方國旭， 張清華， 黃永迎， 王建民， 劉景豐

1 福建醫(yī)科大學(xué)孟超肝膽醫(yī)院 a.肝膽胰外科， b.東南肝膽健康大數(shù)據(jù)研究所， 福州 350025;2 福建醫(yī)科大學(xué) 研究生院， 福州 350108; 3 福建省腫瘤醫(yī)院 a.流行病研究室， b.腫瘤醫(yī)學(xué)創(chuàng)新中心，c.肝膽胰腫瘤外科, 福州 350014

肝細胞癌(HCC)是世界范圍內(nèi)最常見的消化道惡性腫瘤之一。根據(jù)國際癌癥研究機構(gòu)的最新數(shù)據(jù)[1]，每年約有841 080例新發(fā)病例和781 631例死亡病例，HCC在所有惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率中分別排名第7和第3。目前HCC的預(yù)后預(yù)測取決于組織病理學(xué)參數(shù)和腫瘤分期系統(tǒng)。然而,這種傳統(tǒng)的方法均不足以準(zhǔn)確預(yù)測HCC患者的臨床結(jié)果。目前迫切需要改善肝癌患者的早期檢測和預(yù)后,以及幫助臨床醫(yī)生優(yōu)化治療策略[2]。近年來，基因組學(xué)測序技術(shù)及生物信息學(xué)分析已經(jīng)廣泛應(yīng)用于不同類型的腫瘤研究，發(fā)揮越來越大的作用[3]。隨著研究的不斷深入，已經(jīng)產(chǎn)生了多個生物信息數(shù)據(jù)庫。目前常見的公共數(shù)據(jù)庫有 The Cancer Genome Atlas(TCGA)數(shù)據(jù)庫和Gene Expression Omnibus(GEO)數(shù)據(jù)庫。生物信息數(shù)據(jù)庫為研究者們提供了大量的生物學(xué)數(shù)據(jù)[4-5]。研究者可以通過對肝癌組織和癌旁組織中的差異基因進行分析，篩選出與肝癌預(yù)后的相關(guān)特征基因，利用TCGA數(shù)據(jù)庫構(gòu)建風(fēng)險預(yù)測模型，利用GEO數(shù)據(jù)庫驗證模型的有效性。本文主要歸納總結(jié)基于免疫基因特征、代謝基因特征、鐵死亡基因特征、細胞自噬基因特征、m6A RNA甲基化調(diào)控因子構(gòu)建的肝癌風(fēng)險預(yù)測模型，為肝癌的早期檢測、預(yù)后和治療方案的優(yōu)化提供新觀點。

