和‘萊星’(Leccino)油橄欖果實(shí)，采自甘肅省隴南市油橄欖研究所種質(zhì)資源基因庫(33°24′03″N,104°53′30″E,海拔1 036～1 048 m，年平均降雨量為468 mm，主要集中在6—9月；年氣溫在-7～38.2℃，年平均氣溫15.3℃；年平均相對濕度56.6%，日照時間1 871 h，沙質(zhì)土壤pH為7.9)。油橄欖樹樹齡均為10年，間距為4 m×7 m，每年修剪，在干旱季節(jié)進(jìn)行補(bǔ)充灌溉。于2019年9—11月在5棵樹勢和掛果量基本相同的油橄欖樹冠中部的前后左右4個方位隨機(jī)采摘健康無損的油橄欖果實(shí)，每樣每次2.5 kg，并依國際油橄欖理事會COI/OH/Doc. No. 1/2011計算果實(shí)的成熟度指數(shù)，見表1。

表1 果實(shí)采收時間與相應(yīng)的成熟度指數(shù)

10種脂肪酸甲酯混標(biāo)(C16～C22，美國NU-CHEK-PREP公司)，羥基酪醇(批號MUST-20052802)、酪醇(批號MUST-19111609)、橄欖苦苷(批號MUST-20052502)及木犀草素(批號MUST-19102418)對照品(純度≥98%，成都曼斯特生物科技有限公司)，香草酸對照品(批號5282，純度98.9%，上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司)，木犀草苷對照品(批號20031803，純度98%，北京諾博萊德科技有限公司)，沒食子酸對照品(批號20160925，純度99.9%，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司)，色譜純甲醇(批號20190426016，山東禹王和天下新材料有限公司)，石油醚(沸程30～60℃)、甲醇、碳酸鈉、福林酚、三氯化鋁、氫氧化鈉、無水硫酸鈉等均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Trace 1300 ISQ型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀和UltiMate 3000型高效液相色譜儀(美國Thermo Fisher Scientific)，MC2型Abencor橄欖分析系統(tǒng)(西班牙Ingenieria公司)，UV-2800A型紫外-可見分光光度計(尤尼柯上海儀器有限公司)，PEN 3.5型電子鼻氣體指紋分析儀(德國Airsense公司)。PEN 3.5型電子鼻E-Nose的10種金屬氧化物半導(dǎo)體傳感器及其敏感物質(zhì)見表2。

表2 PEN 3.5型電子鼻的10種傳感器及其敏感物質(zhì)

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 橄欖油的提取

通過MC2型Abencor橄欖分析系統(tǒng)，在錘磨機(jī)中粉碎至少2.5 kg的橄欖果并混勻。稱取750 g樣品到融合罐中，在30℃、50 r/min條件下攪拌融合60 min，之后加入30℃的水30 mL繼續(xù)融合30 min。融合后的樣品置于離心機(jī)中以5 000 r/min離心3 min，再加入30℃的水50 mL，重復(fù)上述步驟兩次，合并提取液，靜置后吸取上層油樣于棕色玻璃瓶中，在4℃存儲備用。平行操作3組。

1.2.2 脂肪酸組成與含量的分析

參考文獻(xiàn)[12]的方法對橄欖油進(jìn)行脂肪酸組成和含量分析。

1.2.3 多酚類化合物的提取與分析

1.2.3.1 多酚類化合物的提取

依國際油橄欖理事會COI/T.20/DOC.29/Rev.1 2017方法進(jìn)行多酚類化合物的提取。

1.2.3.2 多酚類化合物組成和含量的測定

采用UltiMate 3000型高效液相色譜儀和紫外檢測器，在Silversil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)、進(jìn)樣量5 μL、流速1.0 mL/min、等度洗脫條件下測定多酚類化合物組成和含量。

其他測定條件：對于羥基酪醇、酪醇、香草酸及木犀草苷，流動相為30%甲醇+70%體積分?jǐn)?shù)為0.2%的乙酸，柱溫35℃，檢測波長280 nm；對于橄欖苦苷、木犀草素，流動相為50%甲醇+50%體積分?jǐn)?shù)為0.1%的磷酸，柱溫40℃，檢測波長分別為231 nm和351 nm。

1.2.3.3 總酚含量的測定

采用Folin-Ciocalteu顯色法[13]。在10 mL容量瓶中依次加入1 mL不同質(zhì)量濃度的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和0.5 mL福林酚試劑及2 mL 7.5%的Na2CO3溶液，超純水定容，避光反應(yīng)2 h后于765 nm處測定吸光值。以吸光值(X)為橫坐標(biāo)，沒食子酸質(zhì)量濃度(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程Y=7.374 1X-0.005(R=0.999 3)。用多酚化合物提取液代替沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述操作測定吸光值，按照回歸方程計算橄欖油中的總酚含量。