1 基于免疫特征基因的風(fēng)險預(yù)測模型

腫瘤免疫及免疫治療是近年來腫瘤學(xué)及免疫學(xué)研究中受到極大關(guān)注的領(lǐng)域。腫瘤免疫治療，尤其是腫瘤微環(huán)境中免疫細胞的浸潤與免疫檢查點阻斷療法等，在腫瘤治療中取得了令人矚目的效果，為重新審視并發(fā)掘免疫系統(tǒng)在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用提供了極好的機遇[6-7]。Chen等[8]鑒定出9個與肝癌預(yù)后相關(guān)的免疫相關(guān)基因?qū)?immune-related gene pair，IRGP)。結(jié)合臨床特征和病理因素進行多因素分析，發(fā)現(xiàn)基于9個IRGP(CISH_vs_PIAS3、CISH_vs_HSPA14、SOCS2_vs_TYRO3、ACAP1_vs_CD180、MAP3K3_vs_ BTN3A3、TRIB3_vs_RORC、AGER_vs_TYRO3 、SDC4_vs_HSPD1、PLAUR_vs_CD8A)的風(fēng)險評分是一個有效的獨立預(yù)后指標(biāo)。9種IRGP的預(yù)后價值通過森林圖和nomogram列線圖進一步驗證，顯示其預(yù)測準(zhǔn)確率優(yōu)于腫瘤TNM分期和病理分級。Feng等[9]鑒定出17個與肝癌預(yù)后相關(guān)的IRGP。在TCGA隊列和國際癌癥基因組聯(lián)盟隊列中，患者根據(jù)IRGP特征分為高危組與低危組，低危組患者的總生存時間較高?；颊唛L。在結(jié)合臨床特征和病理因素后，多因素分析顯示IRGP特征是一個肝癌預(yù)后的獨立危險因素。ROC曲線驗證了IRGP特征的準(zhǔn)確性。基因集富集分析表明該特征與免疫生物學(xué)過程有關(guān)，不同風(fēng)險患者的免疫微環(huán)境狀態(tài)存在差異?；?7個IRGP的特征可有效評估HCC的總生存期，并預(yù)測免疫檢查點治療反應(yīng)和靶向藥物敏感性。Hu等[10]基于93個免疫相關(guān)基因(immune-related gene，IRG)對肝癌進行分子分型，一共得到5個亞組。這5組患者有不同的預(yù)后、免疫狀態(tài)和免疫檢查點的表達。隨后，在TCGA數(shù)據(jù)庫中，篩選出11個與預(yù)后相關(guān)的IRG(LCN2、S100A10、FABP6、PLXNA1、KITLG、OXTR、S100A1、CCL26、CMTM4、IL1RN、RARG)，并利用國際癌癥基因組聯(lián)盟數(shù)據(jù)庫進行驗證，結(jié)果顯示,低危組與高危組患者免疫細胞浸潤水平存在差異。研究結(jié)果表明，基于IRG的HCC分類有助于解釋HCC的異質(zhì)性，這可能有助于促進HCC的個體化精準(zhǔn)治療。Huang等[11]在TCGA數(shù)據(jù)庫中采用單變量Cox回歸分析、LASSO回歸和多變量Cox回歸鑒定出5個IRG(EZH2、FTL、CFHR3、ISM2、CDK5)?；?個IRG生成風(fēng)險評分。根據(jù)風(fēng)險評分的中位數(shù)進行分層，結(jié)果顯示，風(fēng)險評分高的患者在1、2、3和5年后的總生存率(OS)較低，這一結(jié)果在建模組和驗證組中是一致的。此外，IRG與免疫細胞的浸潤情況相關(guān)。根據(jù)IRG和臨床特征構(gòu)建的風(fēng)險預(yù)測模型，能夠預(yù)測患者1、3和5年的OS，AUC高達0.8。這些結(jié)果表明，用于基于IRG的風(fēng)險預(yù)測模型可用于監(jiān)測治療策略的有效性和預(yù)后預(yù)測。Wang等[12]構(gòu)建基于13個IRG(SPP1、STC2、HSPA8、IL15RA、BLNK、TRAF3、NOD2、GRB2、ACTG1、HDAC1、S100A9、PSMD1、EPO)的風(fēng)險預(yù)測模型，研究顯示，高危組和低危組患者的OS差異與免疫浸潤、腫瘤免疫微環(huán)境和多種信號通路的相互作用有關(guān)。

2 基于能量代謝特征基因的風(fēng)險預(yù)測模型

越來越多的證據(jù)表明，能量代謝重編程在HCC的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用，特別是有氧糖酵解。有氧糖酵解能迅速產(chǎn)生足夠的三磷酸腺苷，滿足腫瘤在缺氧條件下生長和增殖的能量需求，有氧糖酵解在腫瘤的增殖、生長、侵襲和治療中起著重要作用[13-14]。Chen等[15]鑒定出與肝癌預(yù)后相關(guān)的4個糖酵解相關(guān)基因(CDCA8、RAB5IF、SAP30和UCK2)。Wang等[16]鑒定出與肝癌預(yù)后相關(guān)的8個糖酵解相關(guān)基因(PAM、NUP155、GOT2、KDELR3、PKM、NSDHL、ENO1和SRD5A3)。Zhou等[17]鑒定出與肝癌預(yù)后相關(guān)的17個糖酵解相關(guān)基因?qū)?(HMMR_PFKFB1、CHST1_GYS2、MERTK_GYS2、GPC1_GYS2、LDHA_GOT2、IDUA_GNPDA1、IDUA_ME2、IDUA_G6PD、IDUA_GPC1、MPI_GPC1、SDC2_LDHA、PRPS1_PLOD2、GALK1_IER3、MET_PLOD2、GUSB_IGFBP3、IL13RA1_IGFBP3和CYB5A_IGFBP3)?；谏鲜鎏墙徒庀嚓P(guān)基因，構(gòu)建肝癌預(yù)后風(fēng)險預(yù)測模型，KM曲線表明低風(fēng)險組患者的OS比高危組患者OS更長。ROC曲線顯示了該模型具有較好的預(yù)測效果。通過單因素和多因素Cox分析，證明該風(fēng)險評分是一個獨立的預(yù)后因素，與TNM臨床特征結(jié)合，能夠進一步提高模型的預(yù)測準(zhǔn)確性。

脂肪酸合成、β-氧化和細胞脂質(zhì)組成的改變有助于HCC的發(fā)生和發(fā)展[18]。Wang等[19]鑒定出3個具有肝癌預(yù)后價值的脂質(zhì)代謝相關(guān)基因(ME1、MED10、MED22)，并基于該基因計算每個肝癌患者的風(fēng)險評分，結(jié)果顯示，高危組HCC患者的生存率明顯低于低危組患者，多因素Cox回歸分析顯示該風(fēng)險評分是肝癌的獨立預(yù)后因素。此外，這一特征還能對HCC患者的預(yù)后提供高度準(zhǔn)確的預(yù)測。研究結(jié)果闡述了脂質(zhì)代謝和HCC之間的密切聯(lián)系，并促進基于代謝治療HCC的發(fā)展。

氨基酸作為中間代謝物影響脂類、谷胱甘肽、核苷酸、葡萄糖胺和多胺的生物合成，以及細胞增殖和三羧酸循環(huán)碳[20-22]。肝臟是蛋白質(zhì)合成、降解和解毒的重要器官，也是氨基酸代謝的重要器官[23]。Zhao等[24]基于9個氨基酸代謝相關(guān)基因(B3GAT3、B4GALT2、CYB5R3、GNPDA1、GOT2、HEXB、HMGCS2、PLOD2和SEPHS1)構(gòu)建肝癌預(yù)后風(fēng)險預(yù)測模型，根據(jù)風(fēng)險評分將患者分為高危組和低危組，結(jié)果顯示，低危組患者風(fēng)險評分較低，生存時間較長。單因素和多因素Cox回歸證實該評分是HCC的獨立風(fēng)險因素。ROC曲線顯示，該評分可預(yù)測HCC患者1、2、3和5年生存率的AUC分別為0.813、0.770、0.744、0.702 。