1.2.4 風(fēng)味識別與區(qū)分

取10 mL橄欖油樣品于頂空進(jìn)樣瓶中，30℃下溫育30 min，取瓶內(nèi)頂空氣體進(jìn)行E-Nose檢測，檢測條件為樣品采集70 s，傳感器清洗120 s，調(diào)零5 s，進(jìn)樣準(zhǔn)備5 s，進(jìn)樣流量300 mL/min。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪酸組成與含量

橄欖油中主要脂肪酸含量隨成熟度指數(shù)的變化見圖1。由圖1可知，‘城固32號’和‘萊星’橄欖油的主要脂肪酸為油酸、亞油酸、硬脂酸和亞麻酸，與張東等[14]的研究結(jié)果一致?！枪?2號’和‘萊星’橄欖油中油酸含量最高，分別為59.25%～61.92%和69.13%～72.32%，亞油酸含量分別為15.06%～20.18%和5.68%～7.49%，硬脂酸含量分別為2.03%～2.59%和1.82%～2.13%，亞麻酸含量分別為0.96%～1.50%和0.57%～0.80%。除亞麻酸外，橄欖油樣品其余脂肪酸含量均在GB/T 23347—2009《橄欖油、油橄欖果渣油》規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)。

橄欖油中飽和脂肪酸(SFA)、不飽和脂肪酸(UFA)含量以及單不飽和脂肪酸/多不飽和脂肪酸(MUFA/PUFA)和油酸/亞油酸值隨成熟度指數(shù)的變化見圖2。由圖2可知：隨著成熟度指數(shù)的增大，‘城固32號’和‘萊星’橄欖油中SFA含量分別從20.37%和20.50%降低到17.87%和18.24%，UFA含量分別從80.01%和79.19%升高到81.95%和81.69%；‘城固32號’中MUFA/PUFA值從3.85降低到2.88，而‘萊星’從8.74升高到10.22；‘城固32號’中油酸/亞油酸值從4.09降低到2.94，而‘萊星’從9.49升高到10.70，且‘萊星’MUFA/PUFA和油酸/亞油酸值高于‘城固32號’。

Alowaiesh等[15]研究表明，橄欖油脂肪酸組成及含量受到品種、采收時間等的影響。本研究中‘城固32號’橄欖油的硬脂酸、亞油酸和亞麻酸含量較高，而‘萊星’橄欖油的油酸含量較高。隨著成熟度指數(shù)的增大，‘城固32號’橄欖油中的硬脂酸、油酸、亞麻酸、SFA含量及MUFA/PUFA、油酸/亞油酸值呈降低趨勢，亞油酸和UFA含量呈升高趨勢，而‘萊星’橄欖油中亞油酸、亞麻酸和SFA含量呈降低趨勢，油酸和UFA含量及MUFA/PUFA、油酸/亞油酸值呈升高趨勢，與鐘誠等[16]關(guān)于隴南地區(qū)‘萊星’和‘城固32號’等品種橄欖油脂肪酸組成及含量的研究結(jié)果相似。由圖1可知，‘城固32號’和‘萊星’橄欖油中油酸和亞油酸含量變化趨勢相反，油酸含量的降低和亞油酸含量的升高與油酸去飽和酶的活性有關(guān)，該酶可以將油酸轉(zhuǎn)化為亞油酸[17]。油酸/亞油酸和MUFA/PUFA值不僅是鑒別橄欖油品種的依據(jù)，也是判定橄欖油穩(wěn)定性的一個重要參數(shù)，比值越高說明橄欖油的穩(wěn)定性越好[18]。本研究中，‘萊星’橄欖油較‘城固32號’橄欖油具有更高的油酸/亞油酸和MUFA/PUFA值，據(jù)此比值可鑒別‘萊星’和‘城固32號’橄欖油。同時‘城固32號’橄欖油中油酸/亞油酸和MUFA/PUFA值隨成熟度指數(shù)的增大呈下降趨勢，而‘萊星’橄欖油與之相反，呈上升趨勢，這表明為了提高橄欖油的穩(wěn)定性，有效延長貨架期，‘城固32號’可在較低成熟度指數(shù)時提早采收，而‘萊星’可在較高成熟度指數(shù)時錯峰延后采收。