3 基于鐵死亡特征基因的風(fēng)險預(yù)測模型

鐵死亡是一種新的鐵依賴細胞死亡形式，其特征是鐵過度積累和脂質(zhì)過氧化，與其他眾所周知的細胞死亡在形態(tài)學(xué)、遺傳學(xué)和生化上均不同。由于肝臟易受氧化損傷，鐵過度積累是大多數(shù)肝臟疾病的主要特征。近年來，鐵死亡在肝臟疾病領(lǐng)域迅速受到關(guān)注[25]。Lian等[26]鑒定出10個鐵死亡相關(guān)基因(SLC7A11、G6PD、CISD1、CARS、SLC1A5、ACACA、ACSL3、NQO1、NFS1、GPX4)，結(jié)果顯示，與低危組相比，高危組患者OS明顯降低。在多因素Cox回歸分析中，該評分是OS的獨立預(yù)測因子。AUC證實了該模型的預(yù)測能力。研究表明，鐵死亡特征基因可以用于HCC的預(yù)后預(yù)測，提示以鐵死亡特征基因為靶點可能是HCC的一種新的治療選擇。Wan等[27]在TCGA隊列中，從70個差異表達的基因(DEG)中鑒定出5個鐵死亡特征基因(G6PD、HMOX1、LOX、SLC7A11、STMN1)，構(gòu)建HCC風(fēng)險預(yù)測模型，Kaplan-Meier 曲線生存分析顯示，低危組的OS顯著高于高危組。來自GSE14520隊列的數(shù)據(jù)證實了這一結(jié)果。KEGG和GO功能富集分析表明，風(fēng)險組間的OS差異與免疫相關(guān)通路密切相關(guān)。進一步分析表明，腫瘤微環(huán)境可能是導(dǎo)致風(fēng)險組間預(yù)后差異的原因。Chen等[28]基于2個鐵死亡相關(guān)mRNA(SLC1A5、SLC7A11)和8個鐵死亡相關(guān)長鏈非編碼RNA(lncRNA)(AC245297.3、MYLK-AS1、NRAV、SREBF2AS1、AL031985.3、ZFPM2-AS1、AC015908.3和MSC-AS1)，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建肝癌風(fēng)險預(yù)測模型，訓(xùn)練組和驗證組的AUC分別為0.830和0.806。決策曲線分析顯示，基于鐵死亡基因的風(fēng)險評分的預(yù)測能力優(yōu)于所有病理特征。多因素Cox回歸分析顯示，基于鐵死亡基因的風(fēng)險評分是一個獨立的預(yù)后因素。通過Kaplan-Meier 曲線，可以明確區(qū)分低、高?；颊叩纳娓怕?。Liang等[29]鑒定出3個與HCC預(yù)后相關(guān)的鐵死亡相關(guān)lncRNA(RHPN1-AS1、 MAPKAPK5AS1、PART1)，結(jié)果顯示，與低風(fēng)險組相比，高危組HCC患者的OS更短。這一特征可作為HCC預(yù)后的獨立預(yù)測因子，并在GEO隊列中得到了驗證。同時，鐵死亡相關(guān)lncRNA評分的預(yù)測準(zhǔn)確性高于基于性別、年齡、年級、分期和病因等評分的工具。這一特征與免疫細胞浸潤(如巨噬細胞、髓樣樹突狀細胞和中性粒細胞等)和免疫檢查點(PD-1、CTLA-4和TIM-3)有關(guān)。Xu等[30]基于9個鐵死亡相關(guān)lncRNA (CTD-2033A16.3、CTD-2116N20.1、CTD-2510F5.4、DDX11-AS1、LINC00942、LINC01224、LINC01231、LINC01508和ZFPM2-AS1)構(gòu)建肝癌的風(fēng)險預(yù)測模型，基因集富集分析表明，這些lncRNA介導(dǎo)的信號通路可能通過干擾腫瘤壞死因子a/核因子κB、IL-2/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子和轉(zhuǎn)錄激活因子5、細胞因子/細胞因子受體調(diào)控肝癌免疫微環(huán)境。Spearman相關(guān)分析表明，靜息記憶CD4+T淋巴細胞、卵泡輔助T淋巴細胞、調(diào)節(jié)性T淋巴細胞、M0巨噬細胞等浸潤性免疫細胞亞型在高危組和低風(fēng)險組之間存在顯著差異。研究結(jié)果為肝癌中與鐵死亡相關(guān)的lncRNA提供了一個有前景的見解，并為患者的預(yù)后和免疫治療提供了一個個性化的預(yù)測工具。

4 基于細胞自噬特征基因的風(fēng)險預(yù)測模型

細胞自噬是真核生物中進化保守的對細胞內(nèi)物質(zhì)進行周轉(zhuǎn)的重要過程。該過程中一些損壞的蛋白或細胞器被雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小泡包裹后，送入溶酶體或液泡中進行降解并得以循環(huán)利用。在腫瘤中，自噬可能在腫瘤發(fā)生的早期階段發(fā)揮抑制作用。然而，越來越多的證據(jù)[31-32]表明，在已經(jīng)形成的腫瘤中，自噬可以幫助應(yīng)對細胞內(nèi)環(huán)境壓力的變化，如缺氧、營養(yǎng)缺乏等惡習(xí)環(huán)境，從而促進腫瘤的存活。Huo等[33]在HCC患者中共發(fā)現(xiàn)62個差異表達的自噬相關(guān)基因(autophagy-related gene，ARG)。單因素和多因素回歸確定了5種與肝癌患者OS相關(guān)的ARG(HDAC1、RHEB、ATIC、SPNS1和SQSTM1)。重要的是，基于ARG的風(fēng)險評分是肝癌預(yù)后的獨立風(fēng)險因素。此外，預(yù)后風(fēng)險模型的AUC為0.747，表明該模型在預(yù)測HCC預(yù)后方面具有較高的準(zhǔn)確性。有趣的是，在HCC細胞系中，風(fēng)險相關(guān)的ARG與化療藥物敏感性相關(guān)。Yang等[34]共鑒定出27個差異表達ARG，通過Cox回歸和LASSO回歸分析，鑒定出3種OS相關(guān)ARG (SQSTM1、HSPB8和BIRC5)?；谶@3種ARG建立預(yù)后預(yù)測模型，在TCGA隊列和GEO驗證隊列中，風(fēng)險評分高的HCC患者預(yù)后較差，風(fēng)險評分曲線的AUC分別為0.756和0.672。此外，校正曲線和C指數(shù)表明，基于ARG的風(fēng)險預(yù)測模型的預(yù)測能力較好,可能是預(yù)測HCC患者預(yù)后的一種有前景的工具。Cao等[35]鑒定出與細胞自噬相關(guān)的13個基因?qū)?PRKCD/TP53、BAX/GABARAPL1、ATIC/PARP1、CDKN2A/ERBB2、BIRC6/FOXO1、BAK1/DAPK1、PINK1/RAB24、GDAC6/HGS、CX3CL1/HSPB8、DLC1/HSPB8、APOL1/EIF4EBP1、ARNT/HIF1A、CX3CL1/NPC1)。Kaplan-Meier曲線分析表明，高危組患者的OS明顯差于低危組，并發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)的風(fēng)險評分與免疫細胞的浸潤有關(guān)。Wu等[36]篩選出78個差異表達的自噬相關(guān)lncRNA，并使用4個與肝癌預(yù)后相關(guān)lncRNA(LUCAT1、AC099850.3、ZFPM2-AS1和AC009005.1)建立預(yù)后模型，可作為HCC患者的獨立預(yù)后因素，并且1、3、5年生存率的預(yù)測效率高于其他臨床病理因素(AUC分別為0.764、0.738、0.717)。此外，生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，LUCAT1和ZFPM2-AS1可能分別通過HSA-Mir-495-3p/DLC1和HSA-Mir-515-5P/DAPK2軸影響HCC的自噬活性。 Yang等[37]篩選出7個自噬相關(guān)lncRNA(PRRT3-AS1、RP11-479G22.8、RP11-73M18.8、LINC01138、CTD-2510F5.4、CTC-297N7.9、RP11-324I22.4)，Kaplan-Meier分析表明，風(fēng)險評分低的患者預(yù)后明顯優(yōu)于風(fēng)險評分高的患者 ,該風(fēng)險評分的預(yù)后預(yù)測準(zhǔn)確度(AUC=0.786)顯著高于ALBI, Child-Pugh, AFP和AJCC_stage。

5 基于N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine, m6A)RNA甲基化調(diào)控因子的風(fēng)險預(yù)測模型