對不同成熟度指數(shù)的‘城固32號’和‘萊星’橄欖油脂肪酸組成及含量進(jìn)行PCA分析，結(jié)果見圖3。由圖3可知，2個主成分的累積方差貢獻(xiàn)率為73.97%，說明提取的信息能反映原始數(shù)據(jù)大部分信息。得分散點(diǎn)圖的各象限中數(shù)據(jù)點(diǎn)分布越離散其差異越大，越接近其差異越小。‘城固32號’數(shù)據(jù)點(diǎn)分布較離散，說明不同成熟度指數(shù)‘城固32號’橄欖油的脂肪酸組成及含量差異相對較大；而‘萊星’數(shù)據(jù)點(diǎn)分布相對集中，說明不同成熟度指數(shù)‘萊星’橄欖油的脂肪酸組成及含量差異較??；但‘城固32號’和‘萊星’數(shù)據(jù)點(diǎn)并未重合，彼此區(qū)分明顯，表明可以根據(jù)脂肪酸組成和含量有效區(qū)分不同成熟度指數(shù)的‘城固32號’和‘萊星’橄欖油。

注：圖中數(shù)字代表不同的果實(shí)成熟度指數(shù)。下同

2.2 多酚類化合物組成與含量

‘城固32號’和‘萊星’橄欖油中多酚類化合物的組成及含量隨成熟度指數(shù)的變化情況見表3。

表3 橄欖油中多酚類化合物的組成及含量隨成熟度指數(shù)的變化情況

由表3可知，‘城固32號’和‘萊星’橄欖油中，主要多酚類化合物為羥基酪醇、酪醇和橄欖苦苷，而香草酸、木犀草苷和木犀草素的含量相對較低，與其他報道的研究結(jié)果相似[19-20]?！枪?2號’和‘萊星’橄欖油中橄欖苦苷含量分別為0.36～34.96 mg/kg和未檢出～22.63 mg/kg，‘萊星’在成熟度指數(shù)為4.01和4.72時未檢測到橄欖苦苷，可能是果實(shí)含水量導(dǎo)致此時多酚類物質(zhì)的分配不同，Alloggio等[21]的研究也證實(shí)這一點(diǎn)?！枪?2號’和‘萊星’橄欖油中羥基酪醇的含量分別為0.45～3.77 mg/kg和0.24～1.18 mg/kg；酪醇的含量分別為2.84～12.97 mg/kg和1.72～12.39 mg/kg；香草酸的含量分別為0.66～2.63 mg/kg和1.06～1.82 mg/kg；木犀草素與其他酚類化合物相比含量較低，分別為未檢出～1.02 mg/kg和0.10～0.93 mg/kg，‘城固32號’在成熟度指數(shù)為1.53時未檢測到木犀草素；木犀草苷的含量在整個果實(shí)成熟過程中均為0.22 mg/kg左右?！枪?2號’橄欖油中的總酚含量變化范圍為54.66～82.89 mg/kg，而‘萊星’為54.37～90.13 mg/kg。

橄欖油中多酚類化合物不僅可提高其抗氧化活性，也賦予了橄欖油特有的苦味，還會影響橄欖油的風(fēng)味[22]。由表3可知，隨著成熟度指數(shù)的增大，2個品種橄欖油中酪醇含量總體呈減少趨勢，香草酸和木犀草素含量稍有增加，木犀草苷含量保持不變，羥基酪醇含量在‘城固32號’中總體逐漸減少，而在‘萊星’中總體逐漸增加，橄欖苦苷含量則呈現(xiàn)波動性變化。多酚類化合物的含量因油橄欖品種和果實(shí)成熟度指數(shù)的不同而存在差異，且這種差異與遺傳有關(guān)[23]。Baccouri等[24]研究發(fā)現(xiàn)，總酚含量在果實(shí)發(fā)育期逐漸增加直至果實(shí)開始轉(zhuǎn)色，而在果實(shí)成熟階段逐漸減少。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著果實(shí)成熟度指數(shù)的增加，‘城固32號’和‘萊星’橄欖油中總酚含量總體均呈減小趨勢。

對不同品種、不同成熟度指數(shù)的橄欖油多酚類化合物組成及含量進(jìn)行PCA分析，結(jié)果如圖4所示。

圖4 基于多酚類化合物組成及含量的PCA得分散點(diǎn)圖

由圖4可知，2個主成分的累積方差貢獻(xiàn)率為74.69%，說明提取的信息能反映原始數(shù)據(jù)的大部分信息。除成熟度指數(shù)為2.76的‘城固32號’和成熟度指數(shù)為3.50的‘萊星’及成熟度指數(shù)分別為5.01和6.90的‘城固32號’數(shù)據(jù)點(diǎn)存在一定程度的重合外，其余各數(shù)據(jù)點(diǎn)間的離散程度較大，彼此區(qū)分明顯，表明可以根據(jù)多酚類化合物組成及含量區(qū)分不同成熟度指數(shù)的‘城固32號’橄欖油或不同成熟度指數(shù)的‘萊星’橄欖油。

2.3 風(fēng)味屬性

橄欖油風(fēng)味是判定橄欖油感官品質(zhì)的重要依據(jù)，E-Nose的10種金屬氧化物半導(dǎo)體傳感器對橄欖油中風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生的信號雷達(dá)圖如圖5所示。

由圖5可知，‘城固32號’和‘萊星’橄欖油在不同成熟度指數(shù)時的信號響應(yīng)值存在差異，且橄欖油風(fēng)味物質(zhì)的E-Nose信號響應(yīng)值隨油橄欖成熟度指數(shù)的升高而明顯降低，與Kalua等[25]關(guān)于果實(shí)成熟狀態(tài)、品種和化學(xué)成分對橄欖油風(fēng)味影響的研究結(jié)果相似。本研究中W1W、W2W和W5S傳感器在不同成熟度指數(shù)的橄欖油中信號響應(yīng)值最強(qiáng)，表明這3種傳感器對橄欖油頂空氣體的信號響應(yīng)最敏感。而W1S、W1C、W6S、W2S和W3S傳感器信號響應(yīng)值在不同成熟度指數(shù)的橄欖油中較W1W、W2W和W5S傳感器敏感度稍低，也存在部分差異。‘城固32號’和‘萊星’橄欖油在傳感器W1W信號響應(yīng)值范圍分別為2.62～22.79和4.37～10.77，W2W信號響應(yīng)值范圍分別為1.47～5.24和2.16～6.21，W5S信號響應(yīng)值范圍分別為2.99～10.16和4.30～7.74，W1S信號響應(yīng)值范圍分別為1.63～2.61和1.81～2.41，W1C信號響應(yīng)值范圍分別為0.61～0.85和0.75～0.86，W6S信號響應(yīng)值范圍分別為1.03～1.26和1.14～1.33，W2S信號響應(yīng)值范圍分別為1.20～2.01和1.11～1.27，W3S信號響應(yīng)值范圍分別為1.00～1.11和1.02～1.05。W1W信號響應(yīng)值在不同成熟度指數(shù)時的變化較W2W和W5S更為明顯。成熟度指數(shù)為1.53的‘城固32號’橄欖油E-Nose的W1W和W5S信號響應(yīng)值強(qiáng)于成熟度指數(shù)為1.67的‘萊星’橄欖油，這可能歸因于‘城固32號’在此成熟度指數(shù)時含有較高含量的羥基酪醇、酪醇和橄欖苦苷等酚類化合物，與Bendini等[26]有關(guān)不同酚類化合物含量的橄欖油與其感官特性的相關(guān)性研究報道結(jié)果一致。

對‘城固32號’和‘萊星’橄欖油的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行PCA分析，結(jié)果如圖6所示。

圖6 基于風(fēng)味屬性的PCA得分散點(diǎn)圖

由圖6可知，2個主成分的累積方差貢獻(xiàn)率為87.95%，說明提取的信息能反映原始數(shù)據(jù)大部分信息。不同成熟度指數(shù)的‘城固32號’和‘萊星’橄欖油數(shù)據(jù)點(diǎn)分布較離散，彼此區(qū)分明顯。綜合Haddi等[27]利用E-Nose并結(jié)合PCA和LDA分析區(qū)分不同產(chǎn)地橄欖油以及田維芬等[28]基于E-Nose和GC-MS研究不同品牌橄欖油揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的結(jié)果，可以利用風(fēng)味物質(zhì)的E-Nose信號響應(yīng)值差異結(jié)合PCA分析來區(qū)分不同成熟度指數(shù)的‘城固32號’橄欖油或不同成熟度指數(shù)的‘萊星’橄欖油。

3 結(jié) 論

油橄欖品種和成熟度指數(shù)影響橄欖油的脂肪酸、酚類化合物及風(fēng)味屬性?！枪?2號’和‘萊星’橄欖油的主要脂肪酸是油酸、硬脂酸、亞油酸和亞麻酸，其含量隨成熟度指數(shù)發(fā)生變化，除亞麻酸外，其余脂肪酸含量均在GB/T 23347—2009《橄欖油、油橄欖果渣油》規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)。在研究的成熟度指數(shù)范圍內(nèi)，‘萊星’橄欖油較‘城固32號’橄欖油具有更高的MUFA/PUFA和油酸/亞油酸值，其儲運(yùn)穩(wěn)定性更好，貨架期更長。同時，可用油酸/亞油酸和MUFA/PUFA值區(qū)分‘城固32號’和‘萊星’橄欖油。成熟度指數(shù)對橄欖油酚類化合物含量的影響因品種而異，但木犀草苷含量基本不受果實(shí)成熟度指數(shù)的影響。橄欖油風(fēng)味物質(zhì)的E-Nose信號響應(yīng)值隨油橄欖果實(shí)成熟度指數(shù)的升高而明顯降低。利用橄欖油中脂肪酸和酚類化合物的組成與含量以及風(fēng)味屬性的信號響應(yīng)值差異結(jié)合PCA分析可有效鑒別和區(qū)分不同成熟度指數(shù)的‘城固32號’和‘萊星’橄欖油。