表觀遺傳是研究基因的核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下，基因表達的可遺傳變化。甲基化修飾占所有RNA修飾的60%以上，而m6A是信使RNA、microRNA和長鏈非編碼RNA中最常見的內(nèi)部修飾，在轉(zhuǎn)錄、加工和代謝中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。m6A修飾與腫瘤增殖、分化、腫瘤發(fā)生、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)，在惡性腫瘤中起癌基因或抑癌基因的作用[38]。Zhang等[39]基于13個 m6A RNA甲基化調(diào)控因子的表達水平，通過共識聚類分析，識別出兩個亞群(聚類1和2)。與聚類1相比，聚類2預(yù)后較差，且與較高的組織學(xué)分級和病理分期顯著相關(guān)。此外，聚類2在癌癥相關(guān)通路中顯著富集。研究人員進一步構(gòu)建基于5個m6A RNA甲基化調(diào)控因子(ZC3H13、KIAA1429、METTL3、YTHDF1、YTHDF2)的肝癌預(yù)后風(fēng)險預(yù)測模型，并在GEO數(shù)據(jù)集中得到成功驗證。最后，建立了基于年齡、性別、組織學(xué)分級、病理分期和風(fēng)險評分的綜合預(yù)測模型，能夠提高模型的預(yù)測能力。Xu等[40]篩選出19個m6A調(diào)控因子，根據(jù)m6A調(diào)控因子的共識聚類，被分為2組(聚類1和聚類2)。研究發(fā)現(xiàn)m6A調(diào)控因子在聚類1中表達上調(diào)。與聚類2相比，聚類1與較高的程序性死亡配體1表達水平、較低的免疫評分、較差的預(yù)后和免疫細胞浸潤有關(guān)?；趩巫兞緾ox和LASSO回歸分析，識別出5個m6A調(diào)控因子(WTAP、METTL3、HNRNPC、YTHDF1、YTHDF2)，研究發(fā)現(xiàn)高危組與較高的程序性死亡配體1表達水平、較高的分級和較差的OS密切相關(guān)。在訓(xùn)練數(shù)據(jù)集中，1、3、5年的AUC分別達到0.77、0.67和0.68。在驗證數(shù)據(jù)集中，1、3、5年的AUC分別為0.7、0.63和0.55。基因集富集分析顯示MTOR信號通路和WNT信號通路與聚類1和高危組相關(guān)。

綜上所述，研究表明m6A調(diào)控因子與HCC的腫瘤免疫微環(huán)境顯著相關(guān)。基于m6A調(diào)控因子的風(fēng)險評分可以預(yù)測HCC患者的預(yù)后，為提高免疫治療療效提供新的治療靶點。

6 小結(jié)

TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫相關(guān)研究尚有一定的局限性。首先，這些研究僅僅是回顧性研究，缺乏前瞻性研究。第二，目前大多數(shù)研究基于免疫基因特征基因、代謝基因特征基因、鐵死亡基因特征基因、細胞自噬基因特征基因、m6A RNA甲基化調(diào)控因子等方面，還有很多在HCC中起重要作用的預(yù)后基因尚有待進一步挖掘。第三，目前篩選出的基因缺乏基礎(chǔ)實驗的進一步驗證。因此，有必要進一步探索更多的肝癌早期檢測分子標(biāo)志物和影響肝癌預(yù)后的分子標(biāo)志物，以提高早期肝癌檢測率和鑒別出肝癌預(yù)后高危人群；有必要進一步開展嚴格的前瞻性和多中心臨床試驗，驗證風(fēng)險預(yù)測模型的準(zhǔn)確性和有效性；有必要進一步通過基礎(chǔ)實驗對篩選出的分子標(biāo)志物進行驗證，尋找肝癌的潛在治療靶點。目前，處于大數(shù)據(jù)快速發(fā)展的時代，對大數(shù)據(jù)進行挖掘和分析有助于探索重要的生物學(xué)規(guī)律。因此，生物信息學(xué)對于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)的發(fā)展極其重要，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用前景。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：方國旭負責(zé)撰寫論文；張清華、黃永迎和王建民負責(zé)修改論文；劉景豐負責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